Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

Het darmmodel is een breed aanpasbare en fysiologische manier om te meten hoe lek de darm is en hoe leukocyten migreren in de darm bij muizen, in vivo. Deze methode helpt om mechanismen die ten grondslag liggen aan verhoogde darmpermeabiliteit en pathologische darmontsteking beter te begrijpen. De techniek kan worden gebruikt om te helpen bij het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de darmbarrièrefunctie en pathologische ontsteking, zoals te zien is bij colitis ulcerosa en de ziekte van Crohn.

Dit model maakt gebruik van een goed gevasculariseerd, exteriorized darmsegment, hetzij van het ileum of proximale dikke darm, voor het onderzoek van de darmbarrièrefunctie of immuuncelwerving bij muizen. Met deze brede toepassing kan het darmlusmodel inzicht geven in ziekten die het gevolg zijn van een lekkende darmbarrière en de ontstekingsreactie. Worstelingen kunnen worden overwonnen door de chirurgische stappen te oefenen.

Het is van cruciaal belang om een volledig gevasculariseerd darmsegment te buiten en geschikte locaties voor de ligaties te selecteren om bloedingen te voorkomen. Het intestinale lusmodel is een microchirurgische techniek, dus, net als bij andere chirurgische procedures, profiteert het enorm van visuele demonstratie en een stapsgewijze presentatie van de methode. Na het bereiken van een chirurgisch anesthesievlak, begin met het schrobben van de vacht van de buikmiddenlijn met alcoholdoekjes of een gaasspons gedrenkt in 70% ethanol.

Maak een breed stuk bont niet nat met alcohol om onderkoeling te voorkomen. Voer met een schaar een laparotomie in de middellijn uit. Maak een horizontale incisie in het midden van de buik en stel het buikvlies bloot, zorg ervoor dat u geen organen binnen de buik verwondt.

Plaats voorgesneden nat katoenen gaas over de blootgestelde intra-abdominale holte. Gebruik natte wattenstaafjes om het cecum te mobiliseren en te exterieuriseren en plaats het voorzichtig op nat katoenen gaas. Mobiliseer vervolgens en maak het ileum voorzichtig buiten.

Zet ten minste zes centimeter terminaal ileum in op het natte katoenen gaas zonder de mesenterische vaten en de bloedtoevoer te verstoren. Houd de blootgestelde weefsels te allen tijde vochtig met warme HBSS. Identificeer de grote slagader die het ileum levert in de mesenterie, dicht bij het cecum.

Zoek vervolgens twee ligatieplaatsen in de mesenterie die vrij zijn van kritieke bloedvaten. Pak het terminale ileum stevig vast met een stompe weefselduw en gebruik een fijne tip forceps om de mesenterie te fenestreren, waarbij bloedvaten worden vermeden. Plaats zijde hechtdraad over de perforatie en bind een chirurgische knoop om de eerste ligatie te creëren.

Gebruik de liniaal om vier centimeter afstand van de eerste ligatuur te meten en de tweede ligatuur te maken. Snijd voorzichtig naast elke ligatie met een fijne schaar om de vier centimeter ileale lus te isoleren, waardoor de bloedtoevoer en het mesenterische membraan intact blijven. Spoel de inhoud van het ileale lussegment voorzichtig door met warme HBSS met behulp van een flexibele gele voedingsbuis die aan een spuit van 10 milliliter is bevestigd.

Zorg ervoor dat u de luminale inhoud uit de buikholte spoelt om de chirurgische plaats schoon te houden. Ligateer de twee gesneden uiteinden van de doorgespoelde ileale lus met zijden hechtdraad. Gebruik een spuit van één milliliter met een naald van 30 gauge om langzaam 250 microliter reagens, zoals FITC-dextrans of chemokine, in het darmlumen te injecteren.

De ileale lus zal opblazen, waardoor een matige uitzetting van het slijmvlies ontstaat. Sluit de buikwand met een naaldhouder, anatomische tang en 3.0 niet-absorbeerbare zijden hechtingen met een omgekeerde snijnaald. Na het drogen van het dier om onderkoeling te voorkomen, plaatst u het in een temperatuurgereguleerde anesthesiekamer voor de incubatieperiode.

Bereid de muis voor op een operatie en maak het cecum buiten zoals eerder aangetoond. Gebruik natte wattenstaafjes, maak het hele ileum buiten en leg het bovenop een nat katoenen gaas. Identificeer de proximale dikke darm en de bloedtoevoer in de mesocolon.

Mobiliseer de proximale dikke darm en creëer de eerste ligatuur in een gebied vrij van vaten in de mesocolon op ongeveer 0,5 centimeter distaal van het cecum. Meet twee centimeter van de eerste ligatuur en creëer een tweede ligatuur op een gebied dat vrij is van bloedtoevoer in de mesocolon. Snijd met een fijne schaar voorzichtig naast elke ligatie om een twee centimeter lange pcLoop te isoleren.

Spoel de pcLoop voorzichtig door met warme HBSS om uitwerpselen te verwijderen met behulp van een flexibele gele voedingsbuis die aan een spuit van 10 milliliter is bevestigd. Zorg ervoor dat u de luminale inhoud uit de buikholte spoelt om de chirurgische plaats schoon te houden. Ligateer vervolgens de twee gesneden uiteinden van de doorgespoelde pcLoop met behulp van zijden hechtdraad.

Gebruik een spuit van één milliliter met een naald van 30 gauge om langzaam 200 microliter reagens, zoals FITC-dextran of chemokine, in het darmlumen te injecteren. De pcLoop zal opblazen, waardoor een matige uitzetting van het slijmvlies ontstaat. Gebruik natte wattenstaafjes om de ligated pcLoop, ileum en cecum voorzichtig terug te zetten.

Sluit de buikwand met een naaldhouder, anatomische tang en 3.0 niet-absorbeerbare zijden hechtingen met een omgekeerde snijnaald. Na de incubatieperiode euthanaseert u de verdoofde muis en verzamelt u weefsels voor analyse. Om de nauwkeurigheid van het I-lusmodel voor de beoordeling van de darmpermeabiliteit te verifiëren, werd een FITC-dextran pcLoop-test uitgevoerd om de rol van nauw junction geassocieerd eiwit Jam-a in de regulering van de darmbarrièrefunctie in vivo te evalueren.

Met het pcLoop-model werd een 2,5-voudige toename van fitc-dextran serumspiegels gekwantificeerd in Jam-a null muizen in vergelijking met controles. Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij muizen die selectief verlies van Jam-a op intestinale epitheelcellen herbergden. Het pcLoop-model werd gebruikt om polymorfonucleaire neutrofiel, of PMN, rekrutering in het darmslijmvlies en daaropvolgende transepitheliale migratie in vivo te bestuderen.

Het aantal PMN in de luminale inhoud van de pcLoop werd gekwantificeerd door flow cytometrie analyse. Het aantal PMN in het segment van de proximale dikke darm was laag onder fysiologische omstandigheden. Voorbehandeling met pro-inflammatoire cytokinen, TNF alfa en IFN gamma, voorafgaand aan de operatie, resulteerde in een verhoogd aantal PMN gerekruteerd in de pcLoop lumen.

Toediening van de PMN chemo attractant LTB4 leidde tot een dramatische toename van pmn tellingen. Immunohistochemische kleuring van PMN in het darmslijmvlies bevestigt de verhoogde rekrutering van PMN na stimulatie met cytokinen en LTB4. De bijdrage van Jam-a aan PMN transepitheliale migratie werd bestudeerd met behulp van het pcLoop-model op muizen die selectief verlies van Jam-a op intestinale epitheelcellen herbergen.

Verlies van epitheliale Jam-a leidde tot een verminderd aantal getransmigreerde PMN in het colonlumen in vergelijking met nestmaatcontroles. Een cruciaal aspect voor deze techniek is om te onthouden om de bloedtoevoer naar het buitenste darmsegment te behouden bij het uitvoeren van de operatie. Volgens dit protocol kunnen andere methoden zoals een intestinale permeabiliteitstest en een neutrofiele transepitheliale migratietest worden uitgevoerd om verlies van barrière-integriteit en darmontsteking in vivo te onderzoeken.