Name: Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Leer real-time beeldvorming van calcium- en glutamaatsignalen bij Arabidopsis thaliana om systemische wondreacties in planten te bestuderen. Deze methode onthult snelle signaalpropagatie door het vaatstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 en 18H05491) aan MT, de National Science Foundation (IOS1557899 en MCB2016177) en de National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G en 80NSSC19K0126) aan SG.

1. Voorbereiding van plantaardig materiaal
<ol><li>Steriliseer in een microbuis van 1,5 ml de zaden van de Arabidopsis thaliana (Col-0 toetredings)plant, die GCaMP3 of CHIB-iGluSnFR uitdrukt door 3 minuten met 20% (v/v) NaClO te schudden en vervolgens 5 keer te wassen met steriel gedestilleerd water. OPMERKING: De transgene lijnen van Arabidopsis die GCaMP3 of CHIB-iGluSnFR uitdrukken, zijn eerder beschreven6.</li>
	<li>Zaai in een steriele kap 13 oppervlaktegesteriliseerde zaden op een vierkante plastic petrischaal van 10 cm gevuld met 30 ml steriel (autoclaaf) Murashige en Skoog (MS) medium [1x MS-zouten, 1% (w/v) sacharose, 0,01% (w/v) myoinositol, 0,05% (w/v) MES en 0,5% (w/v) Vervang het deksel en de wikkel met chirurgische tape.</li>
	<li>Na incubatie in het donker bij 4 °C gedurende 2 dagen, plaatst u de platen horizontaal op 22 °C in een groeikamer onder continu licht (90-100 μmol m-2 s-1) gedurende ongeveer 2 weken voor gebruik. Tel na 2 weken het aantal Arabidopsisbladeren van oudste naar jongste44 (figuur 1). Wondreacties gaan bij voorkeur van het beschadigde blad (n) naar bladeren met de ± 3 en n ± 56. OPMERKING: In dit protocol wordt de petrischaal geopend voor het in beeld brengen van de wond- en glutamaateffecten onder een fluorescentiemicroscoop. Daarom moeten de volgende stappen in dit experiment worden uitgevoerd onder temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde ruimteomstandigheden. Dit komt omdat Ca2+ signalen ook worden opgewekt door veranderingen in deze omgevingsomstandigheden. Het is ook bekend dat het blauwe licht, dat tijdens de opname door de microscoop wordt uitgezonden voor excitatie van de fluorescentie van het biosensoreiwit, een toename van cytosolische Ca2 + concentratie45 kan opwekken en dus moet de plant enkele minuten aan de blauwe lichtbestraling worden geacclimateerd voordat met het experiment wordt begonnen.</li>
</ol>2. Chemisch preparaat
<ol><li>Los L-Glutamaat op in een vloeibaar groeimedium [1/2x MS-zouten, 1% (w/v) sacharose en 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 aangepast met 1N KOH] om een 100 mM werkoplossing te maken. OPMERKING: Vermijd het gebruik van zouten van glutamaat zoals natriumglutamaat om mogelijke kationgerelateerde effecten op ca2+ dynamiek te voorkomen.</li>
</ol>3. Microscoop instellen en uitvoeren van real-time beeldvorming
<ol><li>Schakel de gemotoriseerde fluorescentiesterioscoop in die is uitgerust met een 1x objectief (NA = 0,156) en een sCMOS-camera (figuur 2) en configureer de apparaatinstellingen om te bestralen met een excitatielicht van 470/40 nm en een emissielicht te verkrijgen dat door een filter van 535/50 nm gaat. OPMERKING: Elke GFP-gevoelige fluorescentiemicroscoop kan worden gebruikt om GCaMP3- en iGluSnFR-signalen in realtime te detecteren, maar een objectief met een laag vermogen en een zeer gevoelige camera met een brede sCMOS-chip worden aanbevolen om signalen van de hele fabriek te ontvangen. De doelstelling met een laag vermogen maakt het mogelijk om de reactie van een hele Arabidopsis-installatie in beeld te brengen en het gebruik van een zeer gevoelige camera maakt de snelle gegevensverzameling mogelijk die nodig is om het snelle tijdverloop van de door de wond getriggerde Ca2 + -golf vast te leggen. Voor de fluorescentiemicroscoop die in deze studie wordt gebruikt, zijn de maximale waarden van het gezichtsveld en de tijdresolutie respectievelijk 3 cm x 3 cm en 30 frames per seconde (fps).</li>
	<li>Verwijder het deksel en plaats de schotel onder de objectieve lens.</li>
	<li>Controleer het fluorescentiesignaal van de plant en wacht vervolgens ongeveer 30 minuten in het donker totdat de planten zijn aangepast aan de nieuwe omgevingsomstandigheden. Deze aanpassingsstap is vereist omdat veranderingen in vochtigheid [Ca2+]cytverhoging in planten oproepen die wondgerelateerde gebeurtenissen kunnen verstoren.</li>
	<li>Pas de focus en vergroting aan om de hele plant in het gezichtsveld te zien. In het huidige protocol werd een vergroting van 0,63x gebruikt.</li>
	<li>Voordat u met real-time beeldvorming begint, stelt u de acquisitieparameters in om de fluorescentiesignalen te detecteren met behulp van microscoopbeeldsoftware. De instellingen voor beeldvorming in het huidige protocol zijn: belichtings- en intervaltijden ingesteld op respectievelijk 1,8 s en 2 s (d.w.z. 0,5 fps). Stel de opnametijd in op 11 min.</li>
	<li>Afbeelding gedurende 5 minuten voorafgaand aan het starten van het experiment om de plant te acclimatiseren aan de blauwlichtbestraling van de microscoop en begin vervolgens met opnemen door op Nu uitvoerente klikken , of het equivalente commando in de microscoopsoftware die wordt gebruikt. Om de gemiddelde fluorescentie bij aanvang te bepalen, moet u ten minste 10 frames registreren (d.w.z. ten minste 20 s in het huidige protocol) voordat u de behandeling of het glutamaat aanbrengt (zie rubriek 4).<ol>
<li>Voor real-time beeldvorming van wondgeïnduceerde [Ca2+] cyt en [Glu]apoveranderingen, snijdt u de bladsteel of het middelste gebied van blad L1 met een schaar (figuur 3 en figuur 4).</li>
		<li>Voor real-time beeldvorming van glutamaat-geactiveerde [Ca2+]cytveranderingen, snijdt u de rand (ongeveer 1 mm van de punt) van blad 1 over de hoofdader met een schaar. Breng na ten minste 20 minuten herstelperiode 10 μL 100 mM glutamaat aan op het snijoppervlak van het blad (figuur 5). OPMERKING: Deze voorsnijding was nodig om glutamaat toegang te geven tot de bladapoplast om reacties te activeren. Bovendien bleek het aanbrengen van een druppel gedestilleerd water op het snijoppervlak van blad L1 van cruciaal belang om te voorkomen dat de monsters tijdens het herstel uitdroogden voordat glutamaat werd aangebracht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sla na het voltooien van de 11 minuten opname de gegevens op.</li>
</ol>4. Gegevensanalyse
<ol><li>Definieer voor fluorescentie-intensiteitsanalyse in de loop van de tijd een interessegebied (ROI) op de plaats waar de fluorescentie-intensiteit moet worden geanalyseerd (figuur 6 en figuur 7). Definieer voor de snelheidsberekening van de Ca2+ golf 2 ROIs (ROI1 en ROI2) voor analyse. Klik in de beeldvormingssoftware op Tijdmeting | Definieer | Cirkel. Meet de afstand tussen ROI1 en ROI2 door te klikken op Annotaties en Meting | Lengte | Eenvoudige lijn (figuur 6).</li>
	<li>Meet de ruwe fluorescentiewaarden (F) in elke ROI in de loop van de tijd door op Metente klikken. Exporteer onbewerkte gegevens naar een spreadsheetsoftware om het fluorescentiesignaal op elk moment in getallen om te zetten door op Alles naar Excel te klikken | Exporteren.</li>
	<li>Bepaal de fluorescentiewaarde van de uitgangswaarde, gedefinieerd als F0, door het gemiddelde van F over de eerste 10 frames (d.w.z. voorafgaand aan de behandeling) in de geregistreerde gegevens te berekenen.</li>
	<li>Normaliseer de F-gegevens (door ΔF/F te berekenen) met behulp van de vergelijking ΔF/F = (F−F0)/F0, waarbij ΔF de tijdsafhankelijke verandering in fluorescentie is.</li>
	<li>Definieer voor Ca2+ golfsnelheidsgolfanalyse een significant signaalstijgingspunt boven de vooraf gestimuleerde waarden als een detectie van een Ca2+ toename van elke ROI (t1 en t2) met behulp van het criterium van een stijging tot 2× de standaardafwijking (2x SD) die wordt berekend op basis van de F0-gegevens met behulp van statistische software. 95% van de F0-gegevens valt binnen 2x SD ten opzichte van het gemiddelde, wat aangeeft dat een stijging van het signaal boven dit niveau bij toeval ≤5% is. Bereken het tijdsverschil van de Ca2+ toename tussen ROI1 en ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] en meet de afstand tussen ROI1 en ROI2, en bepaal vervolgens de snelheden van elke Ca2+ golf.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Systemische signalering is belangrijk voor planten om te reageren op gelokaliseerde externe omgevingsprikkels en vervolgens hun homeostase op een heel plantniveau te behouden. Hoewel ze niet zijn uitgerust met een geavanceerd zenuwstelsel zoals dieren, maken ze gebruik van snelle communicatie zowel binnen als tussen organen op basis van factoren zoals mobiele elektrische (en mogelijk hydraulische) signalen en voortplantingsgolven van ROS en Ca2+ 46,47....

Planten kunnen niet ontsnappen aan biotische spanningen, bijvoorbeeld insecten die zich ermee voeden, dus hebben ze geavanceerde stressdetectie- en signaaltransductiesystemen ontwikkeld om te detecteren en zichzelf vervolgens te beschermen tegen uitdagingen zoals herbivoren1. Bij een wond- of herbivore aanval initiëren planten snelle afweerreacties, waaronder accumulatie van het fytohormoon jasmonzuur (JA), niet alleen op de gewonde plaats, maar ook in onbeschadigde distale organen2. Deze JA activeert vervolgens beide afweerreacties in de direct beschadigde weefsels en induceert preventief afweer in de onbeschadigde delen van de plant. Bij Arabidopsiswerd de accumulatie van JA veroorzaakt door verwonding gedetecteerd in distale, intacte bladeren binnen slechts een paar minuten na schade elders in de plant, wat suggereert dat een snel en langeafstandssignaal wordt overgedragen van het gewonde blad3. Verschillende kandidaten, zoals Ca2+,reactieve zuurstofsoorten (ROS) en elektrische signalen, zijn voorgesteld om te dienen als deze langeafstandswondsignalen in planten4,5.
Ca2+ is een van de meest veelzijdige en alomtegenwoordige tweede boodschapperelementen in eukaryotische organismen. In planten veroorzaken het kauwen van rupsen en mechanische wond drastische verhogingen van de cytosolische Ca2+ concentratie ([Ca2+]cyt) zowel in het gewonde blad als in ongewikkelde verre bladeren6,7. Dit systemische Ca2+ signaal wordt ontvangen door intracellulaire Ca2+-sensing eiwitten, die leiden tot de activering van downstream verdedigingssignaleringsroutes, waaronder JA-biosynthese8,9. Ondanks talrijke dergelijke rapporten die het belang van Ca2+ signalen in de reacties op plantenwonden ondersteunen, is de informatie over de ruimtelijke en temporele kenmerken van Ca2+ signalen veroorzaakt door verwonding beperkt.
Real-time beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren is een krachtig instrument om de ruimtelijke en temporele dynamiek van Ca2+ signalen te monitoren en te kwantificeren. Tot op heden zijn versies van dergelijke sensoren ontwikkeld die de visualisatie van Ca2+ signalen op het niveau van een enkele cel, naar weefsels, organen en zelfs hele planten mogelijk maken10. De eerste genetisch gecodeerde biosensor voor Ca2+ gebruikt in planten was het bioluminescente eiwit aequorin afgeleid van de kwal Aequorea victoria11. Hoewel dit chemiluminescente eiwit is gebruikt om Ca2 + veranderingen te detecteren in reactie op verschillende spanningen in planten12,13,14,15,16,17,18, is het niet goed geschikt voor real-time beeldvorming vanwege het extreem lage luminescente signaal dat het produceert. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde Ca2+ indicatoren, zoals de Gele cameleons, zijn ook met succes gebruikt om de dynamiek van een reeks Ca2+ signaleringsgebeurtenissen in planten19,20,21,22,23,24te onderzoeken . Deze sensoren zijn compatibel met beeldvormingsbenaderingen en bestaan meestal uit het Ca2+ bindende eiwit calmodulin (CaM) en een CaM-bindend peptide (M13) uit een myosine lichtketenkinase, allemaal versmolten tussen twee fluorofooreiwitten, over het algemeen een Cyaan Fluorescerend Eiwit (CFP) en een Gele Fluorescerende Eiwit variant (YFP)10. Ca2+ binding aan CaM bevordert de interactie tussen CaM en M13, wat leidt tot een conformationele verandering van de sensor. Deze verandering bevordert de energieoverdracht tussen het GVB en het GVB, waardoor de fluorescentie-intensiteit van het GVB toeneemt en tegelijkertijd de fluorescentie-emissie van het GVB afneemt. Het monitoren van deze verschuiving van GVB naar YFP fluorescentie geeft dan een maat voor de toename van ca2+ niveau. Naast deze FRET-sensoren zijn single fluorescent protein (FP)-gebaseerde Ca2+ biosensoren, zoals GCaMP en R-GECO, ook compatibel met plant imaging benaderingen en worden ze veel gebruikt om [Ca2+]cytveranderingen te bestuderen vanwege hun hoge gevoeligheid en gebruiksgemak25,26,27,28,29,30. GCaMP's bevatten een enkele circulair gepermuteerde (cp) GFP, opnieuw gefuseerd met CaM en het M13-peptide. De Ca2+-afhankelijke interactie tussen CaM en M13 veroorzaakt een conformationele verandering in de sensor die een verschuiving in de protonatietoestand van de cpGFP bevordert, waardoor het fluorescerende signaal wordt verbeterd. Dus naarmate ca2+ niveaus stijgen, neemt het cpGFP-signaal toe.
Om de dynamiek van Ca2+ signalen te onderzoeken die worden gegenereerd als reactie op mechanische wond- of herbivore voeding, hebben we transgene Arabidopsis thaliana-planten gebruikt die een GCaMP-variant, GCaMP3 en een fluorescentiemicroscoop in het breed veld uitdrukken6. Deze aanpak is erin geslaagd om een snelle overdracht van een ca2+ signaal over lange afstand van de wondplaats op een blad naar de hele plant te visualiseren. Zo werd een toename van [Ca2+]cyt onmiddellijk gedetecteerd op de wondplaats, maar dit Ca2 + signaal werd vervolgens binnen een paar minuten na het verwonden doorgegeven aan de naburige bladeren door de vasculatuur. Bovendien ontdekten we dat de overdracht van dit snelle systemische wondsignaal wordt afgeschaft in Arabidopsis-planten met mutaties in twee glutamaatreceptorachtige genen, Glutamaatreceptor Zoals (GLR), GLR3.3 en GLR3.66. De GLR's lijken te functioneren als aminozuur gated Ca2+ kanalen die betrokken zijn bij diverse fysiologische processen, waaronder wondrespons3, pollenbuisgroei31, wortelontwikkeling32, koude respons33, en aangeboren immuniteit34. Ondanks deze goed begrepen, brede fysiologische functie van de GLR's, is informatie over hun functionele eigenschappen, zoals hun ligand specificiteit, ion selectiviteit en subcellulaire lokalisatie, beperkt35. Recente studies meldden echter dat GLR3.3 en GLR3.6 gelokaliseerd zijn in respectievelijk het floëem en xyleem. Planten-GLR's vertonen overeenkomsten met ionotrope glutamaatreceptoren (iGluRs)36 bij zoogdieren, die worden geactiveerd door aminozuren, zoals glutamaat, glycine en D-serine in het zenuwstelsel van zoogdieren37. We hebben inderdaad aangetoond dat de toepassing van 100 mM glutamaat, maar niet van andere aminozuren, op de wondplaats een snel Ca2+ signaal op lange afstand induceert in Arabidopsis, wat aangeeft dat extracellulair glutamaat waarschijnlijk fungeert als een wondsignaal in planten6. Deze reactie wordt afgeschaft in de glr3.3/glr3.6 mutant wat suggereert dat glutamaat kan werken via een of beide van deze receptor-achtige kanalen en inderdaad, AtGLR3.6 werd onlangs aangetoond te worden gated door deze niveaus van glutamaat38.
In planten is, naast zijn rol als structureel aminozuur, ook glutamaat voorgesteld als een belangrijke ontwikkelingsregulator39; de ruimtelijke en temporele dynamiek worden echter slecht begrepen. Net als voor Ca2+zijn er verschillende genetisch gecodeerde indicatoren voor glutamaat ontwikkeld om de dynamiek van dit aminozuur in levende cellen40,41te monitoren . iGluSnFR is een GFP-gebaseerde single-FP glutamaat biosensor bestaande uit cpGFP en een glutamaatbindend eiwit (GltI) uit Escherichia coli42,43. De conformationele verandering van iGluSnFR, die wordt veroorzaakt door glutamaatbinding aan GltI, resulteert in een verbeterde GFP-fluorescentie-emissie. Om te onderzoeken of extracellulair glutamaat fungeert als een signaalmolecuul in de reactie van plantenwonden, hebben we de iGluSnFR-sequentie verbonden met de basis chitinase signaalpeptide secretiesequentie (CHIB-iGluSnFR) om deze biosensor in de apoplastische ruimte te lokaliseren6. Deze aanpak maakte beeldvorming mogelijk van eventuele veranderingen in de apoplastische glutamaatconcentratie ([Glu]apo) met behulp van transgene Arabidopsis-planten die deze sensor uitdrukken. We ontdekten snelle toenames van het iGluSnFR-signaal op de wondplaats. Deze gegevens ondersteunen het idee dat glutamaat uit de beschadigde cellen / weefsels naar de apoplast lekt bij het verwonden en fungeert als een schadesignaal dat de GLR's activeert en leidt tot het ca2 + -signaal over lange afstand in planten6.
Hier beschrijven we een plantbrede real-time beeldvormingsmethode met behulp van genetisch gecodeerde biosensoren om de dynamiek van langeafstandssignalen ca2+ en extracellulair glutamaat te monitoren en te analyseren als reactie opwondvorming 6. De beschikbaarheid van breedveldfluorescentiemicroscopie en transgene planten die genetisch gecodeerde biosensoren uitdrukken, biedt een krachtige, maar gemakkelijk te implementeren aanpak om snel overgedragen langeafstandssignalen, zoals Ca2+ golven, te detecteren.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis die GCaMP3 tot expressie brengt</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis die CHIB-iGluSnFR tot expressie brengt</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamaat</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00501</td><td>Opgelost in een vloeibaar groeimedium [1/2x MS-zouten, 1% (w/v) sucrose, en 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 aangepast met 1N KOH].</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige en Skoog (MS) medium</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>samenstelling: 1x MS-zouten, 1% (w/v) sucrose, 0,01% (w/v) myo-inositol, 0,05% (w/v) MES en 0,5% (w/v) gellan gom; pH 5,7 aangepast met 1N KOH.</td></tr><tr><td>Nikon SMZ25 stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR analyse</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x objectieflens (P2-SHR PLAN APO)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS-camera (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Vierkante plastic petrischaal</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

wide-field, real-time beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij arabidopsis

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Planten reageren op mechanische spanningen zoals wond- en herbivoren door afweerreacties op te wekken, zowel in de beschadigde als in de distale onbeschadigde delen. Bij het verwonden van een blad treedt een toename van de cytosolische calciumionconcentratie (Ca2+ signaal) op de wondplaats op. Dit signaal wordt snel doorgegeven aan onbeschadigde bladeren, waar verdedigingsreacties worden geactiveerd. Ons recente onderzoek onthulde dat glutamaat dat uit de gewonde cellen van het blad lekt in de apoplast om hen heen dient als wondsignaal. Dit glutamaat activeert glutamaatreceptor-achtige Ca 2+ doorlaatbare kanalen, wat vervolgens leidt tot lange afstand Ca2+ signaal propagatie door de hele plant. De ruimtelijke en temporele kenmerken van deze gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd met real-time beeldvorming van levende planten die genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren uitdrukken. Hier introduceren we een plantbrede, real-time beeldvormingsmethode om de dynamiek van zowel de Ca2+ signalen als veranderingen in apoplastisch glutamaat die optreden als reactie op wondvorming te monitoren. Deze aanpak maakt gebruik van een breedveldfluorescentiemicroscoop en transgene Arabidopsis-planten die op groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde Ca2+ en glutamaatbiosensoren uitdrukken. Daarnaast presenteren we methodologie om gemakkelijk wondgeïnduceerde, glutamaat-geactiveerde snelle en lange afstand Ca2 + signaalvoortplanting uit te lokken. Dit protocol kan ook worden toegepast op studies over andere plantenspanningen om te helpen onderzoeken hoe systemische signalering van planten betrokken kan zijn bij hun signalerings- en responsnetwerken.

Signaalvoortplanting van [Ca2+]cyt en [Glu]apo als reactie op verwondingen wordt weergegeven in figuur 3, figuur 4, film S1en film S2. Het snijden van de bladsteel van blad 1 in planten die GCaMP3 uitdrukken (bij 0 s) leidde tot een significante toename van [Ca2+]cyt die lokaal snel werd geïnduceerd door de vasculatuur (bij 40 s) (<strong cla...

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Dit protocol maakt plantbrede real-time beeldvorming van de activiteit van het plant systemische signaleringssysteem mogelijk door de dynamiek van het calcium- en apoplastische glutamaat te monitoren als reactie op verwondingen. Deze plantbrede real-time beeldvormingsmethode biedt een robuust hulpmiddel om de dynamiek van de snelle en langeafstandssignalen in planten te begrijpen, waarbij een hoge ruimtelijke tijdresolutie en gebruiksgemak worden gecombineerd. Dit protocol biedt het potentieel om een nieuw inzicht te geven in de ruimtelijke en temporele kenmerken van het systeem calciumsignalering in zowel biotische als abiotische stressreacties bij andere plantensoorten.Takuya Uemura, een postdoctoraal fellow van mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Begin met het inschakelen van de gemotoriseerde fluorescerende stereomicroscoop, uitgerust met een 1X objectieve lens en een sCMOS-camera. Configureer de apparaatinstellingen om te bestralen met excitatielicht gecentreerd op 470 nanometer, geselecteerd met behulp van een filter dat licht uitzendt tussen 450 en 490 nanometer.Verkrijg emissielicht met behulp van een filter dat tussen de 510 en 560 nanometer uitzendt. Verwijder het deksel van de schaal met de plant en plaats deze onder de objectieve lens. Controleer het fluorescerende signaal van de installatie.Wacht dan ongeveer 30 minuten in het donker tot de planten zijn aangepast aan de nieuwe omgevingsomstandigheden. Pas de focus en vergroting aan om de hele plant in het gezichtsveld te zien. Stel vervolgens de acquisitieparameters in om de fluorescerende signalen te detecteren met behulp van de beeldvormingssoftware voor microscopen.Stel de opnametijd in op 11 minuten. Beeld gedurende vijf minuten voorafgaand aan het starten van het experiment om de plant te laten wennen aan de blauwlichtbestraling van de microscoop en begin vervolgens met opnemen. Om de gemiddelde basislijn fluorescentie te bepalen, registreert u ten minste 10 frames voordat u verwondt of glutamaat aanbrengt.Voor real-time beeldvorming van wond geïnduceerde cytosolische calciumion en apoplastische glutamaat concentratie veranderingen, snijd de bladsteel of het middelste gebied van blad L1 met een schaar. Voor real-time beeldvorming van glutamaat geactiveerd cytosolic calcium veranderingen, snijd ongeveer een millimeter van de punt van blad L1 over de hoofdader met een schaar. Breng na ten minste 20 minuten 10 microliter van 100 millimolar glutamaat aan op het snijoppervlak van het blad.Definieer voor fluorescentie-intensiteitsanalyse in de loop van de tijd een interessegebied op de plaats waar fluorescentie-intensiteit moet worden geanalyseerd. Definieer twee ROIs voor de snelheidsberekening van de calciumgolf. Klik in de beeldvormingssoftware op tijdmeting, definiëren en cirkelen.Meet de afstand tussen de twee regio's door te klikken op annotaties en meting, lengte en eenvoudige lijn. Meet de ruwe florescentiewaarden in elke ROI in de loop van de tijd door op meten te klikken en exporteer vervolgens de onbewerkte gegevens naar spreadsheetsoftware om het fluorescerende signaal op elk tijdstip in getallen om te zetten. Bepaal de fluorescentiewaarde van de basislijn, die wordt vergoddelijkt als F nul, door de gemiddelde F over de eerste 10 frames in de opgenomen gegevens te berekenen en vervolgens de F-gegevens te normaliseren zoals beschreven in het teksthandschrift.Definieer voor calciumsnelheidsgolfanalyse een significant signaalstijgingspunt boven de vooraf gestimuleerde waarden als een detectie van een calciumverhoging in elke ROI. Bereken het tijdsverschil in de calciumtoename tussen de twee ROI's en de afstand daartussen om de snelheden van een calciumgolf te bepalen. De voortplanting van een wondgeriggereerde verandering in de concentraties van het cytosolische calciumion en apoplastisch glutamaat wordt hier getoond.Het snijden van de bladsteel van een blad in planten die GCaMP-3 uitdrukken, leidde tot een aanzienlijke toename van calcium. Het werd lokaal geïnduceerd en vervolgens verspreid over de vasculatuur. Het signaal werd snel doorgegeven aan naburige bladeren binnen een paar minuten.Bij het snijden van een blad en planten die basis chitinase uitdrukken, lijm ik lijm sniffer, werd een snelle apoplastische glutamaat toename waargenomen rond het snijgebied. Binnen een paar minuten verspreidde het signaal zich ook door de vasculatuur. Voor real-time beeldvorming van calciumsignaalvoortplanting die door de toepassing van glutamaat wordt veroorzaakt, werd de rand van een blad in installaties die CCaMP-3 uitdrukken gesneden.Dit veroorzaakte een lokale cytosolische calciumionenconcentratiestijging, maar het signaal verdween binnen een paar minuten. Na ongeveer 10 minuten werd glutamaat op het snijoppervlak aangebracht, waardoor de concentratie cytosolisch calcium snel lokaal steeg en dit signaal vervolgens werd doorgegeven aan distale bladeren. Om de veranderingen in een vaste calciumconcentratie te meten die werden veroorzaakt door wond in het systemische blad, werd de tijdsverandering van de GCaMP-3-signaalintensiteit gemeten in twee interessegebieden.Apoplastische glutamaatconcentratieveranderingen als reactie op mechanische schade werden ook gemeten. De glutamaatsignatuur vertoonde een enkele piek op ongeveer 100 seconden na het verwonden. Dit experiment moet worden uitgevoerd onder temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde omstandigheden, omdat deze worden verhoogd door veranderingen in deze omgevingsomstandigheden.Dit protocol biedt een potentieel om inzicht te geven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan langeafstandssignalering door mutanten te gebruiken die de defecte en putatieve elementen van het labsignaleringssysteem.

wide-field-real-time-imaging-local-systemic-wound-signals

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven het gebruik van perfluorodecalin als een infiltratieve montage medium. Dit is een eenvoudige methode voor het verbeteren van de diepte van beeldvorming...

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor snelle verzameling afbeeldingen van Arabidopsis zaailingen reageren op een stimulus zwaartekracht met behulp van commercieel verkrijgbare flatbed scanners. De methode maakt het mogelijk voor goedkope, high-volume vastleggen van beelden met hoge resolutie vatbaar voor downstream analyse algoritmen.

Met behulp van flatbed scanners om High-resolution-Time vervallen Beelden van de Arabidopsis wortel gravitropic Response Collect

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het analyseren van calcium signalen in planten die zijn gegenereerd door het voeren van hemipteran insecten, zoals bladluizen. Arabidopsis thaliana getransformeerd met de GFP calcium biosensor GCaMP3 toestaan voor de real-time in vivo imaging van calcium dynamiek met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Real-time In Vivo opname van Arabidopsis Calcium signalen tijdens insecten voeden met behulp van een fluorescerende Biosensor

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Leer real-time beeldvorming van calcium- en glutamaatsignalen bij Arabidopsis thaliana om systemische wondreacties in planten te bestuderen. Deze methode onthult snelle signaalpropagatie door het vaatstelsel.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Meer video's verkennen