Accumulatie en distributie van fluorescerende microplastics in de vroege levensfasen van zebravissen
4 juli 2021
Zebravisembryo's/larven ontwikkelen zich extern en zijn optisch transparant. De bioaccumulatie van microplastics in vissen in vroege levensfasen wordt gemakkelijk beoordeeld met fluorescerend gelabelde microbeads.
Accumulatie en distributie van fluorescerende microplastics in de vroege levensfasen van zebravissen. Introductie. De bioaccumulatie van microplastics speelt een belangrijke rol in hun toxische effecten. Als deeltjes verschillen hun bioaccumulaties echter van veel andere verontreinigende stoffen.
Hier beschreven is een haalbare methode om de accumulatie en distributie van microplastics in zebravisembryo's of larven visueel te bepalen met behulp van fluorescerende microplastics. De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale gids Laboratoriumdierrichtlijn voor ethische toetsing van dierenwelzijn. Eén, embryoverzameling.
Volwassen zebravissen zijn afkomstig van het China Zebrafish Resource Center. Vissen worden onderhouden in glazen tanks van 20 liter met recirculerend houtskoolgefilterd leidingwatersysteem bij een constante temperatuur, namelijk 28 Graden Celsius, op een fotoperiode van 14 en 10 uur, licht: donker. Vissen worden tweemaal daags gevoerd met Artemia nauplii.
Het wordt aanbevolen dat het voedsel maximaal 3% visgewicht per dag krijgt en elke keer binnen vijf minuten moet worden gegeten. Goed ontwikkelde volwassen zebravissen worden de avond voor het fokken in de paaitank overgebracht met een verhouding van één mannetje tot twee vrouwtjes. De volgende ochtend beginnen de vissen te spawnen na het begin van de lichtcyclus.
Eieren worden verzameld met behulp van een Pasteur pipet, meerdere keren gespoeld met de oplossing van 10% Hank en vervolgens gecontroleerd op bevruchting met behulp van een microscoop. Bevruchte eieren ondergaan de decolletéperiode na ongeveer twee uur na de bevruchting en kunnen duidelijk worden geïdentificeerd. De bevruchte embryo's worden geïncubeerd in een bekerglas van 500 milliliter met 200 milliliter 10%Hank's oplossing met 1% methyleenblauw voor desinfectie bij 28 Graden Celsius.
De laadsnelheid bedraagt niet meer dan één embryo in elke oplossing van 2 milliliter. Twee, bereiding van microplastic suspensuspensingen. De stamoplossing van groene fluorescerend gelabelde polystyreenparels met een nominale diameter van 500 nanometer wordt gedurende 10 minuten gesoniceerd.
Verdun de voorraadoplossing met de oplossing van 10% Hank om de gewenste belichtingsoplossingen te produceren, namelijk 0,1, 1 en 10 milligram per liter. De belichtingsoplossingen van microplastics worden altijd vers bereid voor blootstelling. Drie, microplastic blootstelling.
Zes nieuw bevruchte embryo's worden willekeurig geselecteerd en vervolgens overgebracht naar elke put van zes putplaten met vijf milliliter microplastic-oplossingen met verschillende concentraties. De controlegroepen met de oplossing van 10% Hank zijn inbegrepen. Drievoudsputten, met in totaal 18 embryo's, worden voor elke behandeling gebruikt.
De embryo's worden geïncubeerd onder dezelfde licht-donker cyclus en temperatuur als volwassenen, en worden elke 12 uur waargenomen. De doden worden onmiddellijk verwijderd. De microplastic oplossingen worden elke 24 uur voor 90% vernieuwd.
Tijdens de blootstellingsperiode worden de vissen niet gevoerd. Over het algemeen begint het uitkomen van embryo's na 48 uur na de bevruchting en voltooit het ongeveer 72 uur na de bevruchting. Vier, beoordeling van de verdeling van microplastics.
Op 24-48-72-96-en 120-uur na de bevruchting worden de embryo's en larven, één van elk van de drie replica's, willekeurig geselecteerd en gespoeld met de oplossing van 10%Hank. De embryo's en larven worden gerangschikt en voorbereid voor observatie. Vooraf worden de larven overgebracht in een petrischaal en blootgesteld aan 0,016% tricaine voor anesthesie.
De vissen worden waargenomen met fluorescentiemicroscoop en afgebeeld met beeldvormingssoftware. De fluorescentie-intensiteit bij vissen wordt verder gekwantificeerd met ImageJ NIH. Representatieve resultaten.
In de resultaten is te zien dat microplastics op een concentratieafhankelijke manier kunnen bioaccumuleren in zebravisembryo's en larven. Vóór het uitkomen wordt sterke fluorescentie gevonden rond het embryonale koraal; terwijl bij zebravislarven de dooierzak, het pericard en het maagdarmkanaal de belangrijkste geaccumuleerde locaties van microplastics zijn. discussie. Dit resultaat zal ons begrip over de toxiciteit van microplastics voor vissen bevorderen, en de hier beschreven methode kan mogelijk worden gealdaliseerd om de accumulatie en distributie van andere soorten fluorescerende materialen in de vroege levensfasen van zebravissen te bepalen.
Aangezien het chorion zal fungeren als een effectieve barrière tegen de deeltjes met grote afmetingen, kan het dechorionatieproces vóór blootstelling nodig zijn. Het embryo met koraal intact wordt echter meer aanbevolen om de ecotoxiciteit van verontreinigende stoffen te beoordelen bij het overwegen van de blootstellingstoestand in de echte wereld. Het gedrag van microplastics in de oplossing is ook van cruciaal belang voor de biologische beschikbaarheid.
De fysisch-chemische kenmerken van microplastics moeten gedurende de blootstellingsduur worden gevolgd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van de accumulatie en distributie van fluorescerende microplastics in zebravisembryo's en -larven. Door zebravis in vroege ontwikkelingsstadia bloot te stellen aan variërende concentraties van 500 nm fluorescerende polystyreenbeads, kwantificeert de studie visueel de opname en lokalisatie van microplastics, wat inzicht geeft in hun bioaccumulatiepatronen en potentiële toxicologische effecten op aquatische organismen.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Milieutoxicologie
- Aquatische biologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Microplastics zijn opkomende milieuvervuilers die op grote schaal worden aangetroffen in aquatische omgevingen.
- Bioaccumulatie van microplastics is cruciaal voor hun toxische effecten, maar verschilt van die van opgeloste vervuilers.
- Zebravissenembryo's en -larven dienen als gevestigde modellen voor het bestuderen van de opname en toxiciteit van vervuilers.
- Het visualiseren van de distributie van microplastics helpt bij het verduidelijken van hun internalisatie en potentiële biologische effecten.
Doel van de studie
- Om een visuele en kwantitatieve methode vast te stellen voor het bepalen van de accumulatie van microplastics in zebravisembryo's en -larven.
- Om de belangrijkste locaties van microplasticaccumulatie tijdens verschillende ontwikkelingsstadia te identificeren.
- Om concentratieafhankelijke bioaccumulatiepatronen van microplastics te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Verzameling en bevruchting van zebravisembryo's onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden.
- Bereiding van suspensies van groen fluorescent polystyreen microplastics (0,1, 1 en 10 mg/L; 500 nm diameter).
- Blootstelling van embryo's/larven aan microplastics in multiwellplaten gedurende maximaal 120 uur, met regelmatige vernieuwing van de oplossing en monitoring.
- Fluorescentiemicroscopie en imagingsoftware (ImageJ) om de distributie van microplastics in embryo's en larven op meerdere tijdstippen te visualiseren en te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Microplastics bioaccumuleren in zebravisembryo's en -larven op een concentratieafhankelijke manier.
- Vóór het uitkomen is een sterke fluorescentie waarneembaar rondom het embryonale chorion, wat wijst op de accumulatie van microplastics.
- In uitgekomen larven accumuleren microplastics hoofdzakelijk in de dooierzak, het pericardium en het maag-darmkanaal.
- De methode maakt een duidelijke visualisatie en kwantificering van de opname en lokalisatie van microplastics mogelijk.
Conclusies
- Het beschreven protocol biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van de accumulatie van microplastics tijdens de vroege ontwikkeling van zebravis.
- De bevindingen verbeteren het begrip van de biobeschikbaarheid en toxiciteit van microplastics in aquatische organismen.
- De methode kan worden aangepast voor andere fluorescerende partikelmaterialen en ondersteunt ecotoxicologische beoordelingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve visualisatie van microplastic-accumulatie in zebravissenembryo's en -larven maakt een toxicologische beoordeling in een vroeg stadium mogelijk van particuliere milieuverontreinigingen. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in aquatische toxiciteitsmodellen en informeert risicobeoordelingsstrategieën voor milieu- en farmaceutische R&D-portfolio's. De reproduceerbaarheid en kwantitatieve resultaten van de methode vergemakkelijken vergelijkingen tussen studies en translationele continuïteit in milieu-toxicologische pijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de opname en distributie van particuliere toxische stoffen in een gewervde modelorganismen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door internalisatiepaden van microplastics te verduidelijken.
- Levert kwantitatieve gegevens voor voorspellende betrouwbaarheid bij de identificatie van milieugevaren.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een gevalideerde, reproduceerbare assay vast voor het visualiseren en kwantificeren van microplastic-accumulatie.
- Faciliteert de standaardisatie van blootstellingscondities en imaging-protocollen voor downstream workflows.
- Genereert kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen die geschikt zijn voor comparatieve screening van particulaire toxicanten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante aquatische modellen voor milieurisicobeoordeling.
- Maakt continuïteit mogelijk van opnamestudies in de ontdekkingsfase tot preklinische toxicologische evaluaties.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van milieu- en farmaceutische portfolio's.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode wordt geïntegreerd in de vroege ontdekkings- en screeningsfasen van pijplijnen voor milieutoxicologie en farmaceutische veiligheid, waarbij kwantitatieve gegevens over de opname en distributie van particulaire contaminanten worden geleverd.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen over bioaccumulatie en distributie van microplastics in embryonen van vertebraten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentiemetingen voor de standaardisatie van assays.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van accumulatie over verschillende concentraties en ontwikkelingsstadia mogelijk.
- Translational Research: Slaat een brug van in vitro blootstelling naar in vivo toxicologische relevantie in aquatische modellen.
- Enterprise Reuse: Biedt een platform dat aanpasbaar is voor andere fluorescerende partikelmaterialen voor bredere toxicologische toepassingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de opname van toxische stoffen en mechanistische risicoreductie.
- Operationele waarde: Standaardiseert blootstellings- en beeldvormingsprotocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen voor milieugerelateerd en farmaceutisch risicomanagement.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van milieu- en veiligheidsstudies mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de husbanderie van zebravis en fluorescentiemicroscopie.
- Toegang tot beeldvormingsinfrastructuur en software voor kwantitatieve analyse (bijv. ImageJ) is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van belichtings- en beeldvormingsprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan verschillende particulaire materialen met passende fluorescente markering.
- Fysisch-chemische tracking van microplastics is noodzakelijk om de biobeschikbaarheid tijdens de blootstelling te waarborgen.
