Whole-Mount kleuring, visualisatie en analyse van fungiforme, circumvallaat en gehemelte smaakpapillen
11 februari 2021
Dit artikel beschrijft methoden voor weefselvoorbereiding, kleuring en analyse van hele fungiforme, circumvallaat- en gehemelte-smaakpapillen die consequent hele en intacte smaakpapillen opleveren (inclusief de zenuwvezels die ze innerveren) en de relaties tussen structuren in smaakpapillen en de omliggende papilla onderhouden.
Deze hele ontlekings- en analyseworkflow biedt een nieuwe benadering om de volledige morfologie van individuele smaakzenuwprieels, transducerende celtypenummers en de fysieke relaties tussen cellen te analyseren. Het verzamelen van het volledige linguale epitheel stelt ons in staat om het absolute aantal cellen en het volume van innervatie in de hele smaakpapillen te meten. Deze benadering is nauwkeuriger dan schattingen van de celstructuur op basis van bemonstering uit secties, wat de technische variabiliteit vermindert.
Dit is ook de eerste methode die gedetailleerde analyse biedt van de smaakpapillencellen in relatie tot hun innervatie. Deze methode kan het onderzoek naar de mogelijke circuits in de smaakpapillen verbeteren, evenals ziekteprocessen en chemotherapieën die de normale smaakfunctie verstoren. In de meeste van deze gevallen is het onduidelijk welke structuur of relatie is verstoord, dus als al die factoren intact blijven, kunnen alle analyses binnen één preparaat worden uitgevoerd.
De meest voorkomende fout is proberen te voorkomen dat het epitheel wordt beschadigd door niet dicht genoeg bij de onderkant van het epitheel te ontleden. Het is noodzakelijk om zoveel mogelijk onderliggend weefsel te verwijderen voordat u het weefsel in de weefselvorm bevriest. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het epitheel plat in de bodem van de weefselvorm ligt.
Begin met het ontdooien en spoelen van de tong in 0,1 molaire fosfaatbuffer. Plaats vervolgens 1/2 van de voorste tong met daarin de fungiforme papillen op een glazen dia onder een ontleedmicroscoop. Gebruik een stompe tang en dissectieschaar om de spier te verwijderen en het weefsel open te houden terwijl het linguale epitheel gebogen is, waardoor een vlakke oriëntatie van weefsel wordt gegarandeerd door de messen van de grove dissectieschaar parallel aan het epitheel te houden.
Gooi het ventrale niet-verhoornde epitheel van de tong weg omdat het geen smaakpapillen bevat. Gebruik vervolgens een fijne dissectieschaar voor een nauwere dissectie aan de onderkant van het verhoornde epitheel. Gebruik een stompe tang om een stuk epitheel in een weefselvorm te leggen en ervoor te zorgen dat het plat ligt.
Voeg vervolgens een druppel optimale snijtemperatuurverbinding, of OCT, toe aan het weefsel. Plaats de weefselvorm op een eerder afgekoelde metalen basis onder de ontleedkijker en blijf vervolgens lichtjes met de tang op het weefsel tikken totdat de OCT is bevroren, zodat het weefsel zo plat mogelijk bevriest. Zodra de OCT is bevroren, voeg je snel extra OCT toe en plaats je de vorm in een bekerglas van gekoeld 2-methylbutaan tot het bevroren is.
Monteer de OCT-mal op de cryostaat en snijd deze in secties van 20 micron. Verzamel elke sectie en bekijk het onder de lichtmicroscoop om de nabijheid van de basis van het epitheel te beoordelen. Nadat het weefsel van de onderkant van het epitheel is geschoren, ontdooit u het epitheel en spoelt u het tweemaal in 0,1 kies PB op een shaker.
Snijd het harde gehemelte vooraan naar de kruising van het zachte en harde gehemelte, scheid vervolgens het zachte gehemelte van het onderliggende weefsel, zorg ervoor dat eventuele resterende botfragmenten worden weggesneden en verwijder extra spier- en bindweefsel. Houd het gehemelte vast met een stompe tang en verwijder de resterende klieren en verlies bindweefsel door ze voorzichtig te schrapen met een scheermesje. Hele smaakpapillen en alle smaakpapillen innervatie in Phox2b-Cre TdTomato muizen werden gelabeld door het linguale epitheel te kleuren met antilichamen voor DsRed en keratine acht.
Het volume van de smaakpapillen werd gemeten en toonde geen correlaties tussen smaakpapillenvolumes en innervatievolumes in de fungiforme of de circumvallaatmeetgebieden. De toediening van een lage dosis tamoxifen bij TrkB CreER TdTomato-muizen veroorzaakt genrecombinatie en de etikettering van een klein aantal neuronen. Een hele smaakpapillen gekleurd met smaaktransducerende celmarkers koolzuuranhydrase vier en fosfolipase C bèta twee wordt hier getoond.
Deze smaakpapillen hebben twee gelabelde terminale prieeltjes, die worden getoond met de smaakpapillen verwijderd na het reconstrueren van de vezels. Met behulp van op celpixels gebaseerde beeldvormingssoftware om de dichtstbijzijnde nabijheid tussen zenuwvezels en smaaktransducerende cellen te bepalen, bleek dat van de 19 smaaktransducerende cellen het blauwe terminale prieel zich binnen 200 nanometer van de lichtblauwe koolzuuranhydrase vier plus cel bevond. Het terminale prieel geassocieerd met de groene tracering wordt weergegeven in magenta en bevindt zich binnen 200 nanometer van zowel de licht- als donkerblauwe koolzuuranhydrase vier plus cellen.
Whole-mount keratine acht en 5-ethynyl-2'deoxyuridine of EdU kleuring van fungiform smaakpapillen onthulde dat EdU-gelabelde cellen zowel binnen als buiten de smaakpapillen aanwezig waren. De magenta en paarse kernen worden waargenomen buiten de keratine acht plus rand van de smaakpapillen. De gele, groenblauwe en blauwe cellen zaten in de smaakpapillen.
Bij het proberen van dit protocol zijn de weefseldissectie en bevriezingsstappen cruciaal. Deze weefseldissectiemethoden kunnen worden gevolgd door kleuring voor een verscheidenheid aan cellen en structuren om de relaties zowel binnen de smaakpapillen als buiten de smaakpapillen, maar binnen de papilla te analyseren. Dit is de eerste analyse van hele smaakprieeltjes in de smaakpapillen, evenals hun relaties met smaaktransducerende cellen.
Het bewaren en kleuren van verschillende van deze elementen in één preparaat vergroot zowel de analysemogelijkheden als verfijnt de metingen die mogelijk zijn.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel introduceert een nieuwe methode voor de whole-mount dissectie en analyse van smaakpapillen, specifiek fungiforme, circumvallate en palatinale smaakpapillen, waarbij hun structuren en innervaties behouden blijven. De techniek maakt nauwkeurige metingen van celgetallen en innervatievolumes mogelijk, wat ons begrip van de schakelingen van smaakpapillen en de effecten van ziekten op de smaakfunctie vergroot.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Systeembiologie
Achtergrond
- Analyse van volledige smaakknopjes biedt inzicht in hun morfologie en functionele schakelingen.
- Bestaande methodologieën lijden vaak aan een hoge variabiliteit als gevolg van bemonstering.
- Het begrijpen van de smaakfunctie is cruciaal in onderzoek naar smaakstoornissen.
- Deze studie beoogt de volledige structuur van smaakknopjes te definiëren in relatie tot hun innervatie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor de dissectie en analyse van intacte smaakknoppen.
- Het onderzoeken van de relaties tussen smaakknopcellen en de zenuwvezels die deze innerveren.
- Het belichten van de implicaties van dit onderzoek voor het begrip van de schakelingen die betrokken zijn bij de smaaksensatie.
Gebruikte methoden
- Deze studie maakt gebruik van een whole-mount dissectietechniek voor smaakpapillen van de tong.
- Het biologische model omvat smaakpapillen van Phox2b-Cre TdTomato- en TrkB CreER TdTomato-muizen.
- In deze studie zijn geen multiomics-workflows gebruikt.
- Kritieke stappen omvatten zorgvuldige dissectie en correct invriezen van het weefsel.
- De monsters werden vervolgens geanalyseerd met kleuringstechnieken om verschillende celtypen te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- De techniek heeft smaakpapillen succesvol intact bewaard en gekleurd, waardoor hun cellulaire architectuur zichtbaar werd.
- Metingen toonden geen correlaties aan tussen de volumes van de smaakpapillen en de volumes van de innervatie.
- Cel-pixelgebaseerde beeldvorming demonstreerde de nabijheid tussen zenuwvezels en smaaktransducerende cellen.
- EdU-labeling wees op celproliferatie binnen en buiten de begrenzing van de smaakpapil.
Conclusies
- De studie presenteert een innovatief protocol voor het analyseren van smaakpapillen dat kan helpen bij toekomstig onderzoek.
- Hoewel multi-omics-analyse niet was opgenomen, verbeteren de bevindingen ons begrip van de functie van smaakpapillen.
- Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek van cellulaire relaties mogelijk, wat waardevol is voor het onderzoeken van smaakstoornissen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Whole-mount analyse van smaakpapillen maakt een nauwkeurige kwantificering van cellulaire en innervatieparameters mogelijk, waardoor de technische variabiliteit die inherent is aan coupes-gebaseerde benaderingen wordt verminderd. Deze methode ondersteunt mechanistische risicoreductie in de neurowetenschappen en sensorische biologie door de ruimtelijke relaties tussen transducerende cellen en zenuwvezels te behouden. Het biedt een reproduceerbaar platform voor het evalueren van de chemosensorische functie in ziektemodellen en studies naar therapeutische interventies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om smaaktransductiepaden te onderzoeken via absolute celtelling en ruimtelijke mapping van zenuwuiteinden.
- Operationele waarde: Vermindert bias en variabiliteit door de intacte architectuur van de smaakknop te behouden voor reproduceerbare analyse.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door moleculaire markers in situ te koppelen aan functionele innervatiepatronen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten zoals smaakknopvolume, innervatievolume en aantallen transducerende cellen voor de standaardisatie van assays.
- Operationele waarde: Faciliteert imaging-workflows met hoge getrouwheid die compatibel zijn met multiplex kleuring en geautomatiseerde beeldanalyse.
- Assay-gereedheid: Biedt een schaalbaar systeem voor het screenen van verbindingen die de integriteit van smaakknoppen of de neurale connectiviteit beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt analyse mogelijk van verstoringen in de relaties tussen smaakpapillen en zenuwen die zijn geïnduceerd door ziekten of therapieën, met behulp van genetisch gelabelde modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale studies door herhaalde kleuring en beeldvorming van whole mounts van hetzelfde weefsel mogelijk te maken.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie door de oorspronkelijke weefselarchitectuur te behouden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in discovery biology-workflows door het mogelijk maken van hypothesetoetsing met betrekking tot mechanismen van smaaksensatie en neurale connectiviteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en functionele validatie van smaaktransducerende celtypen via ruimtelijke co-lokalisatieanalyse.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die essentieel zijn voor compound-screening in chemosensorisch onderzoek.
- Analytics: Maakt gebruik van cel-pixelgebaseerde beeldvorming om subcellulaire afstanden tussen zenuwvezels en smaakreceptoren te meten, wat datagestuurde vergelijkingen mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de structurele integriteit voor het bestuderen van smaakstoornissen in modellen van chemotherapie, veroudering of genetische aandoeningen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd protocol voor weefselpreparatie dat toepasbaar is op meerdere smaakregio's en muismodellen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door bemonsteringsartefacten te elimineren en directe observatie van cel-zenuwinteracties mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde dissectie-, invries- en kleuringsprocedures.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van sensorische geneesmiddelen door mechanistisch inzicht te bieden in de target-interactie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van effecten op de structuur en innervatie van smaakpapillen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische dissectie en weefselbehandeling om de epitheliale integriteit te behouden.
- Is afhankelijk van cryostaatsnijden en OCT-embedding-infrastructuur voor een correcte weefseloriëntatie en invriezing.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor consistente weefselmontage- en kleuringsprotocollen.
- Moet rekening houden met variabiliteit in de dichtheid en grootte van smaakpapillen in de fungiforme, circumvallate en palatinale regio's.
- Wordt beperkt door de behoefte aan gespecialiseerde beeldvormings- en analysehulpmiddelen om zenuwvertakkingen te reconstrueren en subcellulaire nabijheid te kwantificeren.
