Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een plaatadapter met meerdere kolommen

Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een multi-kolomplaatadapter. Hallo, eiwitzuivering is noodzakelijk voor de studie van de eiwitstructuur en -functie. En het wordt meestal gebruikt in combinatie met biofysische technieken.

Dit is vooral belangrijk in het tijdperk van functionele proteomics die een eiwitproductie met hoge doorvoer vereisen. We veronderstelden dat een multi-kolom plaatadapter, de MCPA, meerdere chromatografiekolommen van verschillende harsen kan koppelen aan multi-well platen voor parallelle zuivering. Met deze adapter hebben we een economische en veelzijdige methode van eiwitzuivering ontwikkeld die onder zwaartekracht of vacuümconcurrent kan worden gebruikt in de snelheid van een geautomatiseerd systeem.

Hier tonen we deze methode voor nikkel affiniteit chromatografie en ionenuitwisseling chromatografie. Monteer de MCPA door een doorboorde afdichtingsmat op een lange druppelplaat te plaatsen en plaats vervolgens het gewenste aantal kolommen in de gaten van de afdichtingsmat. Plaats een open opvangplaat in de basis van het spruitstuk en sluit met de bovenkant van het spruitstuk.

Bevestig de slang en plaats de geassembleerde MCPA met kolommen aan de bovenkant. Pipet 1,2 mil van de nikkel-NTA oplossing in de kolommen. Zorg er tijdens het pipetten voor dat de kralen volledig gemengd blijven.

Schakel de pomp in en voer de 20% ethanol door de kolommen en in de opvangplaat hieronder. Schakel de pomp uit zodra de vloeistof is doorgelopen. Gooi de inhoud van de inzamelplaat in een afvalbak.

Voeg drie harsvolumes EDTA-buffer toe aan alle kolommen. Zet de pomp aan en voer de vloeistof erdoorheen. Was nu de kolommen met drie harsvolumes van 0,5 molaire natriumhydroxidebuffer.

Was de kolommen met vier harsvolumes van 100 millimol nikkelsulfaat en vervolgens 10 harsvolumes Mili-Q-water. Als een kolom langzamer loopt, duwt u de vloeistof erdoor met de zuiger van de spuit. Giet de inhoud van de inzamelplaten in een afvalbak.

Was vervolgens de kolommen twee keer met vier harsvolumes van 10 millimolar imidazolwasbuffer en leeg de opvangplaten. Als meerdere monsters worden gezuiverd, vervang dan de open opvangplaten door een 48-put platen. Met het vacuüm uit, laadt u de lysaten in de kolommen.

Gebruik een dunne plastic roerder om de kralen en de lysaten in de kolom voorzichtig te mengen om de binding te maximaliseren. Zet de pomp aan en voer de vloeistof erdoorheen. Als een kolom verstopt raakt, breng dan het lysaatharsmengsel over in een kolom met een vers filter.

Vries de opvangplaten in om uw doorstroming te bevatten. Vervangen door een open opvangplaat en vervolgens de kolommen wassen met negen harsvolumes van 10 millimolar imidazol wasbuffer. Herhaal deze stap vier of vijf keer.

Om overloop te voorkomen, moet u de afvalplaten regelmatig legen. Vervang de open opvangplaten door een 96-put plaat, zodat A1 zich in de linkerbovenhoek bevindt. Pipet een harsvolume van denaturering elutie buffer in de kolommen.

Voer de vloeistof door en controleer de opvangplaat om er zeker van te zijn dat er geen verontreiniging tussen de putten is. Herhaal voor de volgende verdunning de vorige stappen en verzamel in een verse opvangplaat. Neem een 50 microliter aliquot van elke elutie voor de zuiverheids- en concentratieanalyse.

Was vervolgens de kolommen met twee milliliter 20% ethanol. Voeg nog eens twee mil 20% ethanol toe aan de kolommen en gebruik de verse dunne plastic roerder om de kralen in de ethanol te mengen voordat u ze overbrengt naar een buis van 50 mil voor opslag bij vier graden Celsius. Monteer de MCPA in vacuümspruitstuk met een open opvangplaat en spuitduikers in alle kolommen.

Verwijder alle zuigers van de spuit van de eerste rij. Verwijder de rubberen pakking uit een zuiger van vijf mil spuiten en prik vervolgens een gat in het midden. Duw vervolgens de onderkant van een open kolom door de doorboorde rubberen pakking.

Herhaal deze stappen en voeg in de voorste rij kolommen in. Zorg ervoor dat de Q sepharose kralen volledig gemengd zijn. En met de blauwe pipetpunt die twee centimeter van de bodem is gesneden, pijpt 800 microliter van de Q sepharose kralen in de open kolommen.

Zodra de kralen zich op de bodem van de kolommen hebben gevestigd, schakelt u de vacuümpomp voldoende in om de 20% ethanol erdoorheen te laten lopen. Was de kolommen twee keer met twee mil van 10 millimolar Tris. Zet de pomp uit net voordat de Tris buffer is doorgelopen om uitdroging van de hars te voorkomen.

Afvloeiing kan worden weggegooid en vervangen door een 48-put verzamelplaten. Breng alle te zuiveren monsters over naar de Q Sepharose-kolommen op de eerste rij en gebruik een dunne plastic roerder om de monsters en de kralen ongeveer twee minuten te mengen voordat u de vacuümpomp inschakelt. Bewaar of bevries uw doorstroming voor latere analyse.

Was de kolommen met een open verzamelplaat twee keer met twee mil van 10 millimolar Tris. Vervang de open opvangplaten door de 96-putplaat. De eerste elutiefractie kan worden verzameld in de eerste rij of in de tweede rij.

Om in de tweede rij te elute, verwijder de spuit plunjers uit deze posities. Plaats de Q Sepharose-kolommen in deze posities en plaats vervolgens spuitzuigers in de open kolommen in de eerste rij. Pipet een milliliter van de eerste zoutconcentraties in de Q Sepharose kolommen.

Zet de pomp aan en verzamel de elutie. Om de volgende elutie te verzamelen, verwijdert u de zuigers van de spuit uit de volgende posities, verplaatst u de Q Sepharose-kolommen in deze posities en vervangt u de plunjers in de vorige posities. Herhaal deze stappen voor elke opeenvolgende zoutconcentratie die wordt gebruikt om te elute.

Zorg ervoor dat voor elke vier elutions een nieuwe opvangplaat wordt gebruikt en dat elke plaat wordt geëtiketteerd en opgeslagen. Was met een open verzamelplaat de kolommen met twee mil van vier molaire natriumchloride, 10 millimolar Tris. Pipet twee mil van 20%ethanol en voer dit door totdat het net boven de kralen is en sluit vervolgens de kolommen af voor opslag.

Als voorbeeld, de MCPA heeft met succes gezuiverd 14 AbpSH3 mutanten in denaturering voorwaarden door een nikkel-NTA. Een kleine verontreiniging is te zien bij 25 kilodalton, hoewel het eiwit nog grotendeels zuiver is. De kleine verontreinigingen die in denatureringsomstandigheden worden waargenomen, worden verwijderd in inheemse omstandigheden.

Dit werd getoond toen 11 verschillende SH3-domeinen werden gezuiverd. Hieruit blijkt dat de MCPA kan worden gebruikt voor het vergelijken van zuiveringsomstandigheden. AbpSH3 kan worden gescheiden van de meeste verontreinigingen via ionenuitwisselingszuivering van lysaten.

Goede opbrengsten van aanzienlijk zuiver AbpSH3-eiwit werden teruggewonnen met verschillende verontreinigingen met een hoger molecuulgewicht. Zuivering van monsters na nikkel-NTA met behulp van ionenuitwisseling met de MCPA heeft deze hooggewicht verontreinigingen met succes verwijderd. Hoewel er nog steeds een lichte verontreiniging is, zijn de fracties nog steeds grotendeels zuiver en hebben ze goede biofysische gegevens opgeleverd met behulp van NMR- en thermische chemische denaturatietesten.

Concluderend, onze resultaten tonen aan dat onze hypothese correct is en dat de MCPA met succes milligramhoeveelheden eiwitten kan zuiveren met behulp van verschillende chromatografietechnieken. Het MCPA-systeem kan op meerdere manieren binnen dezelfde uitvoeringen worden geconfigureerd om de zuiveringsomstandigheden te optimaliseren. De installatie is eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk om onervaren gebruikers te trainen, vooral in laboratoria die eiwitten niet routinematig zuiveren.