Name: Onderzoek naar aortaklepverkalking via isolatie en kweek van T-lymfocyten met behulp van feedercellen van bestraalde buffy coat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Leer T-lymfocyten isoleren en klonen uit verkalkte aortaklepweefsel met behulp van bestraalde buffy coat-feedercellen. Deze methode maakt fenotypische analyse mogelijk om de rol van adaptieve immuniteit in calcificerende aortaklepverkalking te onderzoeken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle buffy jaszakken die voor dit protocol werden gebruikt, werden bestraald dankzij de beschikbaarheid van Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer en het hele team van de afdeling Radiologie van Charité Benjamin Franklin. Beurshouder / Mary Roxana Christopher, dit werk wordt ondersteund door een beurs van de German Cardiac Society (DGK).

De studie werd uitgevoerd volgens het Statuut van de Charité voor het waarborgen van goede wetenschappelijke praktijken en de wettelijke richtlijnen en bepalingen inzake privacy en ethiek werden gerespecteerd. De ethische commissie keurde alle menselijke experimenten goed en de privacy en anonimiteit van de patiënten werden gehandhaafd in overeenstemming met de regels die op het ethische formulier werden gerapporteerd.
OPMERKING: Voor het hieronder beschreven protocol werden verse menselijke stenotische klepmonsters gebruikt.
1. Reagensvoorbereiding
<ol><li>Bereid het verrijkte RPMI complete medium door rpmi 1640 medium toe te voegen: niet-essentiële aminozuren; Natriumpyruvaat, L-glutamine, ß-mercaptoethanol en penicilline-streptomycine (Pen/Strep). Filter het voor gebruik. Bewaren bij +4 °C en binnen twee maanden gebruiken.</li>
	<li>Bereid het celkweekmedium (CCM) voor op de kloonfase met behulp van het verrijkte RPMI 1640 complete medium met warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), HB-basaal medium, 50 U interleukine 2 (IL-2) en menselijk serum (HS). Filter en gebruik het binnen de dag. Niet bewaren.</li>
	<li>Bereid het celkweekmedium voor op de hervoedingsfase met behulp van het verrijkte RPMI 1640 complete medium met toegevoegde FBS, HB basaal medium, 30 U IL-2 en HS. Filter en gebruik het binnen de dag. Niet bewaren.</li>
	<li>Bereid de wasbuffer voor met 250 ml RPMI en 5 ml pen/streptokokken. Bewaren bij +4 °C, binnen twee maanden gebruiken.</li>
</ol>2. Menselijke T-lymfocytenisolatie en -kweek in T-25-kolven
<ol><li>Plaats het stenotische klepmonster in een steriele petrischaal gevuld met wasbuffer en zorg ervoor dat het volledige klepmonster ermee bedekt is. Laat 15 minuten staan.</li>
	<li>Snijd de stenotische klep in kleine stukjes met behulp van een scalpel en laat het opnieuw 10 minuten staan.</li>
	<li>Bereid het celkweekmedium voor met 50 U IL-2, zoals eerder beschreven, en filter het.</li>
	<li>Voeg de CCM toe in de T25-kolven en plaats met behulp van een steriele plastic tang de klepstukken in de kolven.</li>
	<li>Bewaar de kolven gedurende één week in een verticale positie in een CO2-incubator en let erop dat de status van de kolf onder de microscoop wordt geobserveerd. T-celklonen moeten ongeveer drie dagen na de kweekstap zichtbaar zijn; voor een betere waarneming is het raadzaam om de kolven gedurende 20 minuten vóór de microscopische analyse in horizontale positie te plaatsen. OPMERKING: De hoeveelheid celkweekmedium is afhankelijk van de hoeveelheid monster die aanwezig is en van het aantal T25-kolven dat zal worden gebruikt. Aangezien elk stuk klep 10 ml CCM in een kolf vereist, is 25 ml CCM in een T25-kolf geschikt voor 3 stuks klep.</li>
</ol>3. Kloonfase
OPMERKING: Voor de kloonfase van T-cellen is het noodzakelijk om te beginnen met de isolatie van feedercellen uit een bestraalde buffy coat (BC), volgens het PBMC-protocol.
<ol><li>Open de BC-zak onder de laminaire stroomkap met behulp van de zakpen met naaldvrije klep en breng 50 ml bloed over in een T150-kolf. Voeg 70 ml PBS toe om het bloed in de kolf te verdunnen.</li>
	<li>Neem vier conische buizen van 50 ml en plaats er 20 ml dichtheidsgradiëntmedium in en leg er voorzichtig 30 ml bloed overheen.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 25 minuten bij 800 x g en 20 °C met de rem uit.</li>
	<li>Zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg als afval. Verzamel de PBMC-ring in een nieuwe conische buis van 50 ml en voeg in de PBS-oplossing toe tot een volume van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet door het in de PBS-oplossing toe te voegen tot een volume van 50 ml. Herhaal de centrifugatiefase gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en suspensie de FCs in 10 ml celkweekmedium.</li>
	<li>Neem een nieuwe opvangbuis en verdun de FCs met PBS 1:10 door 9,9 ml PBS en 100 μL uit de buis toe te voegen met FCs en celkweekmedium. Spoel goed af met een pipet en neem 7 μL uit deze verdunning en tel de cellen onder de microscoop.</li>
	<li>Bereid het celkweekmedium voor op de kloonfase: 70 ml met 50 U IL-2 en verdeel het vervolgens in twee conische buizen van 50 ml, elke buis bevat 25 ml celkweekmedium, zoals hieronder beschreven:<ul style="list-style-type: disc;">
<li>Buis 1: 25 ml CCM + FCs + 0,6% fytohemagglutinine (PHA)</li>
		<li>Buis 2: 25 ml CCM + T-lymfocyten OPMERKING: Het doel van de PMBC-methode is om 2 x 106 cellen voor elke ml te verkrijgen, dus de 25 ml CCM-bereide (buis 1) moet dienovereenkomstig worden berekend. De gebruikte algemene formule is: Aantal getelde cellen x 106: 1 ml = CCM x 106: X</li>
	</ul>
</li>
</ol>4. T Lymfocyten cultuur in multiwell platen
<ol><li>Verzamel met behulp van de elektronische pipet al het celkweekmedium in de kolven en breng het over in een conische buis van 50 ml. De lege kolven kunnen worden weggegooid.</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg, suspensuspensie de pellet in 50 ml PBS en verzamel de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C. Herhaal deze stap twee keer.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet in 1 ml CCM. Neem 7 μL van deze verdunning en tel de cellen onder de microscoop. OPMERKING: Het aantal getelde cellen moet worden vermenigvuldigd voor het volume van de kamer en voor de toegepaste verdunning.</li>
	<li>Ga verder met het verdunnen van de cellen geteld van 105 tot 103 in celkweekmedium en neem vervolgens 500 μL van 103 en plaats het in de buis 2.</li>
	<li>Giet het 25 ml celkweekmedium van buis 1 in een plastic petrischaaltje van 100 mm x 15 mm.</li>
	<li>Neem vier 96-U bottom multiwell platen en gebruik een meerkanaals pipet ingesteld op 100 μL zaad FCs in elke put.</li>
	<li>Neem de Tube 2 en giet het celkweekmedium in een petrischaaltje. Met behulp van een meerkanaalspipet ingesteld op 100 μL, zaad T-cellen in elke put.</li>
	<li>Bewaar de multiwell-platen gedurende een week in een CO2-incubator .</li>
</ol>5. Eerste refeeding fase
<ol><li>Gebruik een bestraalde buffy coat-zak om de PBMC-methode te gebruiken om VC's te verkrijgen zoals beschreven in de vorige methode.</li>
	<li>Bereid de geschikte hoeveelheid CCM voor zonder PHA en filtreer deze.</li>
	<li>Verwijder met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL uit elke put en zorg ervoor dat u de bodem van de put niet raakt.</li>
	<li>Voeg 100 μL VC's toe in alle putten als voedingslaag om celkweekvoedingsstoffen te leveren en het medium te veranderen. OPMERKING: Voor elke multiwell wordt geadviseerd om 6 ml CCM te overwegen, dus de aanbevolen hoeveelheid voor 4 multiwells is ongeveer 30 ml. PHA (0,4% van de totale CCM-hoeveelheid) moet eens in de twee weken aan de CCM worden toegevoegd.</li>
</ol>6. Tweede hervoedingsfase
<ol><li>Herhaal de hervoedingsfase na de hierboven beschreven passage. 0,4% PHA moet worden toegevoegd aan het celkweekmedium.</li>
</ol>7. Eerste splijtfase van 1 put/monster naar 2 putten/monster
<ol><li>Controleer alle vier de multiwells onder de microscoop en ga je gang met het splitsen van die putten met T-celklonen (TCC's).</li>
	<li>Volg het PBMC-protocol om feedercellen te isoleren uit een bestraalde buffy coat-zak.</li>
	<li>Bereid het celkweekmedium voor met 30 U IL-2. Voeg de FCs toe en neem een nieuwe 96-well multiwell plaat met U bodem.</li>
	<li>Gebruik een pipet van 100 μL, spoel goed in de putten van de geselecteerde monsters en verdeel de 200 μL volume in elke put in 2 nieuwe putten van de nieuwe multiwellplaat, om 100 μL volume te hebben voor elk van de nieuwe 2 putten.</li>
	<li>Voeg 100 μL FCs toe in alle nieuwe putten. Elke put moet een totaal volume van 200 μL bevatten.</li>
	<li>Stel de pipet in op 100 μL en voeg 100 μL toe in nog eens twee putten, die alleen FCs bevatten om als controle te dienen. OPMERKING: Gebruik lichtmicroscopie om alle multiwell-platen te observeren om te bepalen welke putten met succes TCC hebben gekweekt. Om de selectie van klonen gemakkelijker te maken, kan een vergelijking worden gemaakt met de besturing (de twee putten bevatten alleen FCs), waarbij de kloon donkerder en groter lijkt in vergelijking met de besturing. De te selecteren putten zijn die met een grote, heldere, ronde kloon, met lymfocyten dicht op elkaar gepakt. Als er na twee weken refeeding geen TCC's aanwezig zijn, is het raadzaam om nog een week te wachten en een extra refeedingfase uit te voeren.</li>
</ol>8. Tweede splitsingsfase van 2 putten/monster naar 4 putten/monster
<ol><li>Stel de pipet in op 100 μL, spoel goed in de twee putjes van elk monster en zaai twee nieuwe putjes van 100 μL voor elk.</li>
	<li>Bereid het celkweekmedium voor met 30 U IL-2 en volg de PBMC-techniek om de FCs uit de buffy coat-zak te extraheren en de FCs in de CCM te plaatsen.</li>
	<li>Zet de pipet op 100 μL en zaai de FCs in alle putjes. Bewaar de multiwells een week in een CO2-incubator .</li>
</ol>9. Derde splitsingsfase van 4 putten/monster naar 8 putten/monster:
<ol><li>Gebruik een meerkanaalspipet van 100 μL, spoel goed in alle vier de putten van elk monster en zaai 100 μL in elk van de vier nieuwe putten in een nieuwe 96-putplaat.</li>
	<li>Bereid het celkweekmedium voor en volg de PBMC-techniek om de FCs uit een bestraalde buffy coat-zak te extraheren.</li>
	<li>Plaats de VC's in de CCM. Zet de pipet op 100 μL en zaai de FCs in alle putjes. Bewaar de multiwells een week in een CO2-incubator</li>
</ol>10. Cytofluorimetrische analyse
<ol><li>Neem de multiwellplaat met de oudste datum uit de CO2-incubator en identificeer de verzamelbuizen met de monsternummers om te analyseren.</li>
	<li>Gebruik een meerkanaalspipet van 200 μL met 2 tips om twee putten van hetzelfde monster grondig te spoelen en beide in dezelfde opvangbuis te plaatsen. Herhaal deze stap voor alle voorbeelden. OPMERKING: De FCs-monsters worden niet geanalyseerd, omdat ze alleen als controles dienen.</li>
</ol>11. Antilichaamkleuringspanel Voorbereiding voor cytofluorimetrische analyse
<ol><li>Voeg 1 ml PBS-oplossing toe voor elke buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.</li>
	<li>Gooi na de centrifugatiefase het supernatant weg. OPMERKING: Het antilichaamkleuringspaneel is te vinden in tabel 1. Elke berekende antilichaamconcentratie is ongeveer 2 μL/monster. Het wordt aanbevolen om de antilichaambuizen kort te draaien voor gebruik. Om de fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen licht te beschermen, moeten alle stappen in het donker worden uitgevoerd.</li>
	<li>Bereid het antilichaammengsel in een buis van 1,5 ml en vortex het.</li>
	<li>Voeg de antilichamen in de monsters toe en laat de monsters gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Voeg 1 ml PBS toe aan elk monster en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet met 500 μL PBS-oplossing.</li>
	<li>Ga verder met de cytofluorimetrische analyse (FACS-analyse, tabel 1). OPMERKING: De gekleurde monsters kunnen worden gefixeerd met behulp van 0,5% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS-oplossing en tot 15 dagen later geanalyseerd. LET OP: PFA is giftig en moet zorgvuldig worden behandeld.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Marker</td>
			<td>Fluorofoor</td>
		</tr>
<tr>
<td>cd3</td>
			<td>PE/Cy7</td>
		</tr>
<tr>
<td>cd4</td>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
<tr>
<td>cd8</td>
			<td>Briljant violet 510</td>
		</tr>
<tr>
<td>cd14</td>
			<td>Briljant violet 421</td>
		</tr>
<tr>
<td>cd25</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
<tr>
<td>cd45</td>
			<td>Briljant violet 711</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Antilichaamkleuringspaneel om de T-lymfocytenpopulatie te detecteren bij verkalkingsaortaklepziekte.

<ol><li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+valvular+heart+diseases%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li>
<li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aortic+valve+calcification%2C+as+measured+by+MDCT%2C+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis%3A+results+of+an+international+registry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li>
<li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+outcome+in+severe%2C+asymptomatic+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li>
<li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis%3A+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement%3A+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li>
<li>Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+History+of+Transcatheter+Aortic+Valve+Implantation+%28TAVI%29-A+Personal+View+Over+25+Years+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Revascularization+Medicine%22%5BJournal%5D)">The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).</li>
<li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAVI+for+low-flow%2C+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction%3A+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+%28GARY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Intervention+Journal%22%5BJournal%5D)">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li>
<li>Mirna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-biomarker+analysis+in+patients+after+transcatheter+aortic+valve+implantation+%28TAVI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers%22%5BJournal%5D)">Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI).</a> Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).</li>
<li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcatheter+aortic+valve+replacement+for+pure+aortic+valve+regurgitation%3A+%22on-label%22+versus+%22off-label%22+use+of+TAVR+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).</li>
<li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcatheter+valve-in-valve+implantation+%28VinV-TAVR%29+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li>
<li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+Adaptive+Immunity+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 851945(2015).</li>
<li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+Aortic+Valve+Disease%3A+Molecular+Mechanisms+and+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li>
<li>Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+oxidized+low+density+lipoprotein+in+nonrheumatic+stenotic+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).</li>
<li>Mazzone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+infiltration%2C+and+heat+shock+protein-60+are+biological+hallmarks+of+an+immunomediated+inflammatory+process+in+end-stage+calcified+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).</li>
<li>Wu, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphocytic+Infiltration+in+Calcific+Aortic+Stenosis+Predominantly+Consists+of+Clonally+Expanded+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells.</a> The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).</li>
<li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li>
<li>Poursaleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intimal+endothelial+cells+from+the+human+thoracic+aorta%3A+Study+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+journal+of+the+Islamic+Republic+of+Iran%22%5BJournal%5D)">Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol.</a> Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51(2019).</li>
<li>Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Aortic+Dendritic+Cells+and+Lymphocytes+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methodsin+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis.</a> Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).</li>
<li>Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansion+of+innate+and+adaptive+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor+antigen+peptide-specific+T+cells+isolated+from+the+neoplastic+tissue+of+patients+with+gastric+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).</li>
<li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumoral+IFN-gamma-producing+Th22+cells+correlate+with+TNM+staging+and+the+worst+outcomes+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer.</a> Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).</li>
<li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Different+Functional+Distribution+of+%22Not+Effector%22+T+Cells+%28Treg%2FTnull%29+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1900(2017).</li>
<li>Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li>
<li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li>
<li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854(2017).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H%2B%2C+K%2B+--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li>
<li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+%28CpPLD%29+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Procceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een methode om T-lymfocytensubpopulaties te karakteriseren die zijn geïsoleerd uit stenotische aortaklepmonsters, met behulp van flowcytometrie. Deze methode vereist het gebruik van bestraalde buffy coat om de PBMC's te isoleren. De stralingsfrequentie waaraan de buffy coat bags moeten worden blootgesteld is 9000 Rad/90 Gray (Gy) en het is een cruciale stap om de proliferatie van de feedercellen te stoppen. De rol van de cellen geïsoleerd uit de buffy coat bags is om alleen te fungeren als feeder cell...

Calcific aortaklepziekte (CAVD) is een van de meest voorkomende hartklepaandoeningen, met een zware impact op de gezondheidszorg. De frequentie van aortaklepvervanging is de laatste jaren dramatisch toegenomen en zal naar verwachting verder toenemen, als gevolg van de groeiende oudere bevolking1.
De onderliggende pathofysiologie van CAVD is slechts gedeeltelijk bekend en de huidige therapeutische strategieën zijn beperkt tot conservatieve maatregelen of aortaklepvervanging, hetzij door chirurgische of percutane procedures. Tot op heden kan geen enkele effectieve medische behandeling de progressie van CAVD belemmeren of omkeren en is hoge mortaliteit geassocieerd met vroege symptoom-aanvang, tenzij aortaklepvervanging (AVR) wordt uitgevoerd2. Bij patiënten met ernstige symptomatische aortastenose werd de 3-jaars symptoomvrije overleving gerapporteerd zo laag als 20%3. Transkatheter aortaklepvervanging (TAVR) vertegenwoordigt een nieuwe optie, die een revolutie teweegbrengt in de behandeling van patiënten met een hoog risico, vooral bij ouderen, en heeft de mortaliteit, die intrinsiek hoog was in deze populatie, drastisch verminderd4,5,6. Ondanks de veelbelovende resultaten van TAVR is verder onderzoek nodig om de PATHOfysiologie van CAVD te begrijpen om nieuwe vroege therapeutische doelen te identificeren7,8,9.
Eerder gedacht dat het een passief, degeneratief proces was, wordt CAVD nu erkend als een actieve progressieve ziekte, gekenmerkt door een osteoblastische fenotypeschakelaar van de interstitiële cellen van de aortaklep10. Deze ziekte omvat progressieve mineralisatie, fibrocalcische veranderingen en verminderde beweeglijkheid van de aortaklepblaadjes (sclerose), die uiteindelijk de bloedstroom belemmeren, wat leidt tot vernauwing (stenose) van de aortaklepopening11.
Ontsteking wordt beschouwd als een belangrijk proces in cavd pathofysiologie, vergelijkbaar met het proces van vasculaire atherosclerose. Endotheelbeschadiging maakt de afzetting en accumulatie van lipidesoorten mogelijk, met name geoxideerde lipoproteïnen in de aortaklep12. Deze geoxideerde lipoproteïnen veroorzaken een ontstekingsreactie, omdat ze cytotoxisch zijn, waarbij de ontstekingsactiviteit leidt tot mineralisatie. De rol van aangeboren en adaptieve immuniteit in de ontwikkeling van CAVD en ziekteprogressie is onlangs benadrukt13. De activering en klonale expansie van specifieke subsets van geheugen T-cellen zijn gedocumenteerd bij patiënten met CAVD en gemineraliseerde aortaklepblaadjes, zodat ontstekingsprocessen worden verondersteld op zijn minst betrokken te zijn bij de ontwikkeling van CAVD en vermoedelijk ook bij ziekteprogressie14. Hoewel antigeen-presenterende cellen en macrofagen aanwezig zijn in zowel de gezonde als de zieke klep, is de aanwezigheid van T-lymfocyten indicatief voor een verouderde en zieke aortaklep. Dit lymfocytische infiltraat samen met een toename van neovascularisatie en metaplasie zijn karakteristieke histologische tekenen van CAVD15.
We veronderstellen het bestaan van een interactie tussen de interstitiële cellen van de aortaklep en de activering van het immuunsysteem, wat mogelijk de initiatie van een chronisch ontstekingsproces in de aortaklep veroorzaakt. Het testen van T-cellen uit stenotisch aortaklepweefsel zou een efficiënte manier kunnen zijn om hun rol in de ontwikkeling van verkalking te verduidelijken, omdat het een nauwe weergave van de aortaklepcellen in vivo kan bieden. In het huidige werk, met behulp van aortaklepweefsel, isoleren we T-lymfocyten, kweken en klonen ze, en karakteriseren ze vervolgens met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Verse aortaklepmonsters werden weggesneden van CAVD-patiënten die chirurgische klepvervanging kregen voor ernstige aortastenose. Na de chirurgische excisie werd het verse klepmonster in kleine stukjes ontleed en werden de T-cellen gekweekt, gekloond en vervolgens geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. De kleuringsprocedure is eenvoudig en de gekleurde buizen kunnen worden bevestigd met 0,5% paraformaldehyde en tot 15 dagen later worden geanalyseerd. De gegevens die door het kleuringspaneel worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om veranderingen in de distributie van T-lymfocyten in de loop van de tijd in relatie tot interventie te volgen en kunnen gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activeringstoestanden van specifieke T-celsubsets van belang te beoordelen.
De extractie van verkalkt weefsel, de isolatie van leukocyten uit verkalkt weefsel en met name het gebruik van flowcytometrie op dit type weefsel kan een uitdaging zijn, vanwege problemen zoals autofluorescentie. Er bestaan weinig publicaties met protocollen voor dit specifieke doel16,17,18. Hierin presenteren we een protocol dat speciaal is ontworpen voor de directe isolatie en kweek van T-lymfocyten uit menselijke aortaklepmonsters. Klonale expansie van lymfocyten is een kenmerk van adaptieve immuniteit. Het bestuderen van dit proces in vitro levert inzichtelijke informatie op over het niveau van lymfocyten heterogeniteit19. Na een incubatietijd van drie weken zijn de T-celklonen klaar om te worden geëxplanteerd, omdat een voldoende hoeveelheid T-cellen van elke kloon werd verkregen, om de fenotypische en functionele studie mogelijk te maken. Vervolgens wordt het fenotype van T-klonen bestudeerd door cytofluorometrie.
Dit immunologische protocol is een aanpassing van een eerder door Amedei et al. ontwikkelde methode voor T-celisolatie en karakterisering uit menselijk weefsel, speciaal ontworpen voor verkalkt menselijk weefsel, zoals in CAVD20,21,22. Het protocol hier voor de isolatie van PBMC's (perifere bloedmononucleaire cellen) met behulp van bestraalde buffy coat beschrijft een effectieve manier om feedercellen (FC) te verkrijgen, specifiek aangepast voor de kloonfase van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële cellen. De feederlaag bestaat uit in groei gestopte cellen, die nog levensvatbaar en bioactief zijn. De rol van feedercellen is belangrijk ter ondersteuning van in vitro overleving en groei van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële cellen23. Om feedercelproliferatie in cultuur te voorkomen, moeten deze cellen een groeistop ondergaan. Dit kan op twee manieren worden bereikt: door fysische methoden zoals bestraling, of door behandeling met cytotoxische chemicaliën, zoals mitomycine C (MMC), een antitumoraal antibioticum dat rechtstreeks op het kweekoppervlak kan worden aangebracht24. Hier laten we zien dat de groei van de feedercel wordt gestopt door celbestraling.
Deze methode biedt een efficiënte, kosteneffectieve manier om T-cellen uit aortaklepweefsel te isoleren en te karakteriseren, wat bijdraagt aan het verbreden van het spectrum van immunologische methoden voor het verkennen van CAVD-pathofysiologie.

<table><tbody><tr><td>50 mL plastic syringes</td><td>Fisherbrand</td><td>9000701</td><td></td></tr><tr><td>96- well U- bottom Multiwell plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>10638441</td><td></td></tr><tr><td>Bag Spike (needle free)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Verdunst tot 4% met PBS</td></tr><tr><td>CD14 Brilliant violet 421</td><td>&nbsp;Biolegend</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>CD25 PE</td><td>&nbsp;Biolegend</td><td>302621</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE/Cy7</td><td>&nbsp;Biolegend</td><td>300316</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp;Biolegend</td><td>317419</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Brilliant violet 711</td><td>&nbsp;Biolegend</td><td>304137</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Brilliant violet 510</td><td>&nbsp;Biolegend</td><td>301047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>13094697</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tube 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>10136120</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td><td>BD</td><td>2300E</td><td></td></tr><tr><td>Fast read 102 plastic counting chamber</td><td>KOVA INTERNATIONAL</td><td>630-1893</td><td></td></tr><tr><td>Filters for culture medium 250 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Filters for culture medium 500 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>HB 101 Lyophilized Supplement</td><td>Irvine Scientific</td><td>T151</td><td></td></tr><tr><td>HB Basal Medium</td><td>Irvine Scientific</td><td>T000</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>HS (Human serum)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids solution</td><td>Sigma</td><td>11082132001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10538931</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>PHA (phytohemagglutinin)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri dishes</td><td>Thermo Scientific</td><td>R80115TS</td><td>10 0mm x 15 mm</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>HyClone</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco by Life technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters 0,45&micro;l</td><td>Rotilabo-Spritzenfilter</td><td>P667.1</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Cell culture flasks</td><td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Cell culture flask</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10232771</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek naar aortaklepverkalking via isolatie en kweek van t-lymfocyten met behulp van feedercellen van bestraalde buffy coat

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortaklepziekte (CAVD), een actief ziekteproces variërend van milde verdikking van de klep tot ernstige verkalking, wordt geassocieerd met hoge mortaliteit, ondanks nieuwe therapeutische opties zoals transkatheter aortaklepvervanging (TAVR). 
De volledige routes die beginnen met klepverkalking en leiden tot ernstige aortastenose blijven slechts gedeeltelijk begrepen. Door een nauwe weergave van de aortaklepcellen in vivo te bieden, zou het testen van T-lymfocyten uit stenotisch klepweefsel een efficiënte manier kunnen zijn om hun rol in de ontwikkeling van verkalking te verduidelijken. Na chirurgische excisie wordt het verse aortaklepmonster in kleine stukjes ontleed en worden de T-lymfocyten gekweekt, gekloond en vervolgens geanalyseerd met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
De kleuringsprocedure is eenvoudig en de gekleurde buizen kunnen ook worden bevestigd met 0,5% paraformaldehyde en tot 15 dagen later worden geanalyseerd. De resultaten van het kleuringspaneel kunnen worden gebruikt om veranderingen in T-celconcentraties in de loop van de tijd te volgen in relatie tot interventie en kunnen gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activeringstoestanden van specifieke T-celsubtypen van belang te beoordelen. In deze studie tonen we de isolatie van T-cellen, uitgevoerd op verse verkalkte aortaklepmonsters en de stappen van het analyseren van T-celklonen met behulp van flowcytometrie om de rol van adaptieve immuniteit in CAVD-pathofysiologie verder te begrijpen.

We gebruikten een eenvoudige en kosteneffectieve methode om de leukocytenpopulatie van verse aortaklepmonsters afgeleid van menselijke patiënten met ernstige aortaklepstenose te karakteriseren (zie protocol). De methode voor het isoleren van PBMC's is een essentiële stap in het verkrijgen van feedercellen, die in elke stap van het experiment worden gebruikt (kloon-, refeeding- en splitfasen) en die de detectie en karakterisering van infiltrerende leukocyten in aortaklepmonsters mogelijk maken. De belangrijkste stappen va...

In deze studie beschrijven we het proces van T-lymfocytenisolatie uit verse monsters van verkalkte aortakleppen en de analytische stappen van T-celklonen voor de karakterisering van de adaptieve leukocytensubsets met behulp van flowcytometrie-analyse.

Onderzoek naar aortaklepverkalking via isolatie en kweek van T-lymfocyten met behulp van feedercellen van bestraalde buffy coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Dit protocol is eenvoudig uit te voeren. De kloonfase maakt het mogelijk om een groter aantal T-klonen te verkrijgen uit verse monsters. Bovendien kunnen het fenotype en de functie van T-cellen gemakkelijk worden geanalyseerd.De procedure wordt gedemonstreerd door Mary Christopher, een doctoraatsstudent uit mijn laboratorium. Om het klonen van T-cellen te induceren, gebruikt u de zakpen met de naaldvrije klep om een bestraalde buffy coat-zak in een laminaire stroomkap te openen. Breng tot 50 milliliter bloed uit de zak over in een T-150 kolf en voeg 70 milliliter PBS toe aan de kolf.Leg voorzichtig 30 milliliter van het verdunde bloed op 20 milliliter dichtheidsgradiënt in elk van de vier conische buizen van 50 milliliter en scheid de cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Aspiraleer het supernatant voorzichtig en breng de PBMC van elke buis over in een enkele nieuwe buis van 50 milliliter. Gebruik PBS om het uiteindelijke volume op 50 milliliter te brengen en verzamel de PBMC door centrifugeren.Na een tweede wasbeurt onder dezelfde omstandigheden, suspens de geïsoleerde feedercellen in 10 milliliter celkweekmedium voor het tellen en voeg 25 milliliter van een celkweekmedium van 70 milliliter aangevuld met 50 eenheden IL-2-oplossing toe aan elk van de twee 50 milliliterbuizen. Voeg vervolgens feedercellen toe aan één buis met een 2 bij 10 tot de 6e cellen per milliliter celkweekmedium aangevuld met IL-2-concentratie. Om een T-lymfocytencultuur op te zetten, bundelt u de T-celkloon met supernatanten uit de stenotische klepmonsterkolf in een enkele buis van 50 milliliter en verzamelt u de cellen door centrifugering.Was de pellet driemaal in 50 milliliter PBS per wasbeurt, voordat u de cellen opnieuw opschortte in 1 milliliter celkweekmedium om te tellen. Verdun de cellen tot een concentratie van 1 bij 10 tot de 3e cellen per milliliter en voeg 500 microliter cellen toe aan de buis van het celkweekmedium aangevuld met IL-2 zonder feedercellen. Voeg de feedercelsuspensie toe aan een plastic petrischaaltje van 100 bij 15 milliliter en voeg 100 microliter feedercellen toe aan elke put van het juiste aantal U-bottom 96-well-platen voor het experiment.Voeg vervolgens de T-cellen toe aan een petrischaaltje en voeg 100 microliter T-cellen toe aan elke feedercel, goed aangevuld voor een incubatie van een week in de celkweekincubator. De PBMC-isolatie is van vitaal belang voor het verkrijgen van feedercellen en het mogelijk maken van de detectie en karakterisering van infiltrerende leukocyten in aortaklepmonsters. Na twee weken incubatie kan een kloon T-cel populatie worden verkregen.Hier wordt het gatingschema voor het analyseren van T-celsubpopulaties bij patiënten met verkalkte aortaklepziekte getoond. Zoals waargenomen bij deze patiënt, waren er meer CD4+T-cellen dan CD8+T-cellen. Flowcytometrische analyse van niet-gesloten T-cellen bevestigt dat dezelfde T-celmarkers aanwezig zijn in zowel native klep- als kloonmonsters.Samen geven deze gegevens aan dat T-cellen aanwezig zijn in verkalkte aortakleppen met CD45 + leukocyten, wat suggereert dat calcific aortaklepziekte verband houdt met activering van het immuunsysteem en ontstekingsactiviteit. Deze methode is zeer veelzijdig. Het kan worden toegepast op verschillende protocollen waarvoor onderzoekers cellen uit een weefsel moeten kunnen isoleren, voor de functionele karakterisering.Houd er rekening mee dat het belangrijk is om onder steriele omstandigheden te werken om besmetting te voorkomen en om de cellen kritisch onder de microscoop te observeren.

investigating-aortic-valve-calcification-via-isolation-culture-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Dit document presenteert een flow cytometrie-gebaseerde methode om het immuunsysteem samenstelling van de aorta's te onderzoeken. De paper illustreert ook een extra techniek die het mogelijk maakt te onderzoeken omringende adventitia en vaatwand afzonderlijk. Deze methode biedt mogelijkheden om fenotypische analyses van de aorta leukocyten uit te voeren en een aantal immunologische testen toe te passen voor atherosclerose studies.

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

In this video, we demonstrate the isolation of aortic valve interstitial cells from the heart of an adult mouse using a two-step collagenase procedure and their subsequent culture in low volume of growth media.

Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: An Enzymatic Method to Isolate and Culture VICs from Mouse Aortic Valve

This video demonstrates a staining technique for assessing arterial medial calcification of the vascular smooth muscle cells in vitro. The von Kossa method employs a photochemical reaction to deposit metallic silver at the sites of calcification and impart a black coloration.

Von Kossa Staining of Aortic Vascular Smooth Muscle Cells: An In Vitro Technique for Assessment of Arterial Medial Layer Calcification

This video demonstrates an assay technique for assessing the calcification of the aortic valve interstitial cells in vitro. The assay helps to quantify the calcium concentration using the arsenazo III reagent, a calcium-sensitive dye that reacts with calcium ions to form a purple-colored calcium-arsenazo complex.

Calcification Assay to Measure Calcium Concentration in Aortic Valve Interstitial Cells

Vasculaire calcificatie is een belangrijke voorspeller van en bijdrager aan hart- en vaatziekten bij mensen. Dit protocol beschrijft methoden voor het induceren van calcificatie van gekweekte primaire vasculaire gladde spiercellen en voor het kwantificeren van calcificatie en macrofagenlast in dierlijke aorta's met behulp van near-infrared fluorescentiebeeldvorming.

Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking

Dit artikel bevat gedetailleerde methodologie voor het identificeren en kwantificeren van functionele T-lymfocyten subsets in muizen nieren, aorta en de lymfeklieren aanwezig door intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie werd gekozen uitleggen, stap voor stap, de procedures en de grondbeginselen van flowcytometrie en intracellulaire kleuring.

Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension

Dit protocol beschrijft de isolatie, cultuur en verkalking van de rat-afgeleide ventiel interstitiële cellen, een zeer fysiologische in vitro model van calcific aortaklep ziekte (CAVD). Exploitatie van dit model rat vergemakkelijkt CAVD onderzoek in het verkennen van de cel- en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit complexe pathologisch proces.

Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep

Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.

Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen

Dit protocol beschrijft de verzameling menselijke aortakleppen geëxtraheerd tijdens chirurgische aortaklepvervangingsprocedures of uit cadaverische weefsel, en de daaropvolgende isolatie, uitbreiding en karakterisering van patiëntspecifieke primaire klep endotheel- en interstitiële cellen. Inbegrepen zijn belangrijke details over de processen die nodig zijn om de levensvatbaarheid van cellen en fenotypespecificiteit te garanderen.

Isolatie van menselijke primaire klepcellen voor in vitro ziektemodellering

Dit artikel presenteert de methodologie voor het verkrijgen en beoordelen van vasculaire calcificatie door het isoleren van muriene aorta's gevolgd door het extraheren van verkalkte extracellulaire blaasjes om het mineralisatiepotentieel te observeren.

Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Leer T-lymfocyten isoleren en klonen uit verkalkte aortaklepweefsel met behulp van bestraalde buffy coat-feedercellen. Deze methode maakt fenotypische analyse mogelijk om de rol van adaptieve immuniteit in calcificerende aortaklepverkalking te onderzoeken.

Onderzoek naar aortaklepverkalking via isolatie en kweek van T-lymfocyten met behulp van feedercellen van bestraalde buffy coat

Meer video's verkennen