Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

Dit protocol is belangrijk, omdat het een methode biedt om vier cellulaire compartimenten van elkaar te scheiden, het cytoplasma, de kern, de mitochondriën en het membraan. Niet alleen dat, maar het is een schaalbare, reproduceerbare procedure met betrouwbare resultaten. Het grote voordeel van deze techniek is de scheiding van vier cellulaire compartimenten met minimaal gebruik van detergentia, wat een veel reproduceerbaarder, betrouwbaarder fractioneringsproces mogelijk maakt.

Voor cytosolische eiwitisolatie kweekt u U937-cellen in RPMI 1640 met 10% foetaal runderserum bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot een eindtotaal van zes bij 10 tot de achtste cellen. Centrifugeer de cultuur en resuspenseer de celpellet in PBS op kamertemperatuur tot een eindconcentratie van vier bij 10 tot de zesde cellen per milliliter, waarbij zachtjes wordt gepipetteerd om klonten op te breken. Resuspensie na een tweede centrifugatie de pellet in ijskoude lysisbuffer A in een eindconcentratie van twee bij 10 tot de zevende cellen per milliliter.

Voeg 7,5 milliliter cellen toe aan een conische buis op ijs voor downstream nucleaire eiwitextractie en pelleteer de resterende cellen door centrifugatie. Resuspendeer de pellet in cytoplasmatische isolatiebuffer in een eindconcentratie van twee bij 10 tot de zevende cellen per milliliter, pipetteer voorzichtig om klonten op te breken, voordat de cellen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius worden geïncubeerd met einde over eindrotatie. Aan het einde van de incubatie centrifugeert u de celsuspensie en brengt u het supernatant over naar een schone centrifugebuis.

Centrifugeer het supernatant om het cellulaire puin te bezinken. Breng na centrifugatie het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis en herhaal de centrifugatiesequentie totdat er geen pellet kan worden waargenomen. Wanneer het monster vrij is van puin, bewaart u het cytosolische fractie-bevattende supernatant gedurende maximaal één maand bij vier graden Celsius.

Resuspenseer vervolgens de opgeslagen celpellet in lysisbuffer A tot een eindconcentratie van vier bij 10 tot de zesde cellen per milliliter. Voor celhomogenisatie, centrifugeer de celsuspensie en gooi het supernatant weg om overtollige digitonine en systolische verontreinigingen te verwijderen. Resuspensie de pellet in ijskoude celhomogenisatiebuffer in een eindconcentratie van vier bij 10 tot de zesde cellen per milliliter gedurende een incubatie van 30 minuten op ijs.

Ondertussen, voor op kralen gebaseerde mechanische lysis, voeg 30 gram voorgewassen roestvrijstalen 3,2 millimeter kralen toe aan 15 milliliter lysisbuffer B in een 50 milliliter omzoomde buis op ijs om te koelen. Vervang aan het einde van de incubatie de buffer in de omzoomde buis door celsuspensie en meng de cellen gedurende vijf minuten op snelheid acht. Breng na lysis het homogenaat over in een schone buis.

Centrifugeer het homogenaat en breng het supernatant over in een nieuwe buis. Om eventueel achtergebleven vuil uit het monster te verwijderen, moet u het homogenaat driemaal centrifugeren zoals aangegeven, waarbij het supernatant na elke centrifugatie in een nieuwe buis wordt overgebracht. Na de laatste centrifugatie, om de ruwe mitochondriale fractie te isoleren, brengt u het supernatant over naar een nieuwe buis voor centrifugatie.

Breng na centrifugatie het supernatant over naar een nieuwe buis en plaats de ruwe mitochondriale fractie-bevattende pellet op ijs. Om de membraanfractie te isoleren, centrifugeert u het verzamelde supernatant en plaatst u na het weggooien van het supernatant de ruwe membraanfractie-bevattende pellet op ijs. Voor isopycische dichtheid gradiënt zuivering, resuspensie de ruwe mitochondriale en membraanfractie pellets in 200 microliter lysis buffer B, en 1,8 milliliter van iodixanol.

Om een discontinue iodixanolgradiënt voor elk monster te maken, voegt u eerst een milliliter van 15% iodixanol toe aan de onderkant van een acht milliliter open, dunwandige ultracentrifugebuis per monster. Leg vervolgens achtereenvolgens één milliliter 20%iodixanol, één milliliter 25%iodixanol, één milliliter 30%iodixanol en één milliliter 35%iodixanol onder de 15%iodixanollaag in elke buis. Voeg twee milliliter van de ruwe mitochondriale pelletsuspensie toe onder de onderste laag van één gradiënt en twee milliliter van de ruwe membraankorrelsuspensie onder de onderste laag van de tweede gradiënt.

Leg voorzichtig een milliliter van 10% jodidinenol op de bovenkant van elke gradiënt en balanceer de buizen binnen 10 microgram van elkaar door de toevoeging van 10% jodidinenol indien nodig voordat de mitochondriale en membraanfracties worden gezuiverd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Gebruik aan het einde van de scheiding een naald om de zijkant van de dunwandige buizen te doorboren om de zichtbare banden van elk monster te verzamelen. Voor nucleaire eiwitisolatie centrifugeer je de 7,5 milliliter aliquot cellen gesuspendeerd in lysisbuffer A en resuspensieer je de pellet in 800 microliter ijskoude celoplosbaarheidsbuffer met pipetteren en vortexen.

Incubeer de suspensie op ijs gedurende 30 minuten om het plasma en de organelmembranen te verstoren, terwijl de nucleaire eiwitten worden beschermd. Aan het einde van de incubatie centrifugeert u de celsuspensie en resuspendeert u de pellet door voorzichtig te pipetteren in 800 microliter ijskoude nucleaire lysisbuffer aangevuld met één eenheid benzonase per microliter. Incubeer het mengsel op een uiteinde over de eindrotator bij vier graden Celsius om het kernmembraan te verstoren.

Soniceer het mengsel na 30 minuten drie keer gedurende vijf seconden met 20% vermogen met een pauze van vijf seconden tussen de pulsen om de nucleïnezuren te scheren. Na de laatste ultrasoonapparaat, centrifugeer het homogenaat en verzamel het supernatant als de nucleaire fractie zonder de pellet te verstoren. Western blot van elk van de fracties na dichtheidsgradiëntzuivering toont lokalisatie van de mitochondriale fractie naar de 25 en 30% iodixanollagen en lokalisatie van de membraanfractie naar de 10 en 15% jodidinezuurlagen.

Westerse bloedanalyse bevestigt ook dat elk geïsoleerd monster zuiver is en vrij van besmetting door eiwitten uit andere delen van de cel. Bovendien bevestigt densitometrische analyse van de bandintensiteit van elk monster de reproduceerbaarheid en statistische significantie van de gegevens. Onjuiste uitvoering van de fractionering kan leiden tot kruisbesmetting van de cellulaire componenten.

Een hoge concentratie Histon H3 in de cytosolische fractie kan bijvoorbeeld te wijten zijn aan onjuiste klaring van de cytosolische fractie. Falen tijdens de isolycische dichtheidszuivering kan leiden tot verontreiniging van de membraanfractie. Het kan nuttig zijn om vóór de westerse bloedanalyse een eiwitkwantificeringstest uit te voeren om te bevestigen dat de fracties inderdaad eiwit bevatten om gelbelasting op basis van de eiwithoeveelheid mogelijk te maken en om te bevestigen dat de procedure correct is uitgevoerd.

Het is van cruciaal belang dat de cytoplasmatische fractie geen pellet bevat. Western blots of ELISA's kunnen na deze procedure worden uitgevoerd om u in staat te stellen de subcellulaire locatie van verschillende eiwitten onder bepaalde omstandigheden te analyseren. Deze techniek stelde ons in staat om de handel in verschillende celdoodfactoren onder omstandigheden van hyperglycemie te analyseren.

En dus hielp dit voor ons om licht te werpen op het mechanisme van de hyperglycemische verschuiving van apoptose naar necrose.