Whole-Mount Immunofluorescentie kleuring, confocale beeldvorming en 3D-reconstructie van de sinoatriale en atrioventriculaire knoop in de muis
22 december 2020
We bieden een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten.
Dit protocol legt de noodzakelijke stappen uit om micro dissectie whole-mount immunofluorescence kleuring en microscopie uit te voeren, specifiek voor de sinus knoop en AV-knoop in de muis. De whole-mount methodologie is voordelig voor het bepalen van de exacte 3D lokalisatie en morfologie van de sinus en AV-knoop en om de relatie met het omringende weefsel te onderzoeken. De weefselmorfologie wordt aanzienlijk behouden met slechts minimale weefseldehydratie en fysieke breuk.
Om te beginnen, prik het hart met een 27 gauge naald in het gebied van de apex door voorzichtig de naald in de linker ventrikel te duwen en voorzichtig vijf tot 10 milliliter ijskoud PBS te injecteren om het hart te profuseren. Til het hart voorzichtig op met een pincet en snijd de grote vaten door om het hart te verwijderen. Leg het hart in een dissectieschaal gevuld met ijskoud PBS onder de dissectiemicroscoop.
Na bepaling van de oriëntatie van het hart draai het hart om zodat de voorkant van het hart op de bodem van de schaal ligt. Immobiliseer het hart door kleine spelden door de apex en het atriale aanhangsel in de agarose op de bodem van de dissectieschaal te steken. Gebruik fijne pincetten en schaar om voorzichtig het niet-cardiale weefsel rond de superieure en inferieure vena cava te verwijderen.
Om het intercavale gebied bloot te leggen, verwijder het grootste deel van de ventrikels door parallel aan de groef tussen de ventrikels en de atria te snijden met een micro schaar. Voor fixatie en dehydratie plaats het monster in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, breng het hart over naar 15% sucroseoplossing en incubeer het gedurende 24 uur bij vier graden Celsius.
Na de incubatie breng het hart over naar 30% sucroseoplossing voor nog eens 24 uur bij vier graden Celsius. Was het hart in 1% Triton X-100 verdund in PBS. Blokkeer en permeabiliseer het vervolgens in blokkeringsoplossing gedurende de nacht bij vier graden Celsius.
Plaats het hart in een 1,5 milliliter buis en incubeer het met konijn anti-muis Connexin 43 en rat anti-muis HTN4 antilichamen verdund met blokkeringsoplossing gedurende zeven dagen bij vier graden Celsius. Na zeven dagen, verwijder de oplossing met primaire antilichamen met behulp van een pipet. Was het hart met 1% Triton X-100 oplossing drie keer gedurende een uur per wasbeurt op de orbitale shaker.
Herhaal de wasstappen na de incubatie met secundaire antilichamen en DAPI. Na het voorbereiden van plastic ringen en het vullen met plasticine, plaats het hart in de plasticinegroef met de achterkant van het hart naar boven. Identificeer de SAN, die zich op de dorsale zijde van het hart bevindt met het intercavale gebied.
Voeg PBS toe aan het hart om alle lucht in de holte te verplaatsen totdat het hart volledig bedekt is met PBS. Breng siliconen aan op de randen van de plastic ring. Druk voorzichtig de omliggende deel van het monster in de plasticine om het hart te fixeren en bedek het hart met een dekglas.
Druk vervolgens voorzichtig op de achterkant van de plasticine om wat van de PBS eruit te persen en bevestig het hart aan het dekglas, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het beeldgebied komen. Plaats de whole-mount kleuringsmonsters ondersteboven op de platform van de confocale microscoop en ga verder met beeldvorming zoals beschreven in het tekstmanuscript. De parameters voor elke kanaal van de confocale microscoop worden ingesteld met behulp van de respectieve software.
Dit protocol werd gebruikt om confocale microscopie beeldvorming uit te voeren van zowel de sinoatriale knoop als de atrioventriculaire knoop in muisharten. Specifieke kleuring van het geleidingssysteem en werkende myocardium met fluorescente antilichamen, die zich richten op HCN4 en Connexin 43 respectievelijk, maakt het mogelijk om de sinoatriale knoop en de atrioventriculaire knoop binnen de intacte anatomie te identificeren. Dit whole-mount kleuringsprotocol maakt het mogelijk om de interactie van verschillende celtypen te bestuderen door het gebruik van verschillende antilichamen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de stappen voor whole-mount immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en de atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten. De methodologie maakt een nauwkeurige 3D-lokalisatie en morfologisch onderzoek van deze cardiale structuren mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Cardiovasculaire biologie
- Immunofluorescentietechnieken
Achtergrond
- De sinoatriale knoop (SAN) en de atrioventriculaire knoop (AVN) zijn essentieel voor de hartfunctie.
- Whole-mount immunofluorescentie biedt inzicht in de morfologie van deze knopen.
- Deze techniek behoudt de weefselmorfologie met minimale dehydratatie.
- Inzicht in de relatie tussen deze knopen en het omringende weefsel is essentieel voor hartonderzoek.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het kleuren van de SAN en AVN in muizenharten.
- Om de studie naar de 3D-lokalisatie van cardiale knopen te faciliteren.
- Om het begrip van interacties in cardiaal weefsel te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Microdissectie van muizenharten.
- Whole-mount immunofluorescentiekleuring.
- Microscopie voor visualisatie van gekleurde weefsels.
- Gebruik van ijskoud PBS voor weefselconservering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kleuring van de SAN en AVN in muizenharten.
- Waargenomen behoud van de weefselmorfologie.
- Heldere visualisatie van de 3D-lokalisatie bereikt.
- Verbeterd inzicht in de relaties van de cardiale knopen met het omliggende weefsel.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van de SAN en AVN bij muizen.
- Whole-mount immunofluorescentie is een waardevolle techniek in het cardiaal onderzoek.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze methodologie voor diepere inzichten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Hoge-resolutie 3D-visualisatie van de sinoatriale en atrioventriculaire knopen in muismodellen vult een kritisch gat in het onderzoek naar cardiale elektrofysiologie, waardoor nauwkeurige anatomische en cellulaire mapping mogelijk wordt. Deze capaciteit vergroot het voorspellende vertrouwen bij de vroege validatie van targets voor aritmie-mechanismen en ondersteunt de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische cardiale studies. Het behoud van de weefselintegriteit en de mogelijkheid tot gemultiplexte celtype-analyse positioneren deze workflow als een herbruikbaar hulpmiddel voor cardiovasculaire R&D-portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt gedetailleerde analyse van pacemaker- en geleidingssysteemcelpopulaties in situ mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het verduidelijken van structuur-functie-relaties van de nodi.
- Faciliteert een zekere identificatie van ziekterelevante targets bij aritmogenese.
- Biedt anatomische context voor functionele studies en hypothesetoetsing.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt intacte, gevalideerde systemen van hartweefsel voor voor downstream imaging- en analyseworkflows.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve immunofluorescentie-resultaten voor nodale en myocardiale markers.
- Maakt gemultiplexte antilichaamlabeling mogelijk om meerdere celtypen binnen hetzelfde monster te beoordelen.
- Ondersteunt assay-standaardisatie en schaalbaarheid voor vergelijkende studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt 3D-anatomische gegevens uit met ziekterelevante preklinische modellen van cardiale geleidingsstoornissen.
- Handhaaft continuïteit van moleculaire ontdekking tot validatie op weefselniveau.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaat-targets mogelijk op basis van structureel en cellulair bewijs.
- Ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers door het in kaart brengen van interacties tussen nodale cellen en niet-myocyten.
Integratie van pijplijn en workflow
Deze workflow voor whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming slaat een brug tussen vroege ontdekking, doelwitvalidatie en preklinisch cardiaal onderzoek door hoogwaardige, kwantitatieve anatomische gegevens te leveren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en de verduidelijking van pathways in onderzoek naar cardiale geleiding.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve immunofluorescentie-uitlezingen voor de identificatie van knopen.
- Analytica: Maakt 3D-reconstructie en vergelijkende analyse van nodale en myocardiale regio's mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Biedt anatomische en cellulaire continuïteit voor preklinische aritmie-modellen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een gestandaardiseerd beeldvormings- en analyseplatform voor cardiovasculaire R&D-teams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van cardiale targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert de weefselpreparatie en beeldvorming voor reproduceerbare, schaalbare resultaten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie in cardiale ontdekkingsprogramma's.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en modellen voor het geleidingssysteem mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in cardiale dissectie, immunofluorescentie en confocale microscopie.
- Vereist toegang tot geavanceerde imagingplatforms en software voor beeldanalyse.
- Maakt standaardisatie van weefselverwerking en antilichaamprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende cardiale modellen of soorten.
- Steekproefgrootte en antilichaampenetratie kunnen de doorvoersnelheid voor grootschalige studies beperken.
