Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Organoïde-afgeleide monolagen recapituleren de intestinale epitheliale barrièrefunctie van de patiënt en maken het mogelijk om het effect te testen van therapieën gericht op het verbeteren van disfunctie bij elke patiënt om gepersonaliseerde behandelingsstrategieën te identificeren. Organoïde monolagen bieden toegang tot de apicale kant van het epitheel, de kant waar de schade optreedt, en het is normaal en toegankelijk in organoïden die groeien als 3D-structuren. Elke organoïde is anders, vandaar de strijd.

Om strakke monolagen te vormen, gebruik organoïden in de proliferatiefase en verteer snel om clusters van twee tot vier cellen te vormen. Titreer de celzaaiing voor elk model. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Wies Van Dooremalen, een senior onderzoeksmedewerker van HUB.

Begin met het coaten van membraaninzetstukken met extracellulaire matrix of ECM. Werk in een bioveiligheidskast en plaats de membraaninzetstukken in de steunplaat. Verdun de ECM 40X in ijskoude DPBS met calcium en magnesium en pipetteer vervolgens 150 microliter van de verdunde ECU in het apicale compartiment van elke insert.

Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende ten minste een uur. Om de cellen voor te bereiden op zaaien, verwarmt u een aliquot van celdissociatiereagens in een waterbad van 37 graden Celsius. Gebruik twee milliliter van het reagens voor elke put van een plaat met zes putten.

Breng de kweekplaat met de organoïden over van de incubator naar de bioveiligheidskast. Verwerk de organoïden zoals beschreven in het teksthandschrift, maar bundel niet meerdere buizen in één buis. Voeg na het oogsten van de organoïden basaal medium of BM toe aan 12 milliliter en centrifugeer op 85 maal G en zuig vervolgens het supernatant op.

Vul de buis met de organoïden met maximaal 12 milliliter DPBS en pipetteer vervolgens 10 keer op en neer met een pipet van 10 milliliter. Centrifugeer vijf minuten bij acht graden Celsius op 85 maal G en zuig het supernatant op zonder de organoïde pellet te verstoren. Voeg het voorverwarmde celdissociatiereagens toe aan de organoïden en resuspendatie ze, en incubeer de buizen vervolgens diagonaal of horizontaal gedurende vijf minuten in het waterbad bij 37 graden Celsius.

Pipetteer na de incubatie 10 keer op en neer met een steriele plastic pipet van vijf milliliter of een P1000-pipet. Controleer de organoïde suspensie onder de microscoop om te zien of zich een mengsel van enkele cellen en enkele celklonten bestaande uit twee tot vier cellen heeft gevormd. Stop de celdissociatie door tot 12 milliliter BM met ROCK-remmer toe te voegen aan de celsuspensie.

Centrifugeer de cellen en zuig vervolgens het supernatant op zonder de celkorrel te verstoren. Wanneer u dezelfde organoïdecultuur in verschillende buizen gebruikt, poolt u de celkorrels voordat u ze opnieuw opschordt in 12 milliliter BM. Filter de celsuspensie door een zeef van 40 micrometer die vooraf is bevochtigd met BM en oogst de doorstroom in een conische buis van 50 milliliter, was vervolgens de zeef met 10 milliliter BM en oogst de doorstroom in dezelfde buis. Breng de gespannen celsuspensie over in twee nieuwe conische buisjes van 15 milliliter en herhaal de centrifugatie.

Zuig het supernatant op zonder de celkorrel te verstoren en resuspend de cellen in vier milliliter IEM aangevuld met 10 micromolaire ROCK-remmer per volledige kweekplaat die als uitgangsmateriaal wordt gebruikt. Meng een kleine hoeveelheid celsuspensie in een één-op-één verhouding met Trypan Blue om te tellen, tel vervolgens de cellen en bereken het totale aantal levende cellen, waarbij elke individuele cel in kleine klonten wordt geteld. Bereid een celsuspensie voor met 3X 10 tot de zesde levende cellen per milliliter IEM aangevuld met 10 micromolaire ROCK-remmer.

Om de cellen te zaaien, aspiraleer dpbs voorzichtig uit de ecm-gecoate inzetstukken, waarbij de plaat horizontaal blijft. Pipetteer 800 microliter IEM aangevuld met ROCK-remmer in elk basolateraal compartiment en 150 microliter van de celsuspensie bereid op het met ECM gecoate membraan in het apicale compartiment druppelsgewijs. Plaats de plaat in de couveuse bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Zodra de cellen op het membraan zijn gesedimenteerd, meet u elke dag de transepitheliale elektrische weerstand of TEER en stelt u de membraaninzetstukken in beeld met behulp van een microscoop. Om de monolagen te verversen, verwijdert u het medium uit de basolaterale compartimenten van de plaat met de membraaninzetstukken en zuigt u het medium voorzichtig op uit de apicale compartimenten. Voeg druppelsgewijs 150 microliter verse IEM toe aan elk apicale compartiment en voeg 800 microliter verse IEM toe aan elk basolateraal compartiment.

Als u een handmatige TEER-meter gebruikt, reinigt u de elektrode met 70% ethanol en laat u deze aan de lucht drogen in de bioveiligheidskast en plaatst u de elektrode vervolgens in een buis met BM. Sluit de elektrode aan op de handmatige TEER-meter en zet de functieschakelaar om in ohm te meten en de aan /uit-schakelaar aan. Plaats de korte elektrode in het apicale compartiment van het inzetstuk en de lange elektrode in het basolaterale compartiment zonder de monolaag aan te raken. Meet de weerstand in de blanco put en vervolgens in de resterende monsters.

Was de elektrode met BM tussen monsters met verschillende omstandigheden. Als u klaar bent, reinigt u de elektrode met demi-water en met 70% ethanol en laat u deze vervolgens aan de lucht drogen. Dit protocol werd gebruikt om intestinale organoïden te oogsten en monolagen van epitheelcellen te bereiden.

Een monolaag die acht dagen lang in IEM werd gekweekt, wordt hier getoond. Een structuur kan worden waargenomen bij het blootstellen van monolagen aan enterocyt differentiatiemedium of EDM, terwijl monolagen blootgesteld aan combinatiemedium of CDM een gladdere structuur vertonen. Monolaagvorming werd kwantitatief gevolgd door het meten van TEER.

Een volledig confluente monolaag had een TEER-waarde van ongeveer 100 ohm centimeter in het kwadraat die toenam bij blootstelling aan beide differentiatiemedia. Monolagen vertoonden in alle medium omstandigheden een lagere schijnbare permeabiliteit voor Lucifergeel. De secretie van lysozymen door ileale monolagen gekweekt in IEM was hoger dan die van monolagen gekweekt in IEM tot confluent en nog eens vier dagen in EDM of CDM.

Monolayers gekweekt in IEM, IEM en daaropvolgende EDM, of IEM en daaropvolgende CDM vertonen verschillen in morfologie die werd waargenomen met H & E, Ki67, MUC2 en Alcian Blue-kleuringen. Na differentiatie namen proliferatieve cellen af, terwijl de genexpressie van gobletcellen en enterocytmarkers toenam in vergelijking met die waargenomen onder IEM-omstandigheden, zoals aangetoond door LGR5,MUC2 en alkalische fosfatase-genexpressie. Bij het bereiden van monolagen is het belangrijk om anoikis in de organoïden te voorkomen na het verteren ervan.

Bovendien moet ECM in cellen gelijkmatig worden verdeeld over de Transwell-membranen. Organoïde-afgeleide monolagen maken de evaluatie van molecuultransporten met behulp van verschillende fluorescerende substraten op een patiëntspecifieke manier mogelijk.