Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

Ons protocol maakt een efficiënte identificatie mogelijk van gen- of gencombinaties die kankerinvasie in de kijker blokkeren. over cultuur vereist geen geavanceerde dierlijke faciliteiten voor onderhoud. Als geheel kunnen als generieke of algemene speciale bibliotheken binnen enkele weken in de kijker worden gescreend.

Dit over screeningssysteem zal onderzoekers helpen nieuwe therapeutische gendoelen of gendoelencombinaties te ontdekken die kunnen worden gebruikt om kankermetastasen te blokkeren. Voor IV-injectie, concentraatcellen tot 0,5 tot 1 miljoen cellen per milliliter, met behulp van ijskoude 1X PBS om de cellen te verdunnen of opnieuw op te schorten. Verwacht dat er ongeveer één milliliter celsuspensie nodig is voor elke 10 embryo's.

Om het injectieapparaat te monteren, monteert u een naald op de spuit en verlengt u de spuitnaald met een drie tot vijf centimeter lang stuk slang. Breek de punt van de borosilicaatnaald met een fijne tang. Laad de spuit met 50 tot 200 microliter van de suspensie van de kankercel.

En steek de borosilicaatnaald in de slang. Inspecteer de naald op celverstopping en luchtbellen. Als celverstopping in het capillair wordt waargenomen, verwijdert u het capillair, schorst u de cellen opnieuw en vervangt u het door een nieuw capillair.

Gebruik de zuiger om eventuele bellen naar buiten te duwen. Verwijder het deksel van het deksel en breng het embryo onder de stereoscoop over. Identificeer de juiste ader die op het CAM-oppervlak moet worden geïnjecteerd; deze is normaal gesproken slechts iets breder dan de diameter van de naaldpunt van de borosilicaat en bevindt zich halverwege tussen het embryo en de wand van de weegschaal.

Het is over het algemeen gemakkelijker om te injecteren op het punt direct grenzend aan de ader bifurcatie. Druk de punt van de naald tegen de bloedvatwand en oefen zachte druk uit in dezelfde richting als de bloedstroom. Gebruik indien nodig een wattenstaafje om het geïnjecteerde vat te helpen verankeren of stabiliseren.

Druk de zuiger van de spuit voorzichtig 2 tot 10 seconden in totdat het gewenste volume is geïnjecteerd. Gooi het embryo weg als er overmatige bloedingen of duidelijke vochtophoping op de injectieplaats verschijnen. Verwijder de naald van de CAM en dep de injectieplaats voorzichtig met een wattenstaafje om bloed of overtollige kankercellen te verwijderen.

Bedek het geïnjecteerde embryo in de weegschaal met het deksel en breng het terug naar de incubator. Herhaal de procedure totdat alle embryo's zijn geïnjecteerd. Inspecteer de embryo's visueel op bacteriën of schimmelbesmetting of overlijden.

En gooi besmette embryo's weg volgens laboratoriumverwijderingsprocedures. Zorg ervoor dat gemetastaseerde kolonies uniform van vorm lijken tijdens de eerste één tot drie dagen na de injectie. En identificeer invasieve of niet-invasieve gemetastaseerde kolonies op dag vier tot vijf na de injectie.

Verwijder op dag vijf na de injectie de embryo's uit de incubator en inspecteer en lokaliseer de embryo-CAMs voor gemetastaseerde kolonieverdeling. Trek onder de dissectiemicroscoop voorzichtig het CAM-weefsel dat de gemetastaseerde kolonie van belang bevat naar boven met behulp van een fijne tang en snijd het af met een chirurgische schaar. Breng het CAM-weefsel over in een lege, steriele buis van 1,5 milliliter en sluit het buisdeksel.

Herhaal de excisieprocedure totdat alle kolonies van belang in afzonderlijke buizen zijn verzameld. Gehakt het CAM-weefsel voorzichtig in een microcentrifugebuisje, met behulp van een aparte steriele naald van 18 gauge voor elke kolonie. Voeg 100 microliters 1X collageen-A oplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Draai de cellen en cam weefsel op 300 keer G gedurende vijf minuten bij omgevingstemperatuur. Aspireer de collageen-A oplossing en re-suspend de cellen onvolledige media voor de cel lijn van belang. Draai vervolgens de cellen en het weefsel opnieuw.

S hang cellen en weefselstukken opnieuw op in één milliliter volledige media en selectiefactor, indien aanwezig. Breng vervolgens goed over in een enkele 12-well tissue kweekschaal. Controleer de kankercellen de komende één tot drie weken dagelijks op groei en besmetting.

Wanneer de cellen 70 tot 80% van de samenvloeiing bereiken, breng ze dan over in een groter volume kweekschaal. Ga verder met sequencing of de volgende selectieronde, zodra voldoende kankercelnummers zijn bereikt. Embryo's die een opeenhoping van kankercellen vertonen als gevolg van een mislukte injectie, zijn te zien in de meeste haarvaten.

Wanneer de optimale celconcentratie en de duur van de injectie wordt bereikt, moeten dag vijf transduceerde cellen na injectie een breed scala aan koloniefenotypen produceren, waarbij de meerderheid van de kolonies invasief is, zoals bepaald door de kankercellen die verspreid in het CAM-weefsel verschijnen. Er moet aandacht worden besteed aan de gemetastaseerde kolonies die compact lijken en zich ver genoeg van naburige kolonies bevinden dat ze kunnen worden verwijderd met een tang en een schaar en een stuk CAM-weefsel. Een geïsoleerde positieve schermhit moet het compacte koloniefenotype weergeven bij herinjectie.

Voor het meten van de contacten met de bloedvaten van kankercellen moet aandacht worden besteed aan de helderheid van de vaatwandvlek en moet de juiste hoeveelheid lectines worden geïnjecteerd voor het vaatwandsignaal. Vermijd bij het proberen van dit protocol onder of over injectie en verwijder overmatige bloedingen of vochtophoping. Verschillende nieuwe genen die kankercelinvasie in de kijker stimuleren, zijn geïdentificeerd met behulp van deze techniek.