Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Het gestandaardiseerde optogenetische protocol is ontworpen voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het gebruik van licht als de stimulus om cellulaire eigenschappen in gemanipuleerde zoogdiercelsystemen te regelen. Dit protocol is eenvoudig te implementeren in laboratoria die anders niet bekend zijn met optogenetica en biedt methoden voor nauwkeurige ruimtelijke temporele controle van gemanipuleerde biologische systemen. Deze methode heeft een breed scala aan toepassingen in specifieke onderzoeksgebieden waar spatiotemporale informatie belangrijk kan zijn, waaronder kankerbiologie, systeembiologie en weefseldifferentiatie.

Selecteer om te beginnen de genetische componenten om bind te combineren in een enkel gencircuit of plasmide. Bijvoorbeeld DNA-integratieplaatsen voor zoogdieren, lichtgevoelige elementen of functionele genen. Na het assembleren en onderzoeken van alle noodzakelijke functies zoals startcodons, regulerende of vertaalde sequenties, gebruikt u genetische manipulatie en moleculaire kloonsoftware, annoteert en slaat u de DNA-sequenties op voor later gebruik en als referentie.

Valideer de primers computationeel voor plasmideconstructie via de ingebouwde moleculaire kloonsoftwarefuncties, bijvoorbeeld sequentie-uitlijning. Om een stabiele cellijn te genereren, transfecteer de ontwerpgencircuits en de gewenste cellen met behulp van een liposoommengsel van het gencircuit-DNA met de juiste recombinase. Nadat cellen 80 tot 100% confluent zijn, vriest u de cellen in een mix van 45% oude media, 45% verse media en 10% DMSO.

Breng de resterende cellen over naar een steriele buis en voer eencellige sortering uit om monoklonale cellen te isoleren in een 96-well plaat. Ongeveer twee tot drie weken na monoklonale sortering moeten de putten in de 96-putplaat foci hebben. Wanneer 50 tot 60% confluentie is bereikt, splitst u de cellen in een 12-well plaat.

Voeg de firmware toe aan het geassembleerde LPA-circuit met behulp van een microcontrollerprogrammeur. Combineer vervolgens 3D-geprinte onderdelen in de geassembleerde printplaat met behulp van de montageplaat, de printplaat, de LED-afstandhouder, de plaatadapter, een 24-well plaat, een plaatdeksel, montagebouten, vleugelmoeren en stapelcomponenten. Om een optogenetisch experiment te beginnen, gebruikt u de Iris-software die beschikbaar is op de Tabor Lab-website om een SD-kaart voor de LPA te programmeren en de juiste lichtomstandigheden te verkennen.

Voer vervolgens intensiteitswaarden in met de technische replicaties voor het gewenste experimentele overzicht. Voeg ongeveer 75.000 cellen per put toe in een zwarte plaat met 24 putten in een totaal volume van 500 microliter en plaats de cellen vervolgens in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide om ze twee tot zes uur te laten bezinken. Na het overbrengen van de cellen in de weefselkweekkap aan het einde van de incubatie, verwijdert u het plastic deksel en voegt u een kleeffoliestrip toe aan de bovenkant van de plaat om de lichtoverdracht tussen de putten te minimaliseren, zodat het licht alleen via de LED aan de onderkant van de put kan binnenkomen.

Plaats de plaat in de gemonteerde 3D-delen van de LPA en bedek de plaat vervolgens met het 3D-geprinte LPA-deksel dat over de apparaatschroeven op elke hoek past. Sluit het apparaat aan op de voedingsbron en druk op de resetknop op het LPA-apparaat om ervoor te zorgen dat de bijgewerkte LPA-experimentinstellingen worden toegepast en de cellen te incuberen. Verwijder na de incubatie in de weefselkweekkap de foliestrip van de plaat en laat de plaat één tot twee minuten zitten om condensvorming op het plastic deksel te voorkomen.

Plaats vervolgens het originele plastic deksel terug op de plaat en stel de cellen in beeld met de juiste fasecontrast- of fluorescentiemicroscoop. Na 24 tot 72 uur na inductie, gevolgd door trypsinisatie, brengt u de volledige inhoud van elke put van ongeveer 500 microliter over naar de gelabelde buizen die zijn uitgerust met de celzeef. Maak vervolgens met behulp van geschikte flowcytometrie-instrumentsoftware een voorwaartse en zijwaartse scatterpoort om de afzonderlijke cellen van de juiste grootte en granulariteit vast te leggen om puin en cellulaire klonten uit te sluiten.

Zodra de poort is ingesteld, vangt u ongeveer 10.000 cellen met de juiste poort en past u het celnummer aan, afhankelijk van de hoeveelheid vereiste mobiele gegevens en herhaalt u het vastleggen van experimentele cellen in elke buis. Breng na inductie en trypsinisatie de volledige inhoud van elke put van ongeveer 500 microliter over naar de gelabelde buizen. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 400 maal G.Na het weggooien van het supernatant, verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast.

Resuspend de cellen in 750 tot 1.000 microliter van 4% PFA verdund in PBS en pipetteer meerdere keren op en neer om de celklonten te breken. Voeg na 15 minuten incubatie 750 tot 1.000 microliter PBS toe en pipetteer opnieuw meerdere keren op en neer en pellet vervolgens de cellen gedurende vijf minuten met 400 keer G bij kamertemperatuur. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast en resuspendeert u de cellen in 750 tot 1.000 microliter ijskoude methanol zoals gedemonstreerd en laat u de cellen 30 minuten in een vriezer van min 20 graden Celsius zitten.

Voeg na de incubatie 750 toe aan 1.000 microliter PBS door meerdere keren op en neer te pipetteren. Na het centrifugeren van de cellen gedurende vijf minuten op 400 maal G, gooit u het supernatant weg en verplaatst u de monsters naar een chemische zuurkast. Resuspend de cellen in 100 microliter of een andere geschikte verdunning van gelabeld primair antilichaam en pipetteer zes tot acht keer op en neer en incubeer vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 750 tot 1.000 microliter van de incubatiebuffer en pipetoplossing meerdere keren op en neer toe, centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten op 400 keer G.Next, resuspend de cellen in 500 microliter PBS en breek de klonten door meerdere keren op en neer te pipetteren. Breng de volledige inhoud van elke buis over naar gelabelde buizen met celzeefjes. Breng de cellen naar geschikte flowcytometrie-instrumenten met lasers van de juiste golflengten.

De optische kalibratie werd uitgevoerd voor de apparaten. Met behulp van het verkregen beeld werden compensatiewaarden voor LED berekend, achtergrondsignaal afgetrokken en pixelintensiteit afgeleid. De variatiecoëfficiënt was minimaal tussen 96 putten.

De kalibratiesoftware demonstreerde de LED-variatie per locatie en creëerde een grijsschaalaanpassing zodat elke LED wordt genormaliseerd tot dezelfde intensiteit. Genexpressie werd geïnduceerd in gemanipuleerde lichtere cellen via fluorescentiemicroscopie bij verschillende lichtpulsduur op de LPA en de cellen werden in beeld gebracht voor Brightfield- en GFP-expressie. Met behulp van flowcytometrie werden de cellen geïnduceerd bij verschillende pulslengtewaarden en vertoonden ze een dosisrespons van genexpressie gekwantificeerd op populatieniveau van meer dan viervoudige verandering van niet-geïnduceerde toestanden.

De negatieve feedback die werd bereikt over een vijfvoudige genexpressieruisreductie, zoals blijkt uit het vergelijken van verschillende lichtintensiteitswaarden voor het lichtere systeem versus levendig of licht aan. De qPCR-analyse toonde aan dat de gemanipuleerde lichtere cellen RNA-niveaus tot expressie brachten op een dosisresponsieve manier met meer dan tienvoudige inductie uit niet-geïnduceerde toestanden, overeenkomend met de kwantificering van de flowcytometrie. Het gemanipuleerde lichtere gencircuit vertoonde toenemende hoeveelheden blauw licht die resulteerden in verhoogde KRAS-eiwitniveaus en gefosforyleerde ERK-niveaus.

Verschillende functionele assays kunnen worden uitgevoerd, waaronder groei, celmotiliteit, wondgenezing, proliferatie of invasie assays. Deze methoden kunnen specifieke inzichten bieden in de mechanismen van kankerbiologie, weefseldifferentiatie of medicijnresistentie.