Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Katoenbolworm is een van de meest destructieve plagen ter wereld. Genoombewerking met de CRISPR/Cas9-technologie maakt verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in dit organisme mogelijk. De twee belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge specificiteit heeft en herbewerkbaar is.

Om de sgRNA-doelen te kiezen, gaat u naar de crispr online website om te zoeken naar mogelijke gidsplaatsen en de exonen in de buurt van de vijf belangrijkste onvertaalde regio's van het gen. Voer de exonsequentie in het tekstvak in en selecteer het doelgenoom voor Helicoverpa armigera. Kies de PAM-optie voor 20 BPNGG en laat de andere instellingen op de standaardparameters staan, volgens de gebruikershandleidingen van de website.

Vergelijk de voorspelde gidssequenties uit de software en kies een gidssequentie van 20 basenparen met een of twee guanines in de buurt van het vijf priemgetalde onvertaalde gebied met de hoogste voorspelde efficiëntie en de minste mismatches om de bewerkingsefficiëntie te verbeteren en off-target bewerking te verminderen. Selecteer voor embryovoorbereiding 50 gezonde individuen uit drie dagen oude mannetjes en twee dagen oude vrouwtjes en meng ze in een schone netkooi. Plaats een stuk vochtig katoen met 10% suikeroplossing in de kooi.

Bedek de netkooien met gaas en bevestig het gaas met een elastiekje. Spuit water op het gaas om het vochtig te houden. Snijd een zwarte doek in een geschikte maat en vervang het vochtige gaas door deze zwarte doek om gedurende 30 minuten vrije eicellen mogelijk te maken.

Plak dubbelzijdige tape op een microscoopglaasje. Plak met een tang de pleisters met eieren op een rij op het oppervlak van de dubbelzijdige tape. Druk op de marge van elke patch om ervoor te zorgen dat ze stevig aan de tape blijven plakken.

Verzamel 50 tot 100 eieren per microscoopglaasje. Houd vóór micro-injectie de microscoopglaas op ijs om de ontwikkeling van embryo's te vertragen. Bereid de naald voor door aan een capillair glas te trekken met behulp van een micropipettrekker zoals beschreven in het teksthandschrift.

Slijp de naaldpunt met behulp van een micromolen tot een punt met scherpe randen. Bereid injectieoplossingen voor door twee microliter gecommercialiseerd Cas9-eiwit en sgRNA toe te voegen aan RNace-vrij water in een PCR-buis om een volumemengsel van 10 microliter te verkrijgen. Meng goed door te pipetteren en leg het op ijs.

Stel de parameters van de elektronische micro-injector in. Laad twee microliter van het mengsel in een naald met behulp van een pipetpunt van de microlader, waarbij zoveel mogelijk restlucht in de punt van de naald wordt afgevoerd. Sluit de injectienaald aan op een micromanipulator en zorg voor een nauwe verbinding tussen de twee delen.

Plaats een dia in een petrischaaltje en leg het op het podium van de microscoop. Steek de naaldpunt voorzichtig in de bovenste halve bol van een embryo in een hoek van 45 graden. Druk op het pedaal om het mengsel in het embryo af te geven, wat leidt tot een lichte uitbreiding van het embryo.

Trek de naald onmiddellijk van het embryo en beweeg de petrischaal met één hand totdat het volgende embryo zich in de buurt van de naald bevindt. Injecteer ten minste 300 embryo's met dezelfde procedure om ervoor te zorgen dat er voldoende uitkomt. Dek het deksel van de petrischaaltjes af na injectie.

Wanneer de oppervlaktekleur van embryo's donkerder is geworden, plaatst u kunstmatige voeding in de petrischaal rond de microscoopglaasjes. Bereid 24-well kweekplaten en vul elke put tot 1/3 van zijn volumetrische capaciteit met kunstmatig dieet. Kies de broedende larve uit met een klein verfkwasttje en breng ze over naar de 24-well kweekplaat, zodat één put één larve heeft.

Wanneer larven groeien naar het derde instar-stadium, breng ze dan over naar een nieuw glazen ductiel ethrae. Breng de nieuw ingesloten G-zero mannelijke volwassenen en wilde vrouwelijke volwassenen over in een verse netkooi met een gelijke verhouding. Voorzie ze van 10% suikeroplossing die in wattenbollen is gevallen.

Kweek insecten met behulp van routinematige methoden tot de verpopping van G-one. Gebruik een tang om voorzichtig een achterpoot te verwijderen en plaats elk been in een Lysing Matrix-buis. Homogeniseer het achterbeen met behulp van een weefselhomogenisator.

Extraheer het genomische DNA van het gehomogeniseerde monster met behulp van een commerciële gDNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Versterk het gensegment met behulp van genotyperingsprimers en de PCR-reactiecondities uit het teksthandschrift. Bevestig het genotype met een gen-sequencingservice.

Zet G-one individuen van hetzelfde genotype in één netkooi, kruis zelf de G-one nakomelingen en blijf screenen met dezelfde methoden. De doelplaats van het interessante gen bevond zich in zijn tweede exon. Deze site was zeer geconserveerd en het doelbandfragment van gesynthetiseerd sgRNA werd bevestigd met behulp van agarosegel-elektroforese.

De mutante detectie van een enkel sgRNA-doelwit werd uitgevoerd door de PCR-producten van G-one-ouderlijke eenheden te sequentiëren. De effectiviteit van het gebruik van niet-overlappende sgRNA-paren over verschillende exonen werd aangetoond omdat de grote deletie van de mutanten gemakkelijk te onderscheiden was van de wild-type pannen. Na het verkrijgen van een bepaald aantal mutante individuen, kunnen elektrofysiologische of gedragsexperimenten worden uitgevoerd om de genfunctie en interactie tussen verschillende genen te verduidelijken.