Name: Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer de site-specifieke lysine-acetylatie van histonen voor nucleosoomreconstitutie met genetische code-uitbreiding in Escherichia coli. Deze methode produceert gemodificeerde nucleosomen voor epigenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Wesley Wang bedanken voor het leggen van de basis voor dit protocol en zijn waardevolle mentorschap. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door National Institutes of Health (Grants R01GM127575 en R01GM121584) en Welch Foundation (Grant A-1715).

1. Plasmide bouw
<ol><li>Begin met te beslissen welk histoneiwit zal worden geacetyleerd en op welke lysineplaats. Muteer de site naar de amber stop codon (TAG) met behulp van site directed mutagenesis. OPMERKING: Er zijn vier eerder ontworpen plasmiden die worden gebruikt voor de expressie van histoneiwitten. Alle vier histoneiwitten werden gekloond in de pETDuet-1 vector met een N-terminale histidine tag. Histone H4 bevat ook een SUMO-tag, de oorsprong van replicatie colE1 met een kopienummer van ongeveer 40, ampicillinebestendig en een T7-promotor.<ol>
<li>Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers die een TAG-mutatie op de gewenste plaats bevatten (een bestaande lysinecodon vervangen door de amberstopcodon) in een van de vier histoneiwitplasmiden.</li>
		<li>Gebruik whole-plasmid PCR om de TAG met plasmide te versterken. Bepaal een geschikte gloeitemperatuur voor de primers. Over het algemeen is de smelttemperatuur (Tm) van de primers minus 5 °C voldoende. Als er problemen zijn bij het verkrijgen van een PCR-product, kan een temperatuurgradiënt rond Tm - 5 °C worden gebruikt om de gloeitemperatuur voor versterking te optimaliseren. OPMERKING: In dit experiment werd gedurende 30 cycli een in-house uitgedrukt PFU-polymerase gebruikt met de volgende omstandigheden: 94 °C gedurende 30 s (denaturatie), gloeitemperatuur gedurende 30 s en 72 °C gedurende 6 min (of 1 min per kilobase-paar). Voor meer informatie over dit type PCR-methode zie Liu en Naismith7.</li>
		<li>Ruim het PCR-product op met een PCR-opruimkit volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer het PCR-product door agarosegelelektroforese en daaropvolgende ethidiumbromidekleuring.</li>
		<li>Ligateer de plasmide door 's nachts bij 16 °C te broeden met T4-ligase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformeer eerst de TAG met plasmide (AmpR) in chemisch competente Escherichia coli. Kies minimaal 4 kolonies uit de transformatie en zuiver de plasmide. Maak celvoorraden van elk met glycerol met behulp van standaardmethoden en bewaar bij -80 °C. Stuur voor sequencing om de gewenste TAG-mutatie te bevestigen.</li>
	<li>Zodra de sequentie is bevestigd, co-transformeert u de TAG-bevattende plasmide (AmpR) met pEVOL-AckRS (ChlR) in chemisch competente CobB (de enige histon lysine deacetylase bekend in E. coli.) deletie BL21 cellen met behulp van de hitteschokmethode. pEVOL is een plasmide met een mid-copy-number naar low-copy-number p15A origin. OPMERKING: De pEVOL-reeks plasmiden werd geconstrueerd op basis van eerdere studies waaruit bleek dat een verhoogde expressie van het orthogonale aaRS/tRNATyr-paar effectief was bij het verminderen van eiwitafkaping en bij het verhogen van de totale opbrengsten van gemuteerde eiwitten8. Als CobB-deletiecellen niet toegankelijk zijn, gaat u verder met chemisch competente BL21-cellen. CobB is een Sirtuin-achtige histonlysine deacetylase en Nicotinamide kan worden toegevoegd bij een 5 mM eindconcentratie tijdens histon eiwitexpressie om CobB te remmen als alternatieve benadering9.</li>
	<li>Maak een celvoorraad en bewaar bij -80 °C.</li>
</ol>2. Geacetyleerde histon eiwitexpressie
<ol><li>Bereid 1 L autoclaaf 2YT-media (of volume naar keuze) in een kweekkolf.</li>
	<li>Ent 20 ml 2YT-media met de juiste antibiotica met de co-getransformeerde celvoorraad met de TAG-bevattende plasmide (AmpR) en pEVOL-AckRS (ChlR) en groei bij 37 °C tot OD = 0,6 (4-6 uur).</li>
	<li>Voeg de juiste antibiotica toe aan de 1 L autoclaaf 2YT-media en inenteer met de 20 ml startcultuur. Groeien bij 37 °C tot OD = 0,6-0,8 (2-3 uur).</li>
	<li>Voeg inducerende middelen en acetyllysine (AcK) toe aan de eindconcentraties van IPTG 1 mM, 0,2% arabinose en AcK 5 mM.</li>
	<li>Kweek de cultuur bij 37 °C gedurende 6-8 uur.</li>
	<li>Pelletcellen op 2.700 x g gedurende 15 min.</li>
	<li>Bewaar de celkorrel 's nachts bij -80 °C.</li>
	<li>Houd vanaf deze stap het monster altijd op ijs. Los de celkorrel op in 50 ml histonlysebuffer per 1 L cultuur.</li>
	<li>Sonicaat volgens de volgende cyclus: 1 s aan, 1 s uit, totaal op tijd: 3 min bij 60% amplitude.</li>
	<li>Pellet inclusie lichamen op 41.600 x g gedurende 45 min.</li>
	<li>Gooi de supernatant en resuspend inclusie lichamen in 30 ml histon lysis buffer. Pellet inclusie voorspelt op 41.600 x g gedurende 30 min.</li>
	<li>Gooi de supernatant en resuspend inclusielichamen weg in 30 ml pelletwasbuffer. Pellet inclusie lichamen op 41.600 x g gedurende 30 min.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en los inclusielichamen op in 25 ml 6 M Guanidine Hydrochloride (GuHCl) buffer. Incubeer met agitatie bij 37 °C gedurende 1 uur. OPMERKING: Indien nodig kunnen inclusielichamen 's nachts bij 4 °C worden geïncubeerd met agitatie.</li>
	<li>Pellet inclusie voorspelt op 41.600 x g gedurende 45 min. Incubeer het supernatant met 1 ml Ni-NTA hars geëquilibreerd met 6 M GuHCl buffer gedurende 2 uur.</li>
	<li>Ga verder met Ni-NTA zuivering onder gedenatureerde omstandigheden. Was de kolom met 3 kolomvolumes kolomwasbuffer. Elute acetylated histon eiwit met 10 ml elutie buffer. OPMERKING: Proberen om het eiwit hier te concentreren is een optie, maar geacetyleerde histonen zijn zeer onvoorspelbaar en kunnen gemakkelijk neerslaan. Het wordt niet aanbevolen om zich te concentreren voorbij 2 ml in het totale volume.</li>
	<li>Dialyzeer het geacetyleerde histoneiwit uitgebreid tegen 5% azijnzuurbuffer om zouten te verwijderen. Dialyze gedurende 3 uur per keer bij 4 °C, minimaal 6 keer inwisselen voor verse buffer. OPMERKING: Voor een betere eiwitzuiverheid is er een optie om te dialyseren tegen zuiver water. Dit veroorzaakt echter aanzienlijke neerslag en vermindering van de opbrengst, wat ongewenst kan zijn voor laagproductieve geacetyleerde histoneiwitten.</li>
	<li>Aliquot en lyophilize eiwit, en bewaren voor onbepaalde tijd bij -80 °C. Wild type histon eiwitten leveren over het algemeen 10-50 mg/L, terwijl geacetyleerde histon eiwitten minder dan 10 mg/L opleveren, afhankelijk van de specifieke lysine site. H3K79Ac is bijvoorbeeld gemiddeld 5 mg/L.</li>
</ol>3. Wild-type histon eiwitexpressie
<ol><li>Om volledige nucleosomen te assembleren, drukt u alle 4 histoneiwitten uit. Bij het uitdrukken en zuiveren van histonen van het wilde type is het protocol hetzelfde als de geacetyleerde histonen, behalve de volgende:<ol>
<li>Voer geen co-transformatie uit. Gebruik pEVOL-AcKRS niet voor wild type histon expressie. Pas antibiotica dienovereenkomstig aan.</li>
		<li>Gebruik geen CobB-deletiecellijn en voeg geen Nicotinamide, AcK of arabinose toe tijdens inductie van cellulaire expressie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Voorbereiding van 601 DNA
OPMERKING: Een eerder ontworpen geoptimaliseerde DNA-sequentie om nucleosoompositionering te sturen, wordt geassembleerd met histonocomeren om mononucleosoom met een hoog rendement te produceren. Deze sequentie wordt 601 DNA of de Widom-sequentie genoemd. Deze sequentie is de standaard DNA-sequentie geworden voor in vitro studies van nucleosomen van chromatineremodelleringstesten tot metingen met één molecuul10.
<ol><li>Om aanzienlijke hoeveelheden van 601 DNA voor nucleosoomassemblage te bereiden, transformeert u pGEM-3z/601 in Top 10-cellen en kweekt u 10 ml cultuur voor plasmideversterking en extractie. Gebruik een plasmide-extractiekit en volg de aanbeveling van de fabrikant op.</li>
	<li>Gebruik een in-house uitgedrukte PFU polymerase (efficiënter) voor dit versterkingsprotocol. Stel een PCR-reactie in: Gebruik voor een reactie van 250 μL 207,5 μL autoclaaf MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2,5 μL. We voeren meestal 60 reacties tegelijk uit om genoeg DNA te krijgen om te assembleren.</li>
	<li>Gebruik een gloeitemperatuur van 52 °C gedurende 30 s en een verlengingstijd van 30 s bij gebruik van PFU-polymerase. Volg anders de door de fabrikant aanbevolen voorwaarden.</li>
	<li>Zodra PCR klaar is, gebruikt u een PCR-opruimkit naar keuze om het PCR-product te zuiveren.</li>
</ol>5. Assemblage van histone octamer
<ol><li>Los aliquots van histon eiwitkorrels H2A, H2B, H3 en H4 op, zodat er een aparte voorraad van elk histoneiwit in GuHCl Buffer is met een totaal volume van 100 μL.</li>
	<li>Bereken de concentratie van elk histoneiwit door de A280-absorptie te meten.</li>
	<li>Als de absorptie groter is dan 1 voor elk eiwit, verdun dan met guhcl buffer om een nauwkeurigere concentratie te krijgen.</li>
	<li>Combineer H2A- en H2B-eiwitten in een molaire verhouding van 1:1 en verdun tot een totale eiwitconcentratie van 4 μg/μL. Herhaal dit voor H3 en H4.</li>
	<li>Dialyseer 's nachts bij 4 °C tegen 2 M TE-buffer, 1 M TE-buffer gedurende 2 uur en 0,5 M TE-buffer gedurende 5 uur. OPMERKING: De tweede en derde stap van dialyse zorgt ervoor dat onstabiele conformaties van eiwitten neerslaan. Er wordt verwacht dat er bij deze stappen zware neerslag zal vallen.</li>
	<li>Verwijder neerslag door centrifugeren bij 16.800 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Bereken nogmaals de concentratie histon dimers (H2A/H2B mengsel) en tetrameren (H3/H4 mengsel) die de A280 absorptie meten.</li>
	<li>Meng dimers en tetrameren in een molaire verhouding van 1:1 en stel NaCl in op 2 M door toevoeging van vaste NaCl.</li>
	<li>Histon octameer kan worden bewaard bij 4 °C en is stabieler dan dimers en tetrameren. Bevries nooit zijn toonoctameer, omdat dit demontage kan veroorzaken.</li>
	<li>Als u zich assembleert met geacetyleerde histonen, vervangt u gewoon het wilde type eiwit door het geacetyleerde eiwit in de procedure.</li>
</ol>6. Nucleosoomassemblage
<ol><li>Gebruik 100x TE buffer en solid NaCl om 601 DNA aan te passen aan 2M TE buffer. Voeg het 601 DNA in 2M TE buffer toe aan histon octameer in een molaire verhouding van 0,85:1 tot 0,90:1. Een lagere verhouding DNA kan worden toegevoegd als er vrij DNA aanwezig is in de gelverschuivingsanalyse.</li>
	<li>Breng het DNA-histonmengsel over in een dialysezak en plaats het in ongeveer 200 ml 2 M TE-buffer (of meer bij het samenstellen van meerdere monsters) en roer heel voorzichtig bij 4 °C.</li>
	<li>Stel een peristaltische pomp in om te zuiveren om langzaam te druppelen in geen zout TE-buffer. Wanneer het volume ongeveer verdubbeld is, giet je de helft van het volume uit. Doe dit in totaal minstens 4 keer. Bij een pomp kan dit 4-8 uur duren, afhankelijk van het startvolume. Nucleosomen vormen zich wanneer de zoutconcentratie wordt verlaagd tot 150 mM (gemeten met een zoutgehaltemeter).</li>
	<li>Nadat de zoutconcentratie is verlaagd tot 150 mM, dialyseer u 's nachts tegen een TE-buffer van 20 mM.</li>
	<li>Verwijder neerslag door centrifugeren en meet de concentratie van de nucleosomen met een260-aflezing met behulp van een plaatlezer.</li>
	<li>Voeg His-TEV protease (TEV: nucleosoom 1:30, w:w ) toe en incubeer 's nachts bij 4 °C om alle histidinetags te verwijderen. Verwijder de histidine tag onzuiverheden uit de nucleosoomoplossing door Ni-NTA hars naar beneden te trekken.</li>
	<li>Om het nucleosoom te plaatsen en het monster te homogeniseren, incubeer u gedurende 1 uur bij 60 °C. OPMERKING: Voor acetylated sites die bijzonder onstabiel zijn, is deze stap mogelijk niet aan te raden.</li>
	<li>Bewaar nucleosomen voor korte termijn (enkele weken) bij 4 °C.</li>
	<li>Voor langdurige opslag, dialyze nucleosomen tegen opslagbuffer en opslaan bij -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

Er zijn geen concurrerende financiële belangen om door een van de auteurs te verklaren.

Het is essentieel om dit protocol in elk detail te volgen tijdens een experiment. Nucleosomen zijn niet erg stabiel en er is veel vallen en opstaan gegaan bij het bepalen van dit protocol. Het is belangrijk om neerslag bij elke stap (of wanneer waargenomen) te verwijderen, omdat deeltjes gemakkelijk de assemblageprocessen kunnen verstoren. Hou zijn toonmonsters altijd op ijs. Als nucleosomen te lang bij 4 °C worden bewaard, kunnen ze spontaan uit elkaar vallen. Zorg ervoor dat u monsters van Native PAGE controleert als d...

We hebben PylRS en tRNAPyl gebruikt om gereconstitueerde mononucleosomen te synthetiseren en te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. PylRS is van onschatbare waarde gebleken als een genetische code-uitbreidingstool om eiwitten te produceren met post translationele modificaties (PTM's) en is genetisch geëvolueerd om ongeveer 200 verschillende NCA's op te nemen. PylRS neemt op bij een amber stop codon, waardoor concurrentie van andere aminozuren tijdens de vertaling wordt verwijderd. PylRS werd voor het eerst ontdekt in methanogene archaea en is sindsdien gebruikt in de chemische biologie om nieuwe reactieve chemische groepen op te nemen in eiwitten1,2.
MmAcKRS1 is geëvolueerd uit Methanosarcina mazei PylRS en wordt vaak gebruikt in ons laboratorium voor de synthese van geacetyleerde eiwitten3,4,5,6. MmAcKRS1 levert AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is eerder gebruikt om AcK op K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 en K79 histon H3 lysine sites te bestuderen om de activiteit van Sirtuin 1, 2, 6 en 7 op geacetyleerde mononucleosomen4,5,6te bestuderen . Hier beschrijven we deze methode om geacetyleerde histonen uit te drukken en geacetyleerde nucleosomen te reconstitueren.

<table><tbody><tr><td>0.5 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>1 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>100x TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>20 mM TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>Acetyllysine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Column Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>6 M ureum, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazool pH 7.8</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV protease</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histone Lysis Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td></td><td></td><td>6 M ureum, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazool, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Storage Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site specifieke lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Geacetyleerde histoneiwitten kunnen gemakkelijk worden uitgedrukt in Escherichia coli die codeert voor een mutant, Nε-acetyl-lysine (AcK)-specifieke Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) en zijn cognate tRNA (tRNAPyl) om gereconstitueerde mononucleosomen te assembleren met sitespecifieke geacetyleerde histonen. MmAcKRS1 en tRNAPyl leveren AcK op een amber mutatieplaats in het mRNA naar keuze tijdens vertaling in Escherichia coli. Deze techniek is uitgebreid gebruikt om AcK op H3 lysine sites op te nemen. Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) kan ook gemakkelijk worden geëvolueerd om andere niet-canonische aminozuren (ncAAs) op te nemen voor sitespecifieke eiwitmodificatie of functionalisatie. Hier beschrijven we een methode om AcK met behulp van het MmAcKRS1-systeem in histon H3 op te nemen en acetylated H3-eiwitten te integreren in gereconstitueerde mononucleosomen. Geacetyleerde gereconstitueerde mononucleosomen kunnen worden gebruikt bij biochemische en bindende assays, structuurbepaling en meer. Het verkrijgen van gemodificeerde mononucleosomen is cruciaal voor het ontwerpen van experimenten met betrekking tot het ontdekken van nieuwe interacties en het begrijpen van epigenetica.

Dimers, tetrameren en octameren kunnen worden beoordeeld door een 12% SDS PAGE gel te gebruiken (figuur 1 en figuur 2). Hier kunt u zien dat sommige van de geacetyleerde tetrameren een lagere opbrengst hebben dan andere (Figuur 1). In feite, hoe dichter bij het kerngebied, hoe lager de waargenomen opbrengst. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de acetylatie interfereren met de assemblage van de tetra...

Hier presenteren we een methode om geacetyleerde histoneiwitten uit te drukken met behulp van genetische code-uitbreiding en gereconstitueerde nucleosomen in vitro te assembleren.

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Het verkrijgen van gemodificeerd mononucleosomen is cruciaal voor het ontwerpen van epigenetische experimenten. Ons protocol levert geacetyleerde gereconstitueerde mononucleosomen die kunnen worden gebruikt in biochemische en bindingstests, structuurbepaling en meer. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is de veelzijdigheid ervan.Dit systeem kan gemakkelijk worden aangepast om vele soorten modificaties in mononucleosomen op te nemen. Begin met het bereiden van één liter gesteriliseerd 2YT-medium in een kweekfles. Inoculeer 20 milliliter van het medium met geschikte antibiotica met de co-getransformeerde celstapel die het tag-bevattende plasmide en pEVOL-AckRS heeft en kweek ze bij 37 graden Celsius om een OD van 0,6 te verkrijgen.Voeg geschikte antibiotica toe aan één liter gesteriliseerd 2YT-medium en inoculeer het met 20 milliliter van de startercultuur. Kweek de cultuur bij 37 graden Celsius gedurende twee tot drie uur om een OD van 0,6 te verkrijgen, 2,8. Voeg inducerende agenten en AcK toe voor een uiteindelijke concentratie van één millimolar IPTG, 0,2%arabinose en vijf millimolar AcK.Kweek de cultuur bij 37 graden Celsius gedurende zes tot acht uur. Pel de cellen vervolgens bij 2.700 x g gedurende 15 minuten en bewaar ze 's nachts bij min 80 graden Celsius. Los het pellet op in 50 milliliter histon-lysisbuffer per liter cultuur en soniceer de cellen bij 60%amplitude gedurende drie minuten met intervallen van één seconde aan en één seconde uit.Pellet inclusielichamen bij 41.600 x g gedurende 45 minuten. Gooi het supernatant weg en resuspendeer vervolgens de inclusielichamen in 30 milliliter histon-lysisbuffer, centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende 30 minuten. Resuspendeer inclusielichamen opnieuw in 30 milliliter pelletwasbuffer en herhaal de centrifugering.Los vervolgens inclusielichamen op in 25 milliliter zes molare guanidinehydrochloridebuffer. Incubeer met roeren gedurende één uur bij 37 graden, centrifugeer vervolgens gedurende 45 minuten. Incubeer het supernatant met één milliliter nikkel-NTA-hars geëquilibreerd met zes molare guanidiniumhydrochloridebuffer gedurende twee uur en ga door met nikkel-NTA-zuivering onder gedenatureerde omstandigheden.Was de kolom met drie kolomvolumes wasbuffer en elueer vervolgens geacetyleerd histon-eiwit met 10 milliliter elutiebuffer. Dialyseer het geacetyleerde histon-eiwit tegen 5%azijnzuurbuffer om zouten te verwijderen gedurende drie uur bij vier graden Celsius, ververs de buffer minimaal zes keer. Deel in aliquoten en bewaar het eiwit onbeperkt bij min 80 graden.Los aliquoten van histon-eiwitpellets H2A, H2B, H3 en H4 op zodat er een aparte voorraad van elk histon-eiwit in guanidiniumhydrochloridebuffer is voor het totale volume van 100 microliter. Bereken de concentratie van elk histon-eiwit door de absorptie bij 280 nanometer te meten. Als de absorptie groter is dan één voor elk eiwit, verdun met guanidiniumhydrochloridebuffer om een ​​nauwkeuriger concentratie te verkrijgen.Combineer H2A met H2B en H3 met H4-eiwitten in een molaire verhouding van één-op-één en verdun tot een totale eiwitconcentratie van vier microgram per microliter. Dialyseer sequentieel bij vier graden Celsius tegen twee molare TE-buffer gedurende een nacht, één molare TE-buffer gedurende twee uur en 0,5 molare TE-buffer gedurende vijf uur. Wanneer u klaar bent, centrifugeer bij 16.800 x g bij vier graden Celsius om het precipitaat te verwijderen.Bereken de concentratie van histon-dimeer en -tetrameer door de absorptie bij 280 nanometer te meten. Meng de dimeren en tetrameren in een molaire verhouding van één-op-één en pas de natriumchlorideconcentratie aan tot 2M. Pas 601 DNA aan naar twee molare TE-buffer met behulp van 100X TE-buffer en vast natriumchloride.Voeg de oplossing toe aan het histon-octamer in een molaire verhouding van 0,85, 2,9 tot één. Breng het DNA-histonmengsel over naar een dialysezak en plaats deze in ongeveer 200 milliliter twee molare TE-buffer met zeer zacht roeren bij vier graden Celsius. Stel een peristaltische pomp in om langzaam no-zout TE-buffer in te druppelen.Wanneer het volume ongeveer verdubbeld is, giet de helft van het volume weg. Doe dit minimaal vier keer, wat vier tot acht uur kan duren, afhankelijk van het startvolume. Nadat de zoutconcentratie is verlaagd tot 150 millimolar, dialyseer gedurende een nacht tegen een 20 millimolare TE-buffer.Verwijder precipitaat door centrifugatie en meet de concentratie van de nucleosomen met een platelezer. Voeg his-TEV-protease toe en incubeer gedurende een nacht bij vier graden Celsius om alle histidine-tags te verwijderen. Verwijder vervolgens de histidine-tag-onzuiverheden uit de nucleosome-oplossing met nikkel-NTA-hars pull down.Incubeer gedurende één uur bij 60 graden Celsius om het nucleosoom te positioneren en het monster te homogeniseren. Bewaar nucleosomen op korte termijn bij vier graden Celsius. Voor langdurige opslag dialyseer nucleosomen tegen de opslagbuffer en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.Sommige van de geacetyleerde tetrameren hadden een lagere opbrengst dan andere, zoals vastgesteld door een 12%SDS-PAGE-gel te draaien. Hoe dichter bij het kerngebied, hoe lager de waargenomen opbrengst. Dit was waarschijnlijk te wijten aan de acetylering, die interfereerde met de octamersamenstelling.Na het assembleren van octameren met de 601 DNA-sequentie, kan het nucleosoom worden beoordeeld met behulp van een 5%1X TBE-native PAGE-gel gevolgd door kleuring met etidiumbromide. Voordat thermische positionering wordt uitgevoerd, zijn de waargenomen nucleosome-banden erg breed en kunnen ze strekken. Houd bij het uitvoeren van dit protocol de eiwitten altijd op ijs.Het is cruciaal om geassembleerde dimeren, tetrameren en nucleosomen te behouden. Deze procedure heeft onderzoekers in staat gesteld om de acetyllysine-plaatsen te installeren, specifiek in mononucleosomen, wat de deur opent naar het bestuderen van post-translationele modificaties in een chromatin

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We presenteren een methode voor het gebruik van MALDI massaspectrometrie en reductieve methylatie chemie op veranderingen in de lysine-methylatie te kwantificeren.

Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit

Een gebruiksvriendelijk, celvrij expressieprotocol voor de residurespecifieke incorporatie van niet-canonieke aminozuuranalogen in eiwitten, inclusief downstream-analyse, wordt gepresenteerd voor medisch, farmaceutisch, structureel en functioneel onderzoek.

Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transcriptie-vertaalsysteem

Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Uitbreiding van de genetische code dient als een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van een breed scala aan biologische processen, met inbegrip van eiwit acetylation. Hier tonen we een facile protocol misbruiken van deze techniek voor het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke sites in Escherichia coli cellen.

Een Facile Protocol voor het genereren van Site-Specifically geacetyleerd eiwitten in Escherichia Coli

Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Dit artikel presenteert een gedetailleerde experimentele procedure voor het reconstrueren van nucleosoombevattende DNA-kettingen voor correlatieve kracht en fluorescentiemicroscopie van één molecuul. Het beschrijft verder verschillende stroomafwaartse experimenten die kunnen worden uitgevoerd om het bindingsgedrag van chromatine-interagerende eiwitten te visualiseren en veranderingen in de fysische eigenschappen van nucleosomen te analyseren.

In situ nucleosoomassemblage voor correlatieve kracht van één molecuul en fluorescentiemicroscopie

Deze studie stelde een methode vast die genetische code-uitbreiding gebruikt om lactyllysine (Klac) succesvol te integreren op specifieke locaties van de menselijke enolase-1 (hENO1) en superfolder GFP (sfGFP) in Escherichia coli - en zoogdiercellen.

Site-specifieke lysinelactylering via genetische code-expansie in E. coli - en zoogdiercellen

Leer de site-specifieke lysine-acetylatie van histonen voor nucleosoomreconstitutie met genetische code-uitbreiding in Escherichia coli. Deze methode produceert gemodificeerde nucleosomen voor epigenetisch onderzoek.

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli (Video) | JoVE Journal

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Meer video's verkennen