Name: Beeldvorming van Podocytische eiwitten Nephrin, Actine en Podocine met expansiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Leer expansiemicroscopie voor visualisatie van glomerulaire eiwitten met nanoschaalresolutie op conventionele microscopen. Deze toegankelijke methode bereikt 70 nm resolutie voor gedetailleerd celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Blanka Duvnjak en Nikola Kuhr bedanken voor hun uitstekende technische bijstand.

1. Splitsen en zaaien van cellen
<ol><li>Warm steriel Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) op, inclusief 10% foetale kalfsserum (FCS), steriele Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en steriele trypsine tot 37 °C. Activeer de schone bank.</li>
	<li>Bereid een 6-put plaat voor door één steriele glazen afdekplaat (10 mm) aan elke put toe te voegen met behulp van steriele tang.</li>
	<li>Leg een celkweekschaal van 10 cm met Cos7 cellen onder de schone bank. Zuig onder de schone bank het medium van de cellen aan met behulp van een vacuümapparaat.</li>
	<li>Houd de geanguleerde celkweekschaal in één hand en voeg 10 ml steriel PBS toe aan de zijkant van de celkweekschaal om te voorkomen dat cellen worden afspoeld. Leg de celkweekschaal neer zodat PBS de complete celkweekschaal spoelt.</li>
	<li>Verwijder de PBS en voeg 1 ml trypsine toe aan het midden van de celkweekschaal en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Stop de trypsinisatiereactie door 10 ml DMEM toe te voegen, inclusief 10% FCS en pipetteer de celoplossing op en neer met een pipettor om de cellen handmatig te scheiden.</li>
	<li>Analyseer het celnummer per milliliter met behulp van een telkamer.</li>
	<li>Zaai 68.000 cellen in 2 ml medium per put op de glazen afdekplaten in de 6-putplaat. Verdeel de cellen binnen de 6-put plaat door de plaat voorzichtig horizontaal en verticaal te schudden. OPMERKING: Cellen moeten verspreid liggen.</li>
	<li>Incubeer de cellen 's nachts in een incubator van 37 °C met 5% CO2.</li>
</ol>2. Transfectie van cellen
<ol><li>Bereid twee steriele buizen van 1,5 ml (één voor verdund DNA (A) en één voor verdund reagens voor kationische lipidetransfectie (B)). Pipet 0,75 μg nefhrine en 0,75 μg podocine cDNA expressie plasmide per put in één buis van 1,5 ml en verdun het tot 100 μL gereduceerd serummedium per put. Voeg 3 μL kationisch lipidetransfectiereagens per put toe aan de tweede buis van 1,5 ml en verdun met 100 μL gereduceerd serummedium. Incubeer beide reacties gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Combineer beide reacties (A en B) op een DNA-lipidencomplex en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg voorzichtig 200 μL van het DNA-lipidencomplex toe aan elke put.</li>
	<li>Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur zonder het medium te veranderen.</li>
</ol>3. Immunolabeling van cellulaire structuren
<ol><li>Bereid een fixatieoplossing (4% (m/v) paraformaldehyde in PBS, 1 ml/put), de permeabilisatieoplossing (0,5% (m/v) Triton X-100 in PBS, 1 ml/put) en een blokkerende oplossing (5% (v/v) runderserumalbumine in PBS, 1 ml/put).</li>
	<li>Verwijder het medium met een vacuümapparaat. Voeg 2 ml PBS toe aan elke put om extra medium te verwijderen. Aspireer de PBS volledig. OPMERKING: Om te voorkomen dat cellen met PBS worden wegspoelen, moet u PBS niet direct op de glazen afdekstrip gieten.</li>
	<li>Fix cellen met 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) opgelost in PBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur. OPMERKING: Als alternatief kunt u cellen fixeren in 3% (v/v) glyoxal-ethanol18.</li>
	<li>Gooi PFA weg en was de cellen tweemaal in PBS (elk 2 ml) door directe pipetten op de glazen afdekstrips te vermijden. Permeabiliseer de vaste cellen met Triton X-100 0,5% (w/v) in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de permeabilisatieoplossing en was tweemaal met PBS zoals aangegeven in stap 3.2.</li>
	<li>Blokkeer de cellen door 1 ml 5% (v/v) BSA toe te voegen in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer de cellen met 200 μL van het primaire antilichaam (anti-podocine-antilichaam 1:200 in 1% (v/v) BSA in PBS) 's nachts bij 4 °C. OPMERKING: U kunt het primaire antilichaam ook gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Verwijder het primaire antilichaam en was driemaal met PBS zoals in stap 3.2. Voeg het secundaire antilichaam (geitenanti-konijn Alexa 488 1:1000 in 1% (v/v) BSA in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur toe. Houd de cellen in het donker met behulp van een doos.</li>
	<li>Gooi het secundaire antilichaam weg en was drie keer met PBS.</li>
	<li>Verwijder PBS en incubeer de cellen met 200 μL anti-nefronantilichaam 1:100 in 1% (v/v) BSA in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Drie keer wassen met PBS. Houd de cellen in het donker met behulp van een doos.</li>
	<li>Verwijder PBS en incubeer met het secundaire antilichaam ezel anti-cavia 633, 1:200, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Drie keer wassen met PBS. Houd de cellen in het donker met behulp van een doos.</li>
</ol>4. Expansiemicroscopie
<ol><li>Voorbereiding
	<ol>
<li>Om de afstandhouders voor de gelatiekamer te vormen, schuift de glazen afdekking #1,0 en #1,5 in strepen van 5 mm (elk vier per glasschuif) met behulp van een diamantmes. Plaats de #1,5 mm afdekstrips zo dat ze een vierkant van 2,5 cm lengte vormen op een glazen glijbaan en plaats ze in een kleurkamer (Afbeelding 2A1-C1). Pipetteer een druppel ddH2O in de hoeken van het vierkant om de schuifstrepen van de glazen afdekking aan elkaar en aan de glazen schuif te hechten (Afbeelding 2A2-C2). OPMERKING: Vermijd het volledig drogen van ddH2O, omdat de hechtkracht verloren gaat. Breng indien nodig meer druppels ddH2O aan. Wacht ongeveer 20 minuten, zodat #1,5 mm afdekstroken stabiel worden bevestigd voordat u begint met stap 4.1.2.</li>
		<li>Plaats vier #1,0 glazen afdekstrips per afdekstrip op de #1,5 mm afdekstrips. Hecht de strepen door op elke #1,5 mm afdekstrip een druppel te pipetten (afbeelding 2A3-C3). OPMERKING: De dikte van de gel moet ten minste 0,15 mm zijn om de hantering in de voortgang van het protocol te vergemakkelijken. Om echter overmatige gel bovenop de cellen te voorkomen, houdt u de hoogte van de afstandhouders dicht bij het celsubstraat. Door #1,5 en #1,0 afdekstrips als afstandhouders te gebruiken, wordt de hoogte van de afstandhouders ongeveer 0,3 mm. De cellen hechten zich aan het afdekglas (hoogte 0,12 mm). Daarom zal de gel dik genoeg zijn om te hanteren, maar overmatige gel bovenop de cellen wordt vermeden met behulp van #1.0 en #1,5 bedekken glazen strepen als afstandhouders.</li>
		<li>Wikkel voor het deksel van de gelatiekamer een afdekglas (#1,5) in met paraffinefilm. Vermijd plooien of vuil op de paraffinefilm(afbeelding 2A5-C5).</li>
	</ol></li>
	<li>Verankering en polymerisatie (gelatie)
	<ol>
<li>Bereid de verankeringsbuffer voor (zie tabel 1). Vervang PBS voor de verankeringsbehandeling door 250 μL verankeringsbuffer per put direct op de glazen afdekslip en incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Houd het substraat in het donker met behulp van een doos. OPMERKING: U kunt ook 's nachts op kamertemperatuur incuberen. Bereid voor elk experiment een nieuwe verankeringsbuffer voor en wacht 10-15 minuten totdat deze goed is opgelost. 6-(Acryloyl)amino)hexaanzuur, succinimidylester (AcX) moet elke 4-5 maanden worden vervangen om voldoende verankering te garanderen.</li>
		<li>Verwijder de verankeringsbuffer en was eenmaal met 1,5 ml PBS per put.</li>
		<li>Om actinevezels te beitsen, ontdooit u een ExM-compatibele falloïdineoplossing en incubeert u de phalloïdine (5 μL phalloïdine verdund in 195 μL van 1% (v/v) BSA in PBS/well) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar monsters in het donker met behulp van een doos.</li>
		<li>Los ondertussen natriumacrylaat op in ddH2O met behulp van een roerapparaat. Bereid op ijs de monomeeroplossing voor (zie tabel 1). OPMERKING: Opgelost natriumacrylaat moet een heldere en kleurloze oplossing zijn. Als de oplossing geel is, vervang dan door nieuw natriumacrylaat.</li>
		<li>Bereid de geleeroplossing op ijs (zie tabel 1). Pipet ammoniumperoxidsulfaat (APS) in de geleeroplossing vlak voordat de geleeroplossing op de gelatiekamer wordt aangebracht.</li>
		<li>Verwijder phalloïdine uit de cellen en was tweemaal met 1,5 ml PBS op kamertemperatuur. Laat 1,5 ml PBS in de put om het verwijderen van het monster op de glazen afdekslip te vergemakkelijken.</li>
		<li>Plaats de cellen op het afdekglas in de geleerkamer met behulp van een tang en een canule om de glazen slip van de 6-putplaat op te tillen. OPMERKING: De cellen moeten zich op de bovenkant van de glazen afdekstrip zitten. De glazen afdekstrip mag de afstandhouders niet raken.</li>
		<li>Voeg binnenkort APS toe aan de geleeroplossing en vortex. Pipet 200 μL geleeroplossing op het monster (figuur 2A4-C4). Sluit voorzichtig de gelatiekamer door luchtbellen in de gel te vermijden(afbeelding 2A5-C5).</li>
		<li>Incubeer de geleerkamer gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C om de gel in de natte kleurkamer te polymeriseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogenisatie (spijsvertering)
	<ol>
<li>Haal de kleurkamer uit de couveuse. Om het deksel van de gelatiekamer te openen, introduceert u een scheermesje tussen het deksel en de afstandhouders. Verwijder het deksel voorzichtig. Verwijder de afstandhouders met het scheermesje en elimineer alle extra gel door het met het scheermesje te snijden.</li>
		<li>Doe de glijbaan met de gel en dek glas af in een schaal gevuld met PBS. Door zachtjes te schudden, verwijdert u het losgemaakte afdekglas uit de gel. Om de gel gemakkelijk uit de schaal te verwijderen, plaatst u de glijbaan onder de gel om de gel aan de glijbaan te bevestigen.</li>
		<li>Verdeel de gel met de gel op de glijbaan in kleine stukjes (een kwart van de gel is verdeeld in twee tot drie stukken) met behulp van het scheermesje. Duw voorzichtig een stuk gel in een put van een 6-well plaat met glazen bodem en vouw het in een penseel. Houd de gel gehydrateerd met een beetje PBS met behulp van de kwast om uitdroging van de gel te voorkomen. OPMERKING: De cellen kijken naar beneden.</li>
		<li>Maak met behulp van een omgekeerde microscoop overzichtsfoto's met een laag numeriek diafragma om de expansiefactor na uitbreiding te bepalen.</li>
		<li>Bereid de spijsverteringsbuffer voor (zie tabel 1). Verdun Proteinase K tot 4 U/ml in de spijsverteringsbuffer om de spijsverteringsoplossing te ontvangen. OPMERKING: De spijsverteringsbuffer zonder Proteinase K kan 1-2 weken bij 4 °C worden bewaard.</li>
		<li>Voeg 500 μL van de vergistingsoplossing toe aan elke put en dompel de gel onder in de oplossing. Laat het 's nachts verteren bij kamertemperatuur en sluit het deksel om de monsters in het donker te houden. OPMERKING: U kunt het ook 1 uur laten verteren bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Uitbreiding
	<ol>
<li>Verwijder de vergistingsoplossing met een pipet en gooi deze weg. Voeg 1 ml ddH2O toe. Incubeer de ondergedompelde gel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het water en voeg 1 ml verse ddH2O toe. Wacht 10 minuten en blijf elke 10 minuten water uitwisselen totdat een plateau van expansie is bereikt. OPMERKING: Monsteruitbreiding tot 4,5-voudig is haalbaar. De gel wordt optisch helder.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging
	<ol>
<li>Haal het water uit de gel en start direct met de microscopie. Gebruik met behulp van een omgekeerde microscoop voornamelijk een luchtdoelstelling (lage vergroting) om afgebeelde cellen in de pre-expansietoestand te vinden (stap 4.3.4).</li>
		<li>Schakel over naar een 40x (olie/water) en 63x objectief voor een betere resolutie. Prikkel met de golflengte van belang en neem het beeld via de camera.</li>
	</ol></li>
	<li>Validatie
	<ol>
<li>Maak een overzichtsafbeelding van het voorbeeld. Zoek en match dezelfde structuren in het voorbeeld die zijn afgebeeld in stap 4.3.4. Gebruik het kanaal met de beste signaal-ruisverhouding voor validatie (figuur 3 A-B). OPMERKING: Pas de beeldparameters aan om een vergelijkbare helderheid te bereiken als in het beeld dat is verkregen in de niet-uitgebreide toestand (stap 4.3.4).</li>
		<li>Overlay pre- en post-uitbreiding beelden door ze te roteren en te verschuiven met ImageJ. Gebruik het afstandsmeetinstrument in ImageJ om de afstanden tussen duidelijk identificeerbare structuren te meten. Meet ten minste 10 verschillende structuren. OPMERKING: U kunt ook een Python-script gebruiken om afstanden te meten zoals beschreven in14.</li>
		<li>Bereken de expansiefactor door post-/pre-expansiemetingen te delen.</li>
		<li>Om vervormingen te bepalen, maak je foto's met een hoger numeriek diafragma (figuur 4A-B). Overlay deze afbeeldingen en analyseer ze met ImageJ of zoals beschreven in15. OPMERKING: De bepaling van vervormingen moet routinematig worden uitgevoerd, maar niet noodzakelijkerwijs op elk monster.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Matsushita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts%3A+a+collaborative+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li>
<li>Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+up%3A+regulation+of+podocyte+structure+and+function+by+components+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+nephrin%2C+podocin%2C+and+the+actin+cytoskeleton+-+Evidence+for+a+role+in+podocyte+foot+process+formation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation.</a> American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).</li>
<li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein+-+nephrin+-+is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li>
<li>Huber, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocin-mediated+recruitment+of+nephrin+into+lipid+rafts+is+required+for+efficient+nephrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8(2003).</li>
<li>Boute, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHS2%2C+encoding+the+glomerular+protein+podocin%2C+is+mutated+in+autosomal+recessive+steroid-resistant+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.</a> Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).</li>
<li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy at a glance.</a> Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Testa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+nanoscopy+in+fixed+and+living+cells+by+exciting+conventional+fluorophores+with+a+single+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).</li>
<li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+principles+and+uses+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+optimization+in+X10+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> Embo Reports. 19 (9), (2018).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanoscale+optical+imaging+of+mouse+and+human+kidney+via+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10396(2018).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Rinschen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+deep+mapping+of+the+cultured+podocyte+proteome+uncovers+shifts+in+proteostatic+mechanisms+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).</li>
<li>Asano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%3A+protocols+for+imaging+proteins+and+RNA+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+RNA+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Gambarotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructures+using+expansion+microscopy+%28U-ExM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM).</a> Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+clinical+specimens+using+pathology-optimized+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

De gepresenteerde methode stelt de onderzoeker in staat om cellulaire eiwitten te visualiseren, bijvoorbeeld podocine, nefhrine en cytoskeletcomponenten, bijvoorbeeld F-actine. Binnen dit protocol worden getransfecteerde cos7-cellen gebruikt als model om de interactie van spleetmembraaneiwitten met F-actine te bestuderen. Helaas drukken vereeuwigde podocytcellijnen onvoldoende endogene hoeveelheden spleetmembraaneiwitten uit19.
Met deze methode kunnen cellulaire eiwitte...

Albuminurie is een surrogaatparameter van cardiovasculair risico en is het gevolg van verstoring van het glomerulaire filter1. Het glomerulaire filter bestaat uit het fenestrated endotheel, het glomerulaire keldermembraan en het spleetmembraan gevormd door podocyten. Primaire en secundaire voetprocessen van podocyten wikkelen zich rond de capillaire wand van het glomerulum2. De delicate structuur van voetprocessen wordt gehandhaafd door corticale actinebundels die ook dienen als ankers voor meerdere spleetmembraaneiwitten en andere adaptereiwitten2. Het ruggengraateiwit van het spleetmembraan wordt nefhrine genoemd en interageert op een homofiele manier met nefhrinemoleculen van tegengestelde podocyten. Via diverse adaptereiwitten is nefhrine gekoppeld aan het actinecytoskelet2,3. Mutaties in het nefrine-coderende gen NPHS1 leiden tot nefrotisch syndroom van het Finse type4.
Een van de interacterende eiwitten van nephrin is podocine, een haarspeldachtig eiwit van de stomatinefamilie3. Podocin rekruteert nephrine aan lipidenvlotten en koppelt het aan het actinecytoskelet5. Podocine is gecodeerd door het NPHS2 gen. Mutaties in NPHS2 leiden tot steroïde-resistent nefrotisch syndroom6.
Om actineadaptereiwitten te visualiseren en te co-lokaliseren, kunnen immunofluorescentietechnieken worden gebruikt. Helaas beperkt de diffractiebarrière van het licht de resolutie van conventionele fluorescentiemicroscopen tot 200-350 nm7. Nieuwe microscopietechnieken, bijv. gestimuleerde emissiedepletie (STED)8, fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM)9, stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM of dSTORM) of aardtoestandverwijderingsmicroscopie gevolgd door individuele molecuulretour (GSDIM)9,10,11, maken een resolutie tot ongeveer 10 nm mogelijk. Deze superresolutietechnieken vereisen echter zeer dure microscopen, goed opgeleid personeel en zijn daarom niet beschikbaar in veel laboratoria.
Expansion microscopy (ExM) is een nieuwe en eenvoudige techniek die superresolutiebeeldvorming met conventionele microscopen mogelijk maakt en mogelijk beschikbaar is voor een grote onderzoeksgemeenschap12. Bij eiwitretentie-expansiemicroscopie (proExM) wordt het interessemonster (cellen of weefsel) gefixeerd en gekleurd met fluoroforen13. Eiwitten in het monster worden vervolgens covalent verankerd door een klein molecuul (6-((Acryloyl)amino)hexaanzuur, succinimidylester, AcX) in een opzwepbare hydrogel13. Door enzymatische vertering met proteïnase K (ProK) behouden eiwitten en fluoroforen hun relatieve positie in de gel na expansie13. Na zwelling van de gel breidt het monster zich uit tot 4,5-voudig (90-voudige volumetrische expansie) wat leidt tot een effectieve laterale resolutie van ongeveer 60-70 nm (300 nm/4,5). Aanpassingen van deze techniek kunnen zelfs een 10-voudige uitbreiding (1.000-voudige volumetrische expansie) mogelijk maken, waardoor een resolutie van 20-30 nm op conventionele microscopen14,15,16wordt weergegeven.
Glomerulaire structuren van muis en menselijke nieren zijn gevisualiseerd via ExM17. In dit artikel presenteren we een gedetailleerd proExM-protocol om superresolutiebeelden van F-actine en de actineadapter eiwitpodocine in cellen te visualiseren met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td><td></td></tr><tr><td>6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE</td><td>invitrogen</td><td>A-20770</td><td>bewaar maximaal 4 maanden</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Deckgl&auml;ser (dekglazen)</td><td>Engelbrecht</td><td>K12432</td><td>24x32mm #1.0</td></tr><tr><td>Diamantschijf</td><td>VWR</td><td>201-0392</td><td>voor het snijden van dekglasjes</td></tr><tr><td>Guanidine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272-100G</td><td>8M Stock kan op RT worden bewaard</td></tr><tr><td>Marten haarborstel</td><td>Leon Hardy</td><td>3 (770)</td><td></td></tr><tr><td>"Menzel" Deckgl&auml;ser (dekglazen)</td><td>Thermo Fischer</td><td>15654786</td><td>24x24mm #1.5</td></tr><tr><td>N,N`-Methylenbisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Objekttr&auml;ger UniMark</td><td>Marienfeld</td><td>703010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acrylaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408220</td><td>zuiverheid controleren</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Kleurkamer</td><td></td><td></td><td>geproduceerd in de werkplaats van de universiteit</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>ROTH</td><td>2367.1</td><td></td></tr><tr><td>6-Well glazen bodemplaten</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin-ExM 546</td><td>chrometra</td><td>niet beschikbaar</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Anti Podocin geproduceerd in konijn</td><td>Sigma</td><td>P-0372-200UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Donkey anti guinea-pig CF633</td><td>Sigma</td><td>SAB4600129-50UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Goat anti konijn 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11034</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Guinea pig anti nephrine</td><td>Origene</td><td>BP5030</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AXIO Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>niet beschikbaar</td><td></td></tr></tbody></table>

beeldvorming van podocytische eiwitten nephrin, actine en podocine met expansiemicroscopie

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Verstoring van het glomerulaire filter bestaande uit het glomerulaire endotheel, glomerulair keldermembraan en podocyten, resulteert in albuminurie. Podocyte voetprocessen bevatten actinebundels die zich binden aan cytoskeletadaptereiwitten zoals podocine. Deze adaptereiwitten, zoals podocine, verbinden de ruggengraat van het glomerulaire spleetdiafragma, zoals nefhrine, met het actinecytoskelet. Het bestuderen van de lokalisatie en functie van deze en andere podocytische eiwitten is essentieel voor het begrijpen van de rol van het glomerulaire filter bij gezondheid en ziekte. Het gepresenteerde protocol stelt de gebruiker in staat om actine, podocine en nefhrine te visualiseren in cellen met superresolutiebeeldvorming op een conventionele microscoop. Ten eerste worden cellen gekleurd met een conventionele immunofluorescentietechniek. Alle eiwitten in het monster worden vervolgens covalent verankerd aan een zwelbare hydrogel. Door de spijsvertering met proteïnase K worden structurele eiwitten gespleten waardoor isotropische zwelling van de gel in de laatste stap mogelijk is. Dialyse van het monster in water resulteert in een 4-4,5-voudige uitzetting van het monster en het monster kan worden bekeken via een conventionele fluorescentiemicroscoop, waardoor een potentiële resolutie van 70 nm ontstaat.

Het concept en de timing van dit proExM-protocol zijn weergegeven in figuur 1. Op dag 5 worden getransfecteerde cellen gefixeerd en gekleurd met fluorescerende antilichamen die gericht zijn op het eiwit van belang (figuur 1A,B). Op dag 6 leidt behandeling met AcX tot vorming van aminegroepen op alle eiwitten (inclusief fluoroforen) (Figuur 1A,B)12</...

De gepresenteerde methode maakt visualisatie van fluorescerend gelabelde cellulaire eiwitten met expansiemicroscopie mogelijk, wat leidt tot een resolutie van 70 nm op een conventionele microscoop.

Beeldvorming van Podocytische eiwitten Nephrin, Actine en Podocine met expansiemicroscopie

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Dit microscopische expansieprotocol stelt de onderzoeker in staat om glomerulaire eiwitten met nanoschaalresolutie te visualiseren op een conventionele microscoop. Het belangrijkste voordeel van expansiemicroscopie is dat het toegankelijk is voor een grote onderzoeksgemeenschap. Begin met het maken van afstandhouders voor de gelatiekamer.Gesneden nummer één en nummer 1.5 glazen deksel glijdt in vijf millimeter strepen, met behulp van een diamantmes. Plaats een glazen schuif in een kleurkamer en plaats het nummer 1.5 afdekstripstrepen op de glazen glijbaan, zodat deze een vierkant van 2,5 centimeter vormen. Pipetteer een druppel dubbel gedestilleerd water in de hoeken van het vierkant om de schuifstrepen van de glazen hoes aan elkaar en aan de glazen glijbaan te hechten.Wacht ongeveer 20 minuten zodat de nummer 1.5 afdekstrips stabiel zijn bevestigd. Pipetteer een druppel water op elk nummer 1.5 afdekstrip. Plaats vier nummer één glazen afdekstripstrepen op de nummer 1.5 afdekstrips.Voor het deksel van de gelatiekamer wikkelt u een afdekglas in met paraffinefolie, waarbij plooien of vuil op de film worden vermeden. Verwijder voor de verankeringsbehandeling PBS uit de immuunbevlekte

imaging-podocytic-proteins-nephrin-actin-podocin-with-expansion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we describe a method called expansion pathology, a variant of expansion microscopy, wherein the clinical tissue specimens are chemically expanded using a polymer network for microscopic examination of nanoscale structures.

Expansion Pathology: A Method for High-resolution Optical Imaging of Clinical Tissue Samples

Veranderingen in de intracellulaire calciumniveaus in de podocyten zijn een van de belangrijkste middelen om de filtratiefunctie van glomeruli te beheersen. Hier leggen we een high-throughput benadering uit die detectie van real-time calciumverwerking en activiteit van enkele ionkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli mogelijk maakt.

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Hier presenteren we een protocol voor het lymfkliertest in vivo labelen van glomerulaire cel oppervlakte eiwitten met biotine. Dit protocol bevat informatie over hoe perfuse muis nieren, het isoleren van de glomeruli, en het uitvoeren van endogene immunoprecipitation van de proteïne van belang.

Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Nanoschaal beeldvorming van klinische weefselmonsters kan het begrip van ziekte pathogenese verbeteren. Expansie pathologie (ExPath) is een versie van expansie microscopie (ExM), aangepast voor compatibiliteit met standaard klinische weefselmonsters, om de nanoschaal configuratie van biomoleules te verkennen met conventionele diffractie beperkte microscopen.

Nanoscopische beeldvorming van menselijke weefsel secties via fysische en isotrope expansie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Hier wordt een nieuwe versie van expansiemicroscopie (ExM) gepresenteerd, Magnify, die is aangepast voor maximaal 11-voudige expansie, met behoud van een uitgebreide reeks biomolecuulklassen en compatibel is met een breed scala aan weefseltypen. Het maakt de ondervraging van de nanoschaalconfiguratie van biomoleculen mogelijk met behulp van conventionele diffractie-beperkte microscopen.

Universele moleculaire retentie met 11-voudige expansiemicroscopie

Dit manuscript beschrijft een tweestapsprotocol om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten via episomale herprogrammering in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en daaropvolgende differentiatie in podocyten.

Generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

De huidige protocollen beschrijven nieuwe beeldvorming van de hele montering voor de visualisatie van perifere structuren in de oculaire lens met methoden voor beeldkwantificering. Deze protocollen kunnen in onderzoeken worden gebruikt om de relatie tussen lensstructuren op microschaal en de ontwikkeling/functie van lenzen beter te begrijpen.

Beeldvorming van de hele montage om de perifere lensstructuur, celmorfologie en organisatie te visualiseren en te kwantificeren

Leer expansiemicroscopie voor visualisatie van glomerulaire eiwitten met nanoschaalresolutie op conventionele microscopen. Deze toegankelijke methode bereikt 70 nm resolutie voor gedetailleerd celbiologisch onderzoek.

Beeldvorming van Podocytische eiwitten Nephrin, Actine en Podocine met expansiemicroscopie

Meer video's verkennen