Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie
23 december 2020
Hier beschrijven we een eenvoudige methode die RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) combineert met immunofluorescentie om ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA te visualiseren. Dit protocol kan het begrip van de moleculaire kenmerken van SARS-CoV-2 RNA-host interacties op eencellig niveau vergroten.
Dit protocol maakte het mogelijk om SARS-CoV-2 RNA te visualiseren in cellijnen en in volledig gedifferentieerde, driedimensionale culturen van menselijk luchtwegepitheel, waardoor een hulpmiddel ontstond om de virale pathogenese en replicatie op single-celniveau beter te begrijpen. Dankzij de hoge specificiteit, gevoeligheid en resolutie is deze methode niet alleen nuttig voor fundamentele wetenschappelijke studies van SARS-coronavirus-2, maar ook voor toegepaste projecten, zoals diagnostiek. De procedure zal worden gedemonstreerd door Agnieszka Suder, een promovendus uit mijn laboratorium.
Na het fixeren en permeabiliseren van de cellen zoals beschreven in het tekstmanuscript, verwijdert u de 1X PBS-oplossing uit de putjes en voegt u minimaal 300 microliters amplificatiebuffer toe aan elke put. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid elke HCR-haarspeld voor door het gewenste volume in afzonderlijke buisjes snel af te koelen.
Om 300 microliters amplificatieoplossing te bereiden, gebruikt u 18 picomol van elke haarspeld. Breng de haarspeldoplossing over in buisjes en incubeer deze gedurende 90 seconden bij 95 graden Celsius. Koel vervolgens gedurende 30 minuten af tot kamertemperatuur in het donker.
Bereid een haarspeldmix voor door de snel gekoelde H1- en H2-haarspelden toe te voegen aan de amplificatiebuffer. Plaats druppels van 30 tot 50 microliter van de haarspeldmix op Parafilm. Leg de dekvlakken met cellen op de druppels van de haarspeldmix en incubeer de monsters een nacht lang in het donker bij kamertemperatuur.
Om de slides te monteren, plaatst u twee druppels van 10 microliter montagemedium op een slide, en zorg ervoor dat de druppels voldoende gescheiden zijn om twee dekvlakken op een enkele slide te plaatsen. Verwijder overtollig vocht door de dekvlakken op een schone handdoek te tikken. Plaats ze vervolgens in antifade montagemedium met de cellen naar beneden.
Plaats de gemonteerde monsters op een droge, platte ondergrond in het donker en laat ze uitharden. Na het fixeren en permeabiliseren van de HAE-cellen zoals beschreven in het tekstmanuscript, pre-amplificeert u de monsters door ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met amplificatiebuffer te incuberen. Gebruik 30 picomol van elke haarspeld om 500 microliter amplificatieoplossing te bereiden.
Breng de haarspeldoplossing over naar de buisjes en incubeer deze gedurende 90 seconden bij 95 graden Celsius. Koel ze vervolgens gedurende 30 minuten af tot kamertemperatuur in het donker. Bereid de haarspeldoplossing voor door alle snel gekoelde haarspelden toe te voegen aan 500 microliter amplificatiebuffer bij kamertemperatuur.
Verwijder de pre-amplificatieoplossing en voeg de volledige haarspeldoplossing toe. Incubeer de monsters vervolgens een nacht lang bij kamertemperatuur in het donker. Plaats het uitgesneden membraan van de Transwell-inserts op 10 microliter antifade montagemedium met de cellen naar boven en voeg extra montagemedium toe aan het membraan.
Bedek vervolgens de membranen met dekvlakken. Dit immuno-RNA-FISH-protocol werd uitgevoerd in twee cellulaire systemen, een Vero-cellijn en een 3D-cultuur van menselijk luchtwegepitheel. De lokalisatie van SARS-coronavirus-2 subgenoom RNA in geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde Vero-cellen wordt hier getoond.
Virale RNA is te zien in rood. De lokalisatie van SARS-coronavirus-2 subgenoom RNA in geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde menselijke luchtweg-epitheelcellen wordt hier getoond. Het permeabilisatieprotocol werd geoptimaliseerd in Vero-cellen.
Permeabilisatie met detergent resulteert in een duidelijk, specifiek signaal voor SARS-coronavirus-2 subgenoom RNA, terwijl het gebruik van ethanol resulteert in een wazig en onscherp beeld. Bij het monteren van de slides met Vero-cellen is het belangrijk om een dekglas met de cellen naar beneden te plaatsen. Bij het monteren van de HAE-slides moet het membraan met de cellen naar boven worden geplaatst.
Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast om de detectie van elk RNA mogelijk te maken, inclusief niet-coderend RNA en RNA-virussen die in de toekomst kunnen optreden. In combinatie met immunofluorescentie kan het worden gebruikt om de eiwit-RNA-interacties op single-celniveau te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode die RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) integreert met immunofluorescentie om SARS-CoV-2 RNA te visualiseren. Deze aanpak verbetert het begrip van SARS-CoV-2 RNA-gastheerinteracties op enkelcelniveau.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Virologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van virale pathogenese is cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve diagnostiek en behandelingen.
- SARS-CoV-2 heeft significante implicaties voor de volksgezondheid.
- Het visualiseren van RNA op enkelcelniveau kan inzicht geven in virale replicatie.
- Het combineren van RNA-FISH met immunofluorescentie biedt hoge specificiteit en gevoeligheid.
Doel van het onderzoek
- SARS-CoV-2 RNA visualiseren in verschillende celmodellen.
- Het begrip van virale interacties binnen gastheercellen verbeteren.
- Een hulpmiddel bieden voor zowel fundamenteel als toegepast onderzoek in de virologie.
Gebruikte methoden
- Fixatie en permeabilisatie van cellen.
- Toepassing van amplificatiebuffer voor RNA-visualisatie.
- Gebruik van HCR-haarspelden voor specifieke RNA-detectie.
- Immunoflurescentietechnieken om RNA-FISH aan te vullen.
Belangrijkste resultaten
- SARS-CoV-2 RNA werd succesvol gevisualiseerd in cellijnen en humane luchtweg-epitheelculturen.
- De methode toonde hoge specificiteit en gevoeligheid.
- Resultaten dragen bij aan een beter begrip van virale pathogenese.
- Dit protocol is toepasbaar voor zowel onderzoek als diagnostische doeleinden.
Conclusies
- De gecombineerde methode is effectief voor het bestuderen van SARS-CoV-2 op enkelcelniveau.
- Het biedt waardevolle inzichten in RNA-gastheerinteracties.
- Deze aanpak kan helpen bij de ontwikkeling van diagnostische hulpmiddelen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
