Name: Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer HPICM-beeldvorming van levende zoogdier auditieve haarcellen met nanoschaalresolutie. Deze niet-contactmethode maakt tijdopname van stereocilia bundels mogelijk zonder fysieke schade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) voor de langdurige ondersteuning en het advies in alle fasen van het project. We bedanken ook Drs. Pavel Novak en Andrew Shevchuk (Imperial College, VK) en Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Rusland) voor hun hulp bij softwareontwikkeling. De studie werd ondersteund door NIDCD/NIH (R01 DC008861 en R01 DC014658 tot G.I.F.).

<ol><li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li>
<li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositol-4%2C5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li>
<li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li>
<li>Engström, H., Engström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti%2C+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li>
<li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li>
<li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobs%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22">Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology</a>. 55, 547-561 (1990).</li>
<li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li>
<li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182(2020).</li>
<li>Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+JARO%22%5BJournal%5D)">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li>
<li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li>
<li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li>
<li>Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li>
<li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li>
<li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li>
<li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).</li>
<li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li>
<li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scanning+ion-conductance+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li>
<li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li>
<li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed+in+English%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+patch-clamp%3A+new+insights+into+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li>
<li>Sánchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li>
<li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li>
<li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li>
<li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.

Om succesvolle HPICM-beelden te verkrijgen, moeten gebruikers een geluidsarm en trillingsarm systeem opzetten en geschikte pipetten produceren. We raden ten zeerste aan om AFM-kalibratiestandaarden te gebruiken om de stabiliteit van het systeem te testen voordat u probeert live cell imaging uit te voeren. Zodra de resolutie van het systeem is getest, kunnen gebruikers overwegen om vaste organen van Corti-monsters af te beelden om vertrouwd te raken met de beeldvormingsinstellingen voordat ze live cell imaging proberen.</...

Ondanks het feit dat stereociliabundels in de auditieve haarcellen groot genoeg zijn om te worden gevisualiseerd door optische microscopie en afgebogen in levende cellen in een patchklemexperiment, konden de essentiële structurele componenten van de transductiemachinerie zoals tiplinks alleen worden afgebeeld met de elektronenmicroscopie in dode cellen. In de auditieve haarcellen van zoogdieren bevindt de transductiemachinerie zich aan de onderkant van de tiplinks, d.w.z. aan de uiteinden van de kortere rij stereocilia1 en lokaal geregeld door de signalering aan de uiteinden van stereocilia2,3. Toch is labelvrije beeldvorming van de oppervlaktestructuren op deze locatie in levende haarcellen niet mogelijk vanwege de kleine afmetingen van stereocilia.
Het slakkenhuis van zoogdieren heeft twee soorten auditieve sensorische cellen: binnenste en buitenste haarcellen. In de binnenste haarcellen zijn stereocilia langer en dikker in vergelijking met die in de buitenste haarcellen4. De eerste en tweede rij stereocilia hebben een diameter van 300-500 nm in binnenste haarcellen van muizen of ratten. Door de diffractie van licht is de maximale resolutie die haalbaar is met een labelvrije optische microscopie ongeveer 200 nm. Vandaar dat visualisatie van individuele stereocilia binnen de eerste en tweede rij van de binnenste haarcelbundel relatief eenvoudig is met optische microscopie. Daarentegen hebben kortere rijen stereocilia in de binnenste haarcellen en alle stereocilia van de buitenste haarcellen diameters rond 100-200 nm en kunnen niet worden gevisualiseerd met optische microscopie5. Ondanks de recente vooruitgang in superresolutiebeeldvorming, blijft deze fundamentele beperking bestaan in elke optische labelvrije beeldvorming. Alle huidige commercieel verkrijgbare superresolutietechnieken vereisen een soort fluorescerendemoleculen 6, wat hun toepassingen beperkt. Naast beperkingen als gevolg van de behoefte aan specifieke fluorescerend gelabelde moleculen, is aangetoond dat blootstelling aan intense lichtbestraling cellulaire schade veroorzaakt en cellulaire processen kan beïnvloeden, wat een groot nadeel is bij het bestuderen van levende cellen7.
Onze huidige kennis van de ultrastructurele details van haarcel stereocilia bundels is meestal verkregen met verschillende elektronenmicroscopie (EM) technieken, zoals scanning elektronenmicroscopie (SEM), transmissie elektronenmicroscopie (TEM), freeze-fracture EM, en onlangs met 3D-technieken zoals seriële sectie met gerichte ionenbundel of cryo-EM tomografie8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Helaas vereisen al deze EM-technieken chemische of cryofixatie van het monster. Afhankelijk van de tijdschaal van de verschijnselen, maakt deze vereiste een studie van de dynamische processen aan de uiteinden van stereocilia onmogelijk of zeer arbeidsintensief.
Er zijn beperkte inspanningen geleverd om haarbundels van levende haarcellen in beeld te brengen met atoomkrachtmicroscopie (AFM)17,18. Omdat AFM in fysiologische oplossingen werkt, zou het in theorie dynamische veranderingen in de stereociliabundels van levende haarcellen in de loop van de tijd kunnen visualiseren. Het probleem ligt in de principes van hoge resolutie AFM, wat een zeker fysiek contact tussen de AFM-sonde en het monster impliceert, zelfs in de minst schadelijke "tapmodus"19. Wanneer de AFM-sonde een stereocilium tegenkomt, crasht deze er meestal tegenaan en beschadigt de structuur van de haarbundel. Als gevolg hiervan is deze techniek niet geschikt voor het visualiseren van levende of zelfs vaste haarcellenbundels17,18. Het probleem kan gedeeltelijk worden verlicht door een grote balvormige AFM-sonde te gebruiken die alleen hydrodynamische krachten oplegt aan het oppervlak van het monster20. Hoewel een dergelijke sonde bij uitstek geschikt is om de mechanische eigenschappen van het monster21te testen, biedt deze slechts een resolutie van minder dan een micrometer bij het afbeelden van het orgaan van Corti22 en past het nog steeds een kracht toe op het monster die aanzienlijk kan zijn voor de zeer gevoelige stereociliabundels.
Scanning ion conductance microscopie (SICM) is een versie van scanning probe microscopie die gebruik maakt van een glazen pipet sonde gevuld met een geleidende oplossing23. SICM detecteert het oppervlak wanneer de pipet de cel nadert en de elektrische stroom door de pipet afneemt. Omdat dit gebeurt ruim voordat de cel wordt aangeraakt, is de SICM bij uitstek geschikt voor contactloze beeldvorming van levende cellen in fysiologische oplossing24. De beste resolutie van SICM is in de orde van enkele nanometers, waarmee individuele eiwitcomplexen kunnen worden opgelost bij het plasmamembraan van een levende cel25. Net als bij andere scanning probe-technieken is SICM echter in staat om alleen relatief vlakke oppervlakken in beeld te brengen. We hebben deze beperking overwonnen door het uitvinden van de hoppende sonde ionengeleidingsmicroscoop (HPICM)26, waarbij de nanopipette het monster op elk beeldvormingspunt nadert (Figuur 1A). Met behulp van HPICM konden we stereociliabundels in levende auditieve haarcellen met nanoschaalresolutie27 inbeeld brengen.
Een ander fundamenteel voordeel van deze techniek is dat HPICM niet alleen een imaging tool is. In tegenstelling tot andere scanning probe technieken, is de HPICM/SICM probe een elektrode die veel gebruikt wordt in de celfysiologie voor elektrische opnames en lokale afgifte van verschillende stimuli. Ionkanaalactiviteit interfereert meestal niet met HPICM-beeldvorming, omdat de totale stroom door de HPICM-sonde enkele ordes van grootte groter is dan de extracellulaire stroom die wordt gegenereerd door de grootste ionkanalen25. HPICM maakt echter een nauwkeurige positionering van de nanopipette over een interessante structuur en daaropvolgende eenkanaals patch-clamp-opname van deze structuurmogelijk 28. Dit is hoe we de eerste voorlopige opnames van eenkanaalsactiviteit aan de uiteinden van de buitenste haarcel stereocilia29verkregen . Het is vermeldenswaard dat zelfs een grote stroom door de nanopipette geen significante veranderingen van het potentieel over het plasmamembraan kan veroorzaken als gevolg van enorme elektrische shunt van het extracellulaire medium. Individuele ionkanalen kunnen echter mechanisch worden geactiveerd door vloeistofstroom door de nanopipette30 of chemisch door lokale toepassing van een agonist31.
In HPICM wordt het beeld gegenereerd wanneer een nanopipette het monster op een bepaald punt achtereenvolgens nadert, zich terugtrekt en vervolgens in laterale richting beweegt om de benadering te herhalen (Figuur 1A). Een patchklemversterker past constant spanning toe op een AgCl-draad in de pipet(figuur 1B)om een stroom van ~ 1 nA in de badoplossing te genereren. De waarde van deze stroom wanneer de pipet zich van het oppervlak van de cel bevindt, wordt bepaald als een referentiestroom (Iref, Figuur 1C). Vervolgens beweegt de pipet in de Z-as om het monster te benaderen totdat de stroom wordt verminderd met een hoeveelheid die vooraf is gedefinieerd door de gebruiker (instelpunt), meestal 0,2% -1% van de Iref (figuur 1C, bovenste trace). Het systeem slaat vervolgens de Z-waarde op dit moment op als de hoogte van het monster, samen met X- en Y-coördinaten van dit beeldpunt. Vervolgens wordt de pipet weggetrokken van het oppervlak(figuur 1C,onderste spoor) met een snelheid die door de gebruiker is gedefinieerd, meestal 700-900 nm / ms. Na intrekking wordt de pipet (of, in ons geval, het monster - zie figuur 1B) zijdelings naar het volgende beeldvormingspunt verplaatst, wordt een nieuwe referentiestroomwaarde verkregen en nadert de pipet opnieuw het monster en herhaalt het proces. De X-Y-beweging van de pipet heeft de voorkeur in een rechtopstaande microscoopopstelling die meestal wordt gebruikt voor opnames van de mechanotransductiestromen van de haarcel. In deze instelling benadert de HPICM-sonde de haarcelbundels niet van bovenaf, maar onder een hoek32. De beste resolutie van HPICM-beeldvorming wordt echter bereikt in een omgekeerde microscoopopstelling(Figuur 1A,B),waarbij de beweging van het monster in X-Y-richtingen wordt ontkoppeld van Z-beweging van de nanopipette, waardoor potentiële mechanische artefacten worden geëlimineerd.
Met behulp van HPICM verkregen we topografische beelden van muis en rat binnen- en buitenste haarcel stereocilia bundels, en visualiseerden zelfs de verbindingen tussen de stereocilia die ongeveer 5 nm in diameter26,27zijn. Het succes van beeldvorming van haarcellenbundels met deze techniek is afhankelijk van verschillende factoren. Ten eerste moet de ruis (variantie) van de nanopipettestroom zo klein mogelijk zijn om het laagst mogelijke instelpunt voor HPICM-beeldvorming mogelijk te maken. Een laag instelpunt stelt HPICM-sonde in staat om het stereocilia-oppervlak op een grotere afstand en onder elke hoek ten opzichte van de sondebenadering te "detecteren" en verbetert verrassend genoeg de X-Y-resolutie van HPICM-beeldvorming (zie discussie). Ten tweede moeten de trillingen en driften in het systeem worden verminderd tot minder dan 10 nm, omdat ze direct bijdragen aan de beeldvormingsartefacten. Ten slotte, hoewel de HPICM-sonde en de monstertrap in Z- en X-Y-assen worden verplaatst door de gekalibreerde feedbackgestuurde piëzo-actuatoren met een nauwkeurigheid van een enkele nanometer of beter, bepaalt de diameter van de nanopipettepunt de spreiding van de stroom (detectievolume) en dus de resolutie(figuur 1A). Daarom is het van vitaal belang om, voordat u levende haarcellen in beeld brengt, de juiste pipetten te trekken, de gewenste resolutie te bereiken met kalibratiemonsters en een laag geluidsniveau in het opnamesysteem te bereiken.
Al minstens een paar decennia is de SICM-techniek niet commercieel beschikbaar en is deze door slechts enkele laboratoria ter wereld ontwikkeld met het toonaangevende laboratorium van Prof. Korchev in het Imperial College (VK). Onlangs zijn verschillende SICM-systemen commercieel beschikbaar geworden (zie Tabel met materialen),die allemaal zijn gebaseerd op de oorspronkelijke HPICM-principes. Het afbeelden van stereociliabundels in de haarcellen vereist echter verschillende aangepaste aanpassingen die technisch uitdagend (of zelfs onmogelijk) zijn in de gesloten "ready-to-go" -systemen. Daarom is enige componentintegratie nodig. Aangezien HPICM-opstelling een patchkleminstallatie vertegenwoordigt met strengere trillings- en driftvereisten en een piëzo-aangedreven beweging van de HPICM-sonde en het monster(figuur 1D),is deze integratie relatief eenvoudig voor elke onderzoeker, die bekwaam is in patchklemmen. Een wetenschapper zonder de juiste achtergrond zou echter zeker eerst enige training in elektrofysiologie nodig hebben. Ondanks resterende uitdagingen zoals het verhogen van de snelheid van beeldvorming (zie Discussie),zijn we in staat geweest om stereocilia-bundels in levende haarcellen met nanoschaalresolutie in beeld te brengen zonder ze te beschadigen.
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol om succesvolle HPICM-beeldvorming uit te voeren van de levende auditieve haarcelbundels in jonge postnatale rat- of muiscochleaire explantaten met behulp van ons aangepaste systeem. De geïntegreerde componenten zijn opgenomen in de tabel met materialen. Het artikel beschrijft ook veelvoorkomende problemen die kunnen worden ondervonden en hoe u deze kunt oplossen.

<table><tbody><tr><td>Analog oscilloscope</td><td>B&amp;K Precision</td><td>2160C</td><td>Analog oscilloscope voor real-time monitoring van nanopipet-stroom en Z-as benadering</td></tr><tr><td>AFM kalibratiestandaarden</td><td>TED PELLA Inc</td><td>HS-100MG; HS-20MG</td><td>Deze 100 en 20 nm kalibratiestandaarden worden gebruikt om de prestaties van het HPICM-systeem te testen</td></tr><tr><td>Benchtop vibratie-isolator</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Everstill K-400</td><td>Actieve vibratie-isolatie</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillairen</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>1B100F-4</td><td>Borosilicaat glas capillairen voor de nanopipetten</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Te worden toegevoegd aan de badoplossing om osmolariteit aan te passen</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>Multi-kanaals input/output digitizer</td></tr><tr><td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control voor Z beweging</td><td>Standford Research Systems</td><td>SIM900, SIM960, SIM980</td><td>Instrumentatiemodules geïntegreerd in een externe PID controller voor Z beweging. Het vereist een snelle respons die meestal niet wordt geïmplementeerd in commerciële piëzo versterkers.</td></tr><tr><td>Faraday kooi</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Type II</td><td>Vereist voor het afschermen van elektromagnetische interferentie</td></tr><tr><td>Glazen bodemschaal</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD5040-100</td><td>Gebruikt als de schaal voor de kamer voor het weefsel</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>Extracellulaire (bad) oplossing</td></tr><tr><td>Instrumentatie versterker</td><td>Brownlee Precision</td><td>Model 440</td><td>Instrumentatie versterker biedt vereiste offsets, filtering en secundaire vergroting of verzwakking</td></tr><tr><td>Laser-gebaseerde micropipet-trekker</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Micropipet-trekker om de nanopipetten te fabriceren. Laser is nodig voor scherpe kwarts pipetten.</td></tr><tr><td>Lebovitz's L-15, zonder fenol rood</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Extracellulaire (bad) oplossing</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>Gebruikt voor "grof" positionering van de Z piëzo actuator</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Invers optisch microscoop</td></tr><tr><td>Patch versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td>De patch clamp versterker meet de stroom door de nanopijp</td></tr><tr><td>Piëzo versterker (XY assen)</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td><td>Versterking en PID controle voor XY piëzo vertaaltafel</td></tr><tr><td>Piëzo versterker (Z as)</td><td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 &amp; 800</td><td>Aangepaste versterker bestaande uit ENT 400 voeding en twee ENT 800 versterkers parallel om een maximale stroom van 1.6 nA te bereiken</td></tr><tr><td>Kunststof dekglasjes</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>Gebruikt bij de fabricage van de kamers voor het weefsel&nbsp;</td></tr><tr><td>SICM controller &amp; software*</td><td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td><td>N/A</td><td>Aangepaste controller gebaseerd op SBC6711 digitale signaalverwerkingskaart van Innovative Integration Ltd</td></tr><tr><td>Siliconen elastomeer (Sylgard)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYLG184</td><td>Gebruikt om de flexibele glazen vezels aan de kamer voor het weefsel te bevestigen</td></tr><tr><td>Silicium lijm</td><td>The Dow Chemical Company</td><td>734</td><td>Gebruikt om de verschillende delen van de kamer voor het weefsel te lijmen</td></tr><tr><td>Wolfraam staaf</td><td>A-M Systems</td><td>717500</td><td>Gebruikt voor het vasthouden van de tandenstokersdraden in de kamer voor het weefsel</td></tr><tr><td>XY piëzo nanopositioner</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>P-733.2DD</td><td>XY vertaaltafel met capacitieve sensoren</td></tr><tr><td>Z piëzo nanopositioner</td><td>Piezosystem jena</td><td>RA 12/24 SG</td><td>Ring piëzoactuator met een spanningsmeetwerkingssensor</td></tr><tr><td>*Ionscope verkoopt geen afzonderlijke SICM controllers meer. Er zijn enkele andere commerciële systemen:&nbsp; NX12-Bio en NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Park Systems, Korea en SICM modules van ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). Al deze systemen zijn gebaseerd op de originele&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPICM principes. Echter, het beeldvormen van stereocilia bundels in de haarcellen vereist verschillende aangepaste modificaties die technisch&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>uitdagend (of zelfs onmogelijk) zijn in de gesloten &ldquo;ready-to-go&rdquo; systemen zoals Ionscope of NX12-Bio/NX10. Momenteel is er slechts één&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>modulaire systeem (ICAPPIC) dat de flexibiliteit heeft om geschikt te zijn voor elk SICM/HPICM experiment maar vereist enige componentenintegratie.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Binnenoorhaarcellen detecteren door geluid geïnduceerde verplaatsingen en transduceren deze stimuli in elektrische signalen in een haarbundel die bestaat uit stereocilia die zijn gerangschikt in rijen van toenemende hoogte. Wanneer stereocilia worden afgebogen, trekken ze aan kleine (~ 5 nm in diameter) extracellulaire tiplinks die stereocilia met elkaar verbinden, die krachten overbrengen naar de mechanosensitieve transductiekanalen. Hoewel mechanotransductie al tientallen jaren wordt bestudeerd in levende haarcellen, kunnen de functioneel belangrijke ultrastructurele details van de mechanotransductiemachinerie aan de uiteinden van stereocilia (zoals tiplinkdynamica of transductie-afhankelijke stereocilia remodeling) nog steeds alleen worden bestudeerd in dode cellen met elektronenmicroscopie. Theoretisch hebben scanning probe technieken, zoals atoomkrachtmicroscopie, voldoende resolutie om het oppervlak van stereocilia te visualiseren. Echter, onafhankelijk van de beeldvormingsmodus, beschadigt zelfs het geringste contact van de atoomkrachtmicroscopiesonde met de stereociliabundel meestal de bundel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de hoppping probe ion conductance microscopy (HPICM) beeldvorming van levende knaagdier auditieve haarcellen. Deze contactloze scanning probe-techniek maakt time-lapse beeldvorming van het oppervlak van levende cellen mogelijk met een complexe topografie, zoals haarcellen, met een resolutie van enkele nanometers en zonder fysiek contact met het monster te maken. De HPICM maakt gebruik van een elektrische stroom die door de glazen nanopipette gaat om het celoppervlak in de nabijheid van de pipet te detecteren, terwijl een piëzo-elektrisch systeem met 3D-positionering het oppervlak scant en zijn beeld genereert. Met HPICM waren we in staat om stereociliabundels en de verbindingen die stereocilia met elkaar verbinden in live auditieve haarcellen gedurende enkele uren in beeld te brengen zonder merkbare schade. We verwachten dat het gebruik van HPICM directe verkenning van ultrastructurele veranderingen in de stereocilia van levende haarcellen mogelijk zal maken voor een beter begrip van hun functie.

Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, kan worden gebruikt om levende cellen met complexe topografie te visualiseren. Door deze stappen te volgen, verkrijgen we routinematig beelden van levende auditieve haarcelbundels van ratten(Figuur 6B,D). Ondanks het feit dat ze een lagere X-Y-resolutie hebben in vergelijking met SEM-beelden, kunnen onze HPICM-beelden met succes de verschillende rijen stereocilia, de vorm van de stereocilia-tips en zelfs de kleine links (~...

Hier presenteren we een protocol voor de Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), een contactloze scanning probe-techniek die beeldvorming op nanoschaal van stereocilia-bundels in levende auditieve haarcellen mogelijk maakt.

Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Deze praktische kan ons helpen dynamische veranderingen van de nano structurele componenten van de mechanische elektrische transductiemachines aan het oppervlak van de haarcel stereocilia bundels te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de time-lapse beeldvorming van het oppervlak van levende cellen met complexe topografie met een resolutie van één nanometer en zonder fysiek contact met het monster te maken. Deze techniek kan worden toegepast op bijna elke levende cel.We hebben eerder het oppervlak van longepitheelcellijnen die zijn geïnfecteerd met virussen, spiercellen, gematcht in My Image Bacteria Soon. Test de nanopipettes aan het begin van elke beeldvormingssessie. Controleer na het vervaardigen van een nanopipette op bubbels, verwijder eventuele bubbels indien aanwezig en monteer de nanopipette op de pipethouder van de iongeleidingsmicroscoop van de hoppende sonde.Bij vier milliliter badoplossing naar de kamer en plaats de kamer op het HPICM-podium. Breng de aardelektrode in de badoplossing en zorg ervoor dat de spanning die via de patchklemversterker op de pipet wordt uitgeoefend nul is. Nadat u de micromanipulator in de verticale positie hebt geplaatst, beweegt u de pipet in Z totdat deze de vloeistof raakt en stelt u de offset van de versterker in op nul, voordat u plus 100 millivolt toevoegt om de pipetstroom te controleren.Gebruik siliconenlijm om de AFM-kalibratiestandaard aan de kamer te bevestigen en bedek het monster met vier milliliter HBSS. Gebruik dubbelzijdige tape om de kamer vast te maken aan de X Y-fase van de HPICM-opstelling en laad een nieuwe nanopipette op de houder zoals gedemonstreerd. Na het testen van de nanopipetteweerstand en diameter, stelt u de stroom in op één nano-versterker.Gebruik een grove patchklemmanipulator om de nanopipette ongeveer boven het midden van de kalibratiestandaard te plaatsen en het instelpunt te verhogen terwijl het signaal van de sensor van de Z-piëzo-actuator op een oscilloscoop in realtime wordt bewaakt. Nadat een stabiele herhaalbare Z-naderingscyclus is vastgesteld, verlaagt u het instelpunt tot de waarde net boven het instabiliteitspunt en beweegt u de pipet met een snelheid van ongeveer vijf micron per seconde naar beneden, totdat deze het monster bereikt. Het onderste niveau van het real-time Z-positioneringssignaal zal toenemen, wat aangeeft dat de nanopipette wordt teruggetrokken als gevolg van het detecteren van het monsteroppervlak.Door ongelijke montage op de AFM-norm kan het hoogste punt van het interessegebied onbekend zijn. Stel daarom de amplitude van de pipetterugtrekking in op ten minste 200 tot 500 nanometer. Zorg ervoor dat u de bovengrens van de Z-piëzo-actuatorbeweging niet overschrijdt en begin met beeldvorming met een lage resolutie.Zodra het hoogste punt van het monster in het beeldvormingsgebied is geïdentificeerd, verlaagt u de hopamplitude en trekt u de pipet ongeveer 200 micron langs de Z-as in om een ongewenste botsing met het monster te voorkomen voordat u het naar een nieuwe X Y-locatie verplaatst. Wanneer het interessegebied is gelokaliseerd, begint u met het afbeelden met een hogere resolutie. Voor auditieve beeldvorming van haarcellen, bevestig een vers geïsoleerd orgaan van Corti stevig aan een kamer met behulp van tandzijde of flexibele glazen pipetten.Gebruik dubbelzijdige tape om de kamer stevig vast te zetten aan het X Y piëzostadium en laad een nieuwe nanopipette op de houder zoals gedemonstreerd. Na het controleren van de nanopipetteweerstand, gebruikt u de patchklemmicromanipor om de nanopipette over het haarcelgebied te plaatsen terwijl u het orgaan van de Corti X-plant in een omgekeerde microscoop observeert. Registreer het real-time stroom- en Z-positioneringssignaal op de oscilloscoop om te controleren of het systeem stabiel is met een instelpunt van 0,5% 6 of lager, en bepaal het optimale instelpunt en benader het monster zoals gedemonstreerd.Voer lage resolutie beeldvorming van het monster uit zoals aangetoond met behulp van een hopamplitude van ten minste zes tot acht micron. Als de nanopipette naar een nieuwe X Y-locatie moet worden verplaatst, trekt u de pipet ongeveer 500 nanometer in om een botsing met hoge functies in het weefsel te voorkomen en herhaalt u de HPICM-beeldvorming met lage resolutie tot het gebied van belang waar de haarcellen zich bevinden. Stel vervolgens het gewenste gebied in een hogere resolutie in 15 minuten of minder voor.Het HPICM-protocol kan worden gebruikt om levende cellen met een complexe topografie te visualiseren, zoals levende auditieve haarcelbundels van ratten. Ondanks het aantonen van een lagere X Y-resolutie in vergelijking met scanning elektronenmicroscopiebeelden, kunnen HPICM-beelden met succes de verschillende rijen stereocilia oplossen. De vorm van de stereocilia-tips en zelfs de kleine vijf nanometerverbindingen verbinden de aangrenzende stereocilia.Gezien de contactloze aard van HPICM-beeldvorming, kan continue time-lapse-beeldvorming van dezelfde haarcelbundel gedurende enkele uren worden uitgevoerd zonder de bundelcohesie te beschadigen. Merk op dat bij een zeer laag instelpunt het systeem kleine fluctuaties in de stroom kan interpreteren als het tegenkomen van het celoppervlak, wat leidt tot witte puntruis in de afbeelding. Evenzo kunnen grote hopamplitudes de laterale resonantie van de pipet verhogen, wat ook resulteert in de productie van luidruchtige pixels.Als de hopamplitude daarentegen te klein is of het instelpunt te hoog is, kan de nanopipette botsen met het monster, wat resulteert in beeldartefacten of schade aan de haarbundel. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om minder dan 15 minuten per haarcelbundel door te brengen bij het werken met levende cellen. Na het verkrijgen van een beeld van de haarbundel, zou men kunnen proberen om enkelkanaalsopnamen te verkrijgen van specifieke locaties op het oppervlak van stereocilia om vragen over mechanotransductiekanaaleigenschappen te beantwoorden.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Whole-cell patch-clamp opnamen van auditieve zenuw vezel dendrieten in de binnenste haarcel lint synaps in het zoogdier slakkenhuis.

Postsynaptische Recordings op Afferente Dendrieten Contact opnemen met Cochlear binnenste haarcellen: Monitoring multivesiculaire release op een lint Synapse

Een betrouwbare methode om buiten haar cel (OHC) beweeglijke reacties, waaronder electromotility, trage motiliteit en buigen, te onderzoeken is beschreven. OHC beweeglijkheid wordt opgewekt door stimulatie met een externe wisselend elektrisch veld, en de methode maakt gebruik van high-speed foto-opname, op basis van LED-verlichting, en de laatste generatie beeldanalyse-software.

Onderzoeken van buitenste haarcel beweeglijkheid met een combinatie van externe Alternating elektrisch veld Stimulatie en High-speed Image Analysis

Source: Lukasz, D., et al. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates live imaging of calcium influx in the lateral-line hair cells of a paralyzed transgenic zebrafish larva using a confocal microscope. Mechanical stimulation of hair bundles via fluid pulses induces calcium entry through mechanotransduction channels and voltage-gated channels, which is visualized in real-time using fluorescence indicators. The method...

Imaging Calcium Dynamics in Lateral-Line Hair Cells of Larval Zebrafish

Primaire cilia beïnvloeden verschillende signaalroutes. De cochlea van zoogdieren is ideaal voor het onderzoeken van planaire celpolariteit (PCP) signalering. Cilia-disfunctie beïnvloedt cochleaire uitgroei, cellulaire patterning en oriëntatie van haarcellen, uitlezingen van PCP. Ons doel is om PCP-signalering in muis cochlea te analyseren via fenotypische analyse, immunohistologie en rasterelektronenmicroscopie.

Evaluatie van Planar-Cell-Polariteit Phenotypes in ciliopathie Mouse Mutant Cochlea

(Rana catesbeiana) sacculus De Amerikaanse brulkikker's maakt rechtstreeks onderzoek van hair-cel fysiologie. Hier de dissectie en de voorbereiding van sacculus de brulkikker voor biofysische studies beschreven. We tonen representatieve experimenten uit deze haarcellen, inclusief de berekening van een bundel van kracht-verplaatsing relatie en meting van de ongedwongen beweging.

Fysiologische Bereiding van haarcellen van het sacculus van de Amerikaanse brulkikker (<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

Dit protocol wordt beschreven methoden om vast te leggen van de auditieve brainstem response van postnatale rat pups. Om te onderzoeken de functionele ontwikkeling van buitenste haarcellen, is de experimentele procedure van geheel-cel patch klem opnemen in geïsoleerde buitenste haarcellen stapsgewijze beschreven.

Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten

De zebravis is een modelsysteem dat heeft veel waardevolle eigenschappen met inbegrip van optische helderheid, snelle externe ontwikkeling, en, met name van belang op het gebied van gehoor en evenwicht extern gelegen zintuiglijke haarcellen. Dit artikel schetst hoe transgene zebrafish kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van zowel de Haarcel mechanosensation en de presynaptische functie in toto.

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Hier presenteren we een methode voor het visualiseren van de opname van 3 kDa Texas Red-gelabelde dextran in auditieve haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Daarnaast kan dextrans van 3-10 kDa worden gebruikt om endocytose in haar en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti te bestuderen.

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.

Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen

Leer HPICM-beeldvorming van levende zoogdier auditieve haarcellen met nanoschaalresolutie. Deze niet-contactmethode maakt tijdopname van stereocilia bundels mogelijk zonder fysieke schade.

Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

Meer video's verkennen