Name: Een pro-inflammatoire, degeneratieve orgaancultuurmodel om intervertebrale discusziekte in een vroeg stadium te simuleren. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Leer een pro-inflammatoire orgaancultuurmethode voor intervertebrale discusziekte onderzoek met behulp van bovine staartwervelschijven. Dit model simuleert de pathofysiologie en vermindert dierproeven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door AO Foundation en AOSpine International. Babak Saravi kreeg fellowship steun van de German Spine Foundation en de German Osteoarthritis Foundation. Gernot Lang werd ondersteund door het Berta-Ottenstein-programma voor gevorderde clinicuswetenschappers, faculteit geneeskunde, Universiteit van Freiburg, Duitsland.

Er werden experimenten uitgevoerd met runderstaarten die afkomstig waren van lokale slachthuizen. De biologische materialen die in de huidige studie worden gebruikt, zijn afkomstig uit de voedselketen en vereisen geen ethische goedkeuring in de Zwitserse en Europese wetgeving.
1. Dissectie van de tussenwervelschijf van runderen
<ol><li>Spoel de hele staart grondig af met leidingwater om vuil en haar op het oppervlak te verwijderen. OPMERKING: Bij intacte, distale uiteinden kunnen maximaal 9 IVD's (coccygeal 1-9) per staart worden gebruikt voor de experimenten, afhankelijk van de gewenste grootte van de IVD's. Gezien de gewenste diameter tussen 15-20 mm, gebruikten we 12 runderstaarten met 5 IVD's per staart voor de experimenten.</li>
	<li>Dompel de hele staart gedurende 10 minuten onder in een doos met 1% betadine-oplossing. Droog de staart kort met steriel gaas en leg deze op een steriel doekje. OPMERKING: Bevochtig tijdens het ontleden van de schijf de staarten met ringer's oplossing bevochtigd gaas om uitdroging te voorkomen. Bewaar de staarten (of overgebleven segmenten) gewikkeld in nat gaas totdat de hele dissectieprocedure is voltooid.</li>
	<li>Gebruik een scalpel (nr. 20) om het zachte weefsel zo volledig mogelijk uit de wervelkolom te verwijderen om de identificatie van de IVD's te vergemakkelijken. Verwijder de spineuze en transversale processen van de wervels met een botverwijderingstang. OPMERKING: Selecteer IVD's met de gewenste diameter. In het huidige onderzoek werden IVD's met een diameterbereik van 15-20 mm gebruikt.</li>
	<li>Snijd dwars met een bottang door het midden van elk wervellichaam om individuele bewegingssegmenten te verkrijgen. Doe bewegingssegmenten in een Petrischaal met gaas bevochtigd met de oplossing van Ringer.</li>
	<li>Lokaliseer de IVD en wervel door palpatie en door de bewegingssegmenten voorzichtig te bewegen. Maak twee parallelle sneden met de lintzaag in de groeiplaat van de IVD's, één aan elke kant van de IVD. Identificeer de locatie van de groeiplaat door de bolle plaats van het benige eindplaatdeel (hard) naast de schijf (zacht) aan te raken en te vinden met een veiligheidsafstand van ongeveer 0,5-1 mm van de IVD naar de wervel. Zorg ervoor dat het zaagblad van de lintzaag wordt gekoeld met de oplossing van Ringer tijdens het zagen van de wervels.</li>
	<li>Breng IVDs over in een schone petrischaal met schoon gaas bevochtigd met de oplossing van Ringer. OPMERKING: Het gaas moet bevochtigd en niet te nat zijn om zwelling van de IVD's te voorkomen,</li>
	<li>Gebruik het scalpelblad om het wervellichaam (rood/roze bot), groeiplaat (wit kraakbeen) af te schrapen, laat de eindplaat intact (geelroze). Maak de twee oppervlakken vlak en parallel voor de laadprocedure. Breng geschraapte IVDs over in een verse Petrischaal met gaas bevochtigd met ringer's oplossing. OPMERKING: Draag een kettingmailhandschoen om de hand te beschermen terwijl u de IVD vasthoudt en schraapt.</li>
	<li>Meet de schijfhoogte en diameter met een remklauw. Reinig de bloedstolsels in het wervelbeen met de oplossing van Ringer met behulp van een straalspoelingssysteem.</li>
	<li>Breng de IVD's over naar 50 ml plastic buizen, één IVD per buis. Voeg 25 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 10% penicilline/streptomycine (P/S) per IVD toe en laat het 15 minuten schudden op een orbitale shaker bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Aspireer het supernatant en voeg 10 ml PBS + 1% P/S per IVD toe gedurende 2 minuten om de IVD's te spoelen.</li>
</ol>2. IVD-cultuur en belasting
<ol><li>Breng schijven over naar IVD-kamers en voeg IVD-kweekmedium toe (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L hoge glucose DMEM voor de fysiologische groep en 2 g/L lage glucose DMEM voor de pathologische groep) + 1% P/S + 2% foetale kalfsserum + 1% ITS (bevat 5 μg/ml insuline, 6 μg/ml transferrine en 5 ng/ml seleninezuur) + 50 μg/ml ascorbaat-2-fosfaat + 1% niet-essentieel aminozuur + 50 μg/ml antimicrobieel agens voor primaire cellen) en in een incubator plaatsen bij 37 °C, 85% vochtigheid en 5% CO2.</li>
	<li>Kweek de schijven gedurende 4 dagen in een bioreactorsysteem volgens experimentele groepen16. Houd in de pathologische groep degeneratieve belastingsomstandigheden aan bij 0,32-0,5 MPa, 5 Hz gedurende 2 uur/dag. Gebruik in de fysiologische controlegroep een beladingsprotocol van 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz gedurende 2 uur/dag. OPMERKING: Plaats de IVD's tijdens de laadprocedures in kamers met 5 ml IVD-medium. Het volume is afhankelijk van de grootte van de laadkamers van de bioreactor. Plaats de IVD's tussen de beladingsprocedures in zesputplaten met 7 ml IVD-kweekmedium voor herstel van vrije zwelling.</li>
	<li>Voor het analyseren van de veranderingen in schijfhoogte tijdens de experimentele periode, meet u de schijfhoogte met een remklauw na IVD-dissectie (baseline) en vervolgens dagelijks na de vrije zwellingsperiode en na dynamische belasting voor de experimentele duur.</li>
</ol>3. Intradiscale tumor necrose factor-alfa (TNF-α) injectie
<ol><li>Direct na de eerste dynamische laadcyclus op dag 1 plaatst u de IVD's in een petrischaal in een verticale positie en stabiliseert u de IVD's met een pincet.</li>
	<li>Injecteer recombinant TNF-α (100 ng in 70 μL PBS per IVD) met een 30-gauge insulinenaald in het nucleus pulposusweefsel van de pathologische groep17. Injecteer langzaam met een snelheid van ongeveer 70 μL in 1 min.</li>
	<li>Trek na injectie de spuit halverwege terug in de IVD en trek aan de zuiger van de spuit om een vacuüm te creëren dat voorkomt dat de geïnjecteerde oplossing teruglekt, voordat u de naald en spuit volledig uit de IVD verwijdert. OPMERKING: Voer een proefexperiment uit door PBS met trypanblauwe kleurstof te injecteren om de verdeling van de geïnjecteerde oplossing na het laden en de nachtcultuur te evalueren.</li>
</ol>4. Genexpressie
<ol><li>Oogst de IVD's op dag 4. Verzamel het nucleus pulposus (NP) weefsel (gelly deel in het midden van IVD) met een biopsie punch. Verzamel de buitenste annulus fibrosus (AF) met een scalpelblad (nr. 20). OPMERKING: Verzamel voor de referentie van de uitgangswaarde op dag 0 onmiddellijk na dissectie weefsels voor RNA-extractie.</li>
	<li>Gebruik de hoeveelheid NP- of AF-weefsel die nodig is voor genexpressieanalyse, afhankelijk van het experimentele ontwerp. OPMERKING: Voor de huidige experimenten werd ongeveer 150 mg weefsel gebruikt. De verhouding tussen RNA-isolatieoplossing en weefselmassa moet ten minste 2 ml per 100-150 mg weefsel zijn voor een efficiënte extractie.</li>
	<li>Verteer het NP- of AF-weefsel met de verteringsoplossing (0,2% pronase in DMEM, filter gesteriliseerd) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met magnetisch roeren18.</li>
	<li>Flash-freeze de weefselmonsters met vloeibare stikstof en verpulveren tot een fijn poeder. Verdeel het verpulverde weefselpoeder gelijkmatig in twee buizen van 2 ml die elk 1 ml guanidinethiocyanat en fenol bevatten in een monofaseoplossing (RNA-isolatieoplossing).</li>
	<li>Voer de homogenisatie uit in buizen van 2 ml met de RNA-isolatieoplossing en het verpulverde weefselpoeder. Homogeniseer het weefselpoeder 5x met een roestvrijstalen bal van 8 mm en een tissue-lyzer bij 30 Hz gedurende 3 minuten. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g, 4 °C en breng het supernatant over in een verse buis. De supernatanten kunnen minstens één maand bij -80 °C worden bewaard.</li>
	<li>Voeg 0,1 ml 1-bromo-3-chloropropaan (BCP) per 1 ml RNA-isolatieoplossing toe en schud krachtig gedurende 15 s. Bewaar het resulterende mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een orbitale shaker en centrifugeer gedurende 15 min bij 4 °C op 12.000 x g. OPMERKING: Het RNA blijft uitsluitend in de bovenste waterfase.</li>
	<li>Breng de waterfase over in een verse buis en neerslag RNA met 0,25 ml isopropanol en 0,25 ml zoutrijke neerslagoplossing per 1 ml RNA-isolatieoplossing die wordt gebruikt voor initiële homogenisatie. Bewaar de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een orbitale shaker en centrifugeer gedurende 8 min bij 4 °C op 12.000 x g. OPMERKING: U kunt ook de kolomgebaseerde RNA-extractiemethode gebruiken, die over het algemeen leidt tot een hogere RNA-zuiverheid maar een lagere RNA-opbrengst.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en was de RNA-pellet met 1 ml 75% ethanol per 1 ml RNA-isolatieoplossing die wordt gebruikt voor initiële homogenisatie. Centrifugeer bij 7.500 x g gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de ethanolwas en droog RNA-pellet kort aan de lucht gedurende 3-5 minuten. Los het RNA op in 20 μL met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water door de oplossing een paar keer door een pipetpunt te laten lopen en gedurende 10-15 minuten bij 55-60 °C te broeden.</li>
	<li>Meet de absorptie bij respectievelijk 230 nm, 260 nm en 280 nm (A230, A260 en A280). A260 van 1,0 komt overeen met 40 μg/ml RNA. Er wordt een A260/A280-verhouding van 1,6-1,9 verwacht, terwijl verontreiniging resulteert in een A260/A280-verhouding van < 1,6.</li>
	<li>Bereid een reverse transcriptase (RT) reactiemix voor op een reactievolume van 20 μL. De mix bevat RT-enzymmix, ribonucleaseremmer, helpereiwit, primers, dNTPs, MgCl2,RNase-vrij water en 0,4 μg RNA-monster.</li>
	<li>Centrifugeer de RT-buizen kort om alle componenten aan de onderkant van de buis te mengen.</li>
	<li>Plaats de monsters in het thermocyclerinstrument. Selecteer het juiste programma voor de RT. Voer de RT gedurende 10 minuten uit bij 25 °C, gevolgd door de omgekeerde transcriptiestap gedurende 120 minuten bij 42 °C en inactivering van de omgekeerde transcriptase gedurende 5 minuten bij 85 °C, afkoelen tot 4 °C aan het einde.</li>
	<li>Verdun het resulterende cDNA met Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TE) buffer (10 mM Tris met 1 mM EDTA) tot een eindconcentratie van 0,4 μg RNA gebruikt voor RT per 100 μL cDNA-oplossing. Bewaar de cDNA-monsters bij -20 °C.</li>
	<li>Voer real-time polymerasekettingreactie (PCR) uit met een reactievolume van 10 μL. Het reactievolume bevat de mastermix (met DNA-polymerase, uracil-DNA-glycosylase, dNTPs met dUTP, passieve referentie en geoptimaliseerde buffercomponenten), voorwaartse primer 45 μM, reverse primer 45 μM, probe 12,5 μM (met een reporterkleurstof gekoppeld aan het 5'-uiteinde van de sonde, een klein groefbinder aan het 3'-uiteinde van de sonde en een niet-fluorescerende quencher aan het uiteinde van de sonde) , 2 μL cDNA en MET DEPC behandeld water.</li>
	<li>Voer een endogene controle (RPLP0) uit voor relatieve kwantificering met de methode 2-ΔΔCT 19.</li>
	<li>Voeg voorbeelden in duplicaten toe en voer een besturingselement zonder sjabloon uit door TE-buffer toe te voegen in plaats van cDNA. Voer PCR uit onder standaardomstandigheden (2 min bij 50 °C, 10 min bij 95 °C, 40 cycli van 15 s bij 95 °C en 1 min bij 60 °C).</li>
	<li>Voer relatieve kwantificering van mRNA-doelen uit volgens de vergelijkende CT-methode. De hoeveelheid mRNA die is genormaliseerd naar het uitgangsmonster wordt berekend als 2-ΔΔCT, terwijl ΔΔΔCT het verschil is tussen de ΔCT (CT-doel-CT-endogene controle) van het monster en ΔCT (CT-doel en CT-endogene controle) van het uitgangsmonster.</li>
</ol>5. Kwantificering van het eiwitgehalte in het IVD-medium
<ol><li>Verzamel het medium dat door de IVD-monsters wordt geconditioneerd om het eiwitgehalte in het medium te meten. Voer enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) uit volgens het protocol van het doeleiwit.</li>
	<li>Runderinterleukine-8 (IL-8) wordt gekwantificeerd door anti-bovine IL8 ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+for+328+diseases+and+injuries+for+195+countries%2C+1990-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).</li>
<li>Hoy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+global+burden+of+low+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Measuring the global burden of low back pain.</a> Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).</li>
<li>Thiese, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+low+back+pain+by+anatomic+location+and+intensity+in+an+occupational+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeletal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283(2014).</li>
<li>Katz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+Disc+Disorders+and+Low-Back+Pain%3A+Socioeconomic+Factors+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+%28American%29%22%5BJournal%5D)">Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21(2006).</li>
<li>Vlaeyen, J. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Low back pain.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52(2018).</li>
<li>Khan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+biomarkers+of+low+back+pain+and+disc+degeneration%3A+a+review%3A+Biomarkers+of+disc+degeneration+and+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).</li>
<li>Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+Degenerative+Disease+Part+1%3A+Anatomy+and+Pathophysiology+of+Intervertebral+Discogenic+Pain+and+Radiofrequency+Ablation+of+Basivertebral+and+Sinuvertebral+Nerve+Treatment+for+Chronic+Discogenic+Back+Pain%3A+A+Prospective+Case+Series+and+Review+of+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483(2020).</li>
<li>Adams, M. A., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+Intervertebral+Disc+Degeneration%2C+and+What+Causes+It%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It.</a> Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).</li>
<li>Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+Disc+Diseases+Part+2%3A+A+Review+of+the+Current+Diagnostic+and+Treatment+Strategies+for+Intervertebral+Disc+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135(2020).</li>
<li>Lurie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+Versus+Nonoperative+Treatment+for+Lumbar+Disc+Herniation%3A+Eight-Year+Results+for+the+Spine+Patient+Outcomes+Research+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial.</a> Spine. 39 (1), 3-16 (2014).</li>
<li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration%3A+pain+and+disc+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li>
<li>Ponnappan, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+culture+system+to+model+early+degenerative+changes+of+the+intervertebral+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171(2011).</li>
<li>O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Animals+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc+Geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li>
<li>Stannard, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+whole+organ+culture+model+for+intervertebral+disc+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+ex-vivo+Testing+of+Anti-inflammatory+Drugs+in+a+Bovine+Intervertebral+Degenerative+Disc+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ex+vivo+cavity+model+to+study+repair+strategies+in+loaded+intervertebral+discs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs.</a> European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).</li>
<li>Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid+down-regulates+interferon+signaling+molecules%2C+IGFBP3+and+IFIT3+in+the+bovine+intervertebral+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc.</a> Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).</li>
<li>Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+intervertebral+disc+tissue+via+pronase+predigestion+and+tissue+pulverization%5BTitle%5D)+AND+%22JOR+Spine%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization.</a> JOR Spine. 1 (2), 1017(2018).</li>
<li>Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+housekeeping+genes+in+human+intervertebral+disc%2C+endplate+and+articular+cartilage+cells+in+multiple+conditions+for+reliable+transcriptional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis.</a> European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).</li>
<li>Lang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervertebral+disc+whole+organ+culture+system+to+investigate+proinflammatory+and+degenerative+disc+disease+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+intervertebral+disc+cell+and+organ+culture+models+induced+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22JOR+Spine%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha.</a> JOR Spine. 3, 1104(2020).</li>
<li>Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TNF%CE%B1+in+intervertebral+disc+degeneration%3A+A+non-recoverable+catabolic+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).</li>
<li>Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+Transport+Induced+by+Dynamic+Loading+Alters+Biomechanics+of+Intact+Intervertebral+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs.</a> PLOS One. 10 (3), 0118358(2015).</li>
<li>Gullbrand, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+animal+model+that+recapitulates+the+spectrum+of+human+intervertebral+disc+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).</li>
<li>Willems, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+intradiscal+injection+and+biocompatibility+of+polyester+amide+microspheres+in+a+canine+model+predisposed+to+intervertebral+disc+degeneration%3A+intradiscal+application+of+pea+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).</li>
<li>Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+needle+puncture+injury+on+microscale+shear+strain+in+the+intervertebral+disc+annulus+fibrosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus.</a> The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).</li>
<li>Illien-Jünger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li>
<li>Gantenbein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+bioreactors--platforms+to+study+human+intervertebral+disc+degeneration+and+regenerative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).</li>
<li>Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+regulating+viable+cell+density+in+the+intervertebral+disc%3A+blood+supply+in+relation+to+disc+height%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height.</a> Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).</li>
<li>Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+involved+in+the+nutrition+of+the+human+lumbar+intervertebral+disc%3A+cellularity+and+diffusion+of+glucose+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro.</a> Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).</li>
<li>Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Animal+Discs+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc%3A+Axial+Compression+Mechanics+and+Glycosaminoglycan+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content.</a> Spine. 33 (6), 166-173 (2008).</li>
<li>Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+bioreactor+system+for+dynamic+loading+and+mechanical+characterization+of+whole+human+intervertebral+discs+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture.</a> Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).</li>
<li>Rajan, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+4+%28TLR4%29+Expression+and+Stimulation+in+a+Model+of+Intervertebral+Disc+Inflammation+and+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration.</a> Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).</li>
<li>vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+marker+genes+distinguish+inner+and+outer+annulus+fibrosus+from+nucleus+pulposus+tissue+in+the+bovine+intervertebral+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402(2017).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell+phenotype+induction+with+TGF-%CE%B21+and+collagen-polyurethane+scaffold+for+annulus+fibrosus+rupture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair.</a> European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).</li>
<li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells%3A+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

We hebben hier een gedetailleerd protocol gegeven om degeneratieve en inflammatoire IVDD te simuleren. Dit protocol kan worden toegepast voor gedetailleerde onderzoeken van ontstekingsroutes die leiden tot de destructieve effecten op de schijf. Bovendien kan het protocol helpen bij het bepalen van veelbelovende therapeutische doelen die betrokken zijn bij de progressie van de ziekte.
We hebben onlangs laten zien dat humane recombinante TNF-α ontstekingen kan veroorzaken in zowel runder- als me...

Lage rugpijn (LBP) kan individuen van alle leeftijden treffen en is wereldwijd een belangrijke oorzaak voor invaliditeit1,2,3. De totale kosten in verband met LBP bedragen meer dan $ 100 miljard per jaar4,5. Symptomatische tussenwervelschijf (IVD) degeneratie (IDD), een aandoening die wordt gekenmerkt door ontsteking en weefselafbraak, is een belangrijke oorzaak van LBP6,7. In het bijzonder wordt IDD gekenmerkt door een geleidelijk evoluerende afbraak van de extracellulaire matrix (ECM) van het IVD, geïnduceerd en geactiveerd door meerdere factoren die leiden tot een versnelde pathologie, neurologische aandoeningen en uiteindelijk invaliditeit. Bovendien wordt IDD geassocieerd met het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokinen, veranderde wervelkolombiomechanica, angiogenese en zenuwingroei, wat het pijngevoel verhoogt, wat in totaal chronische LBP (actieve discopathie) veroorzaakt6,8. Tot op heden omvatten behandelingsopties discectomie en daaropvolgende fusie van de aangrenzende wervels, implantatie van een IVD-prothese of niet-chirurgische benaderingen, zoals niet-steroïde ontstekingsremmende geneesmiddelen, opioïden en spierverslappers voor patiënten met IDD9. Beide huidige standaard therapeutische opties, chirurgisch en niet-chirurgisch, zijn slechts gedeeltelijk effectief en pakken het onderliggende biologische probleem niet aan9,10. Degeneratieve schijfziekte in een vroeg stadium wordt gekenmerkt door een initiële inflammatoire weefselrespons, met name een toename van tumornecrosefactor-alfa (TNF-alpha) expressie11. Deze vroege schijfveranderingen treden voornamelijk op cellulair niveau op zonder de schijfarchitectuur te verstoren en kunnen eerder worden nagebootst door voedingstekort onder pro-inflammatoire aandoeningen12. Daarom is nauwkeurige simulatie van de in vivo situatie om deze degeneratiemechanismen te onderzoeken en geschikte therapeutische doelen te vinden cruciaal. Bovendien speelt de mechanische belastingsomgeving van de schijven een sleutelrol bij pathologische en fysiologische veranderingen van IVD. Bijgevolg zou het combineren van deze benaderingen ons een stap vooruit brengen om de complexe micro-omgeving van IVD's in vivo na te bootsen. Er zijn momenteel geen studies die het aspect van dynamische belasting in overweging nemen, samen met de pro-inflammatoire en nutritionele setting voor zover wij weten.
Hoewel grote diermodellen het mogelijk maken om potentiële relevante in vivo interacties te onderzoeken, zijn ze duur en werkintensief. Aangezien het gebruik van diermodellen in onderzoek al lang een controverse is, is de vermindering van het aantal dieren dat nodig is om belangrijke onderzoeksvragen te beantwoorden van groot belang. Ten slotte is er momenteel geen ideaal diermodel om IDD na te bootsen in IVD-onderzoek13,14. Daarom is het noodzakelijk om een kosteneffectieve en betrouwbare vervanging vast te stellen, zoals een orgaancultuurmodel om IDD en bijbehorende ontstekings- en degeneratieve processen te simuleren. Onlangs stelde de toepassing van het huidige protocol voor de vaststelling van een pro-inflammatoir en degeneratief orgaancultuurmodel om intervertebrale schijfziekte in een vroeg stadium te simuleren ons in staat om het effect van ontstekingsremmende geneesmiddelen in de IDD-orgaancultuur te onderzoeken15.
Hier beschrijven we hoe runderintervertebrale schijven kunnen worden verkregen en de toestand van IDD in een vroeg stadium kunnen worden induceren via een katabole en pro-inflammatoire micro-omgeving veroorzaakt door directe intradiscale injectie van tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en degeneratieve belasting in een bioreactor onder lage voedingsmatige mediumomstandigheden. Figuur 1 illustreert het experimentele model en toont de bioreactor die wordt gebruikt om degeneratieve en fysiologische belastingsomstandigheden te simuleren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Figuur 1: Illustratie van de experimentele opstelling. A: runderstaart; B: ontlede tussenwervelschijven van runderen; C: overdracht van de schijf naar een putplaat met kweekmedium; D: het laden van de simulatie in een bioreactor; E: intradiscale injectietechniek; F: IVD na injectie van PBS/trypan blauwe kleurstof om de verdeling te onthullen. IDD: tussenwervelschijfdegeneratie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>1-Bromo-3-chloropropaan(BCP)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbaat-2-fosfaat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Bandzaag</td><td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Duitsland</td><td>model 30/833</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Munndipharma, Frankfurt, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA</td><td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td><td>DIY1028B-003</td><td></td></tr><tr><td>Corning ITS Premix</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>354350</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hoge glucose</td><td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td><td>10741574</td><td></td></tr><tr><td>DMEM lage glucose</td><td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11564446</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol voor moleculaire biologie</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>09-0851</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuurloos</td><td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine(P/S)</td><td>gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing, tablet</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Sandiego, USA</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Pulsavac Jet Lavage System</td><td>Zimmer, IN,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen, Venlo, Nederland</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td><td>AR0068-001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA</td><td>10704274</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-synthesekit</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>10400745</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha, recombinant humaan eiwit</td><td>R&amp;D systems, Minnesota, USA</td><td>210-TA-005</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA bufferoplossing</td><td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Gen bIL-6</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>Op maat gemaakte sondes</td><td>Primer fw (5&prime;&ndash;3&prime;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5&prime;&ndash;3&prime;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Sonde (5&prime;FAM/3&prime;TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td></tr><tr><td>Gen bIL8</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>Bt03211906_m1</td><td></td></tr><tr><td>Gen bTNF-alpha</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>Op maat gemaakte sondes</td><td>Primer fw (5&prime;&ndash;3&prime;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5&prime;&ndash;3&prime;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Sonde (5&prime;FAM/3&prime;TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td></tr><tr><td>GEN bIL1beta</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>Op maat gemaakte sondes</td><td>Primer fw (5&prime;&ndash;3&prime;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5&prime;&ndash;3&prime;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Sonde (5&prime;FAM/3&prime;TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td></tr><tr><td>RPLP0</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>Bt03218086_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

een pro-inflammatoire, degeneratieve orgaancultuurmodel om intervertebrale discusziekte in een vroeg stadium te simuleren.

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Symptomatische tussenwervelschijf (IVD) degeneratie (IDD) is een belangrijke sociaaleconomische last en wordt gekenmerkt door ontsteking en weefselafbraak. Vanwege het gebrek aan oorzakelijke therapieën is er dringend behoefte aan innovatieve experimentele orgaancultuurmodellen om de mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de progressie van de ziekte, therapeutische doelen te vinden en de behoefte aan diermodellen te verminderen. We presenteren hier een nieuw, driedimensionaal orgaancultuurmodelprotocol dat het pro-inflammatoire en katabole micromilieu nabootst, dat aanwezig is tijdens IDD. 
Aanvankelijk werden runderaudale IVD's ontleed, gereinigd en gekweekt in het weefselkweekmedium. Dynamische fysiologische of pathologische belasting werd gedurende 2 uur per dag toegepast in een op maat gemaakte bioreactor. IVD's werden gedurende vier dagen toegewezen aan een controlegroep (hoog glucosemedium, fysiologische belasting, fosfaatgebufferde zoutoplossinginjectie) en een pathologische groep (laag glucosemedium, pathologische belasting, tumornecrosefactor-alfa-injectie). Genexpressieanalyse van verzamelde nucleus pulposuscellen van de IVD's en enzymgekoppelde immunosorbente assay van de geconditioneerde orgaankweekmedia werd uitgevoerd. 
Onze gegevens onthulden een hogere expressie van ontstekingsmarkers en verminderde schijfhoogten na belasting in de pathologische groep in vergelijking met de controlegroep. Dit protocol is betrouwbaar om IVD-ontsteking en degeneratie te simuleren en kan verder worden uitgebreid om het toepassingsgebied ervan te verbreden.

Degeneratieve belasting in een laag glucosemedium in combinatie met TNF-α injectie veroorzaakte een significante toename van de genexpressie van pro-inflammatoire markers interleukine 6 (IL-6) en interleukine 8 (IL-8) in vergelijking met de fysiologische controlegroep in NP-cellen na 4 dagen kweek (Figuur 2). Daarentegen hebben we geen significante veranderingen waargenomen voor de pro-inflammatoire genen interleukine 1β (IL-1β) en TNF-α in NP-cellen (gegevens niet getoond). Bovendien verand...

Dit protocol presenteert een nieuw experimenteel model van pro-inflammatoire, degeneratieve runderorgaancultuur om vroege tussenwervelschijfdegeneratie te simuleren.

Een pro-inflammatoire, degeneratieve orgaancultuurmodel om intervertebrale discusziekte in een vroeg stadium te simuleren.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Het protocol is bedoeld om in vivo omstandigheden van tussenwervelschijfdegeneratie te simuleren om de pathofysiologie ervan te onderzoeken zonder dat diermodellen nodig zijn. In vergelijking met in vitro celkweek handhaaft de bioreactororgaankweektechniek de cellen in hun inheemse biologische en biomechanische micromilieu naast de levering van een controleerbare en reproduceerbare kweekconditie. Begin met het grondig spoelen van de hele runderstaart met leidingwater om vuil en haar op het oppervlak te verwijderen en dompel de staart vervolgens gedurende 10 minuten onder in 1% betadine-oplossing om het oppervlak te desinfecteren.Gebruik een scalpel nummer 20 om het zachte weefsel van de staartwervelkolom te verwijderen om de identificatie van de tussenwervelschijven of IVD's te vergemakkelijken. Verwijder de spineuze en transversale processen van de wervels met een botverwijderingstang. Snijd dwars met een bottang door het midden van elk wervellichaam om individuele bewegingssegmenten te verkrijgen en plaats vervolgens de verzamelde bewegingssegmenten in een Petrischaal met een gaas bevochtigd in de oplossing van Ringer.Lokaliseer de IVD in wervels door de bewegingssegmenten voorzichtig te bewegen en identificeer vervolgens de locatie van de groeiplaat door de bolle kant van de benige eindplaat aan te raken en te vinden. Koel het zaagblad van de bandzaag af met de oplossing van Ringer en gebruik het om twee parallelle sneden te maken in de groeiplaat van de IVD's, één aan elke kant. Breng de IND's over in een schone petrischaal met schoon gaas bevochtigd met de oplossing van Ringer.Schraap het wervellichaam en de groeiplaat af met behulp van het scalpelblad, waardoor de eindplaat intact blijft. Plaats de twee oppervlakken vlak en parallel voor de laadprocedure en breng geschraapte IVD's over naar een verse petrischaal met gaas bevochtigd met ringer's oplossing. Meet de schijfhoogte en diameter met een remklauw en reinig vervolgens de bloedstolsels in het wervelbot met de oplossing van Ringer met behulp van een straalspoelingssysteem.Desinfecteer IVDs in PBS en 10% penicilline streptomycine met schudden gedurende 15 minuten. Spoel de antibiotica met hoge concentratie af met PBS en 1% penicilline streptomycine. Breng schijven over naar IVD-kamers met vijf milliliter IVD-kweekmedium en plaats ze in het bioreactorsysteem met een incubator op 37 graden Celsius met 85% vochtigheid en 5% kooldioxide.Kweek de schijven gedurende vier dagen binnen een bioreactorsysteem door verschillende belastingsomstandigheden te handhaven volgens de experimentele groepen. Kweek in de fysiologische controlegroep de IVD's met een hoog glucosemedium met behulp van een belastingsprotocol van 0,02 tot 0,2 megapascal en 0,2 hertz gedurende twee uur per dag. Kweek in de pathologische groep de IVD's met een laag glucosemedium met behulp van een beladingsprotocol van 0,32 tot 0,5 megapascal en vijf hertz gedurende twee uur per dag.Plaats de IVD's tussen de beladingsprocedures in zesputplaten met zeven milliliter IVD-kweekmedium voor vrij zwellingsherstel. Meet de schijfhoogte dagelijks met een remklauw na de vrije zwellingsperiode en na dynamische belasting voor de experimentele duur. Plaats de IVD's na de eerste dynamische laadcyclus op de eerste dag direct in een petrischaal in een verticale positie en stabiliseer ze met een pincet.Injecteer recombinant TNF-alpha met een 30-gauge insulinenaald langzaam met een snelheid van ongeveer 70 microliter per minuut in de IVD's van de pathologische groep. Trek na het injecteren de spuit halverwege naar achteren en trek aan de zuiger om een vacuüm te creëren dat voorkomt dat de geïnjecteerde oplossing lekt en verwijder vervolgens de spuit volledig uit de IVD. Degeneratieve belasting in combinatie met een beperkte voedingsvoorziening en een TNF-alfa-injectie veroorzaakten een significante toename van de genexpressie van pro-inflammatoire markers interleukine zes en interleukine acht in NP-weefsel na vier dagen kweek.De interleukine acht eiwitafgifte in het geconditioneerde medium vertoonde een duidelijke toename van de pathologische groep op dag twee en dag vier. Schijfhoogtevermindering na belasting was hoger in de pathologische groep in vergelijking met de fysiologische groep, en de verschillen waren meer uitgesproken na dag twee en drie in vergelijking met dag één, wat wijst op een progressief effect van de degeneratieve en inflammatoire omstandigheden. Een gestandaardiseerde dissectietechniek is belangrijk voor reproduceerbare IVD-cultuurmodellen met hele organen.Een bioreactor is vereist om fysiologische en degeneratieve belasting op IVD's toe te passen om verschillende in vivo biomechanische omstandigheden te simuleren. Deze techniek kan worden toegepast op menselijke IVD-explants die van hoge klinische relevantie zijn. Het is een nieuw preklinisch model voor het ontwikkelen van effectieve behandelingen bij vroege schijfdegeneratie.

a-proinflammatory-degenerative-organ-culture-model-to-simulate-early

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit protocol geeft een oogst techniek voor coccygeale runderen tussenwervelschijven voor orgel...

Voorbereiding van de Intact Bovine Tail tussenwervelschijven voor orgel Cultuur

This video demonstrates a technique for culturing bovine intervertebral discs in bioreactors to develop a three-dimensional organ culture model. Specific nutrient-deprived media and degenerative pressure conditions are applied to the discs, mimicking the pro-inflammatory and degenerative microenvironment observed during early-stage intervertebral disc disease. The disc heights are measured post-treatment to analyze the effects of nutrient deprivation and degenerative loading.

Generating a Pro-Inflammatory Organ Culture Model to Simulate an Early Intervertebral Disc Disease

This video demonstrates the development of a pro-inflammatory and degenerative organ culture model for early-stage intervertebral disc (IVD) disease using TNF-α. It outlines the procedure for injecting TNF-α into the intervertebral disc and explains the mechanisms through which TNF-α induces inflammation and degradation of the IVD.

Generating an Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease

Hele orgelcultuur van de tussenwervelschijf (IVD) behoudt het natieve extracellulaire matrix, celfenotypen en cellulaire-matrix interacties. Hier beschrijven we een IVD cultuur systeem met behulp van de muis lumbale en caudale IVD's in hun functionele spinale-eenheden en een aantal applicaties door middel van dit systeem.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebrale schijfdegeneratie is een belangrijke bijdrage aan rugpijn en een belangrijke oorzaak van handicap wereldwijd. Er zijn talrijke diermodellen van de tussenwervelschijfdegeneratie. Wij tonen een schaap model van intervertebrale disc degeneratie, met behulp van een boorboor, die een consistente schade verwonding en reproduceerbare niveau van schijf degeneratie bereikt.

Ovine Lumbar Intervertebrale Disc Degeneratie Model Gebruik maken van een laterale retroperitoneale boorbitschade

We ontwikkelden een lumbaal tussenwervelschijfdegeneratiemuismodel door resectie van L3-L5 spineuze processen samen met supra- en inter-spineuze ligamenten en loslating van paraspinous spieren.

Een muismodel van lumbale wervelkolominstabiliteit

We presenteren een methode om ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van de tussenwervelschijf te onderzoeken met behulp van een optische sectioningmethode.

Optische sectie en visualisatie van de tussenwervelschijf van embryonale ontwikkeling tot degeneratie

Het tactiele vingermeetsysteem kwantificeert de tactiele druk op de vinger met behulp van een zeer gevoelige elektrochirurgische druksensor, waarbij software de drukgegevens en video in realtime weergeeft en nauwkeurig registreert. Twee analysemodules verenigen de gegevensverwerking voor het volgen en conditioneren van de duim tijdens Tuina.

Operationele en interventie-effecten van gerichte Tuina bij lumbale tussenwervelschijfdegeneratie modelkonijnen

Muizen zijn gebruikt als een model voor het bestuderen van vele vormen van transplantatie, inclusief hoornvliestransplantatie.  We beschrijven in dit rapport een muismodel voor zowel acute als late-term hoornvliestransplantatie.

Muizen hoornvliestransplantatie: een model om de meest voorkomende vorm van een orgaantransplantatie Bestudeer

Ex-Vivo longperfusie (EVLP) heeft toegestaan ​​longtransplantatie bij de mens om meer direct beschikbaar doordat de mogelijkheid om organen te beoordelen en uit te breiden het donorpool geworden. We beschrijven hier de ontwikkeling van een rat EVLP programma en verfijningen die zorgen voor een reproduceerbaar model voor toekomstige uitbreiding.

WERKWIJZE Geïsoleerde<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Longperfusie in een Rat Model: Lessen uit het ontwikkelen van een Rat EVLP Program

Leer een pro-inflammatoire orgaancultuurmethode voor intervertebrale discusziekte onderzoek met behulp van bovine staartwervelschijven. Dit model simuleert de pathofysiologie en vermindert dierproeven.

Een pro-inflammatoire, degeneratieve orgaancultuurmodel om intervertebrale discusziekte in een vroeg stadium te simuleren.

Meer video's verkennen