Name: Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Leer een geoptimaliseerde plaatmethode voor het meten van endogene monoamine-afgifte in acute rattenhersensnedes met HPLC-ECD. Deze techniek onderscheidt vesiculaire en transporteur-gemedieerde afgifte voor neurochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies Fondecyt Initiation Fund N 11191049 aan J.A.P. en NIH-subsidie DA038598 aan G.E.T.

Alle experimenten, inclusief dierbehandeling en weefselverzameling, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Universiteit van Florida en het City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), volgens het goedgekeurde protocol 201508873 (UF) en 1071 (CCNY). Voor reagentia en buffer verwijzen wij u naar het Aanvullend Dossier.
1. Bereid acute schijfjes rattenhersenen
OPMERKING: In dit experiment werden volwassen mannelijke ratten (250-350 g) gebruikt. Deze opstelling is echter functioneel voor verschillende ontwikkelingspunten, vrouwelijke ratten en andere soorten. Als u een kleiner dier gebruikt, zoals muizen, kan de experimentator zich aanpassen om het protocol te optimaliseren door een ander aantal hersenplakken of stoten per aandoening te gebruiken. Dissectiebuffer wordt buffer 1 genoemd; effluxbuffer wordt buffer 2 genoemd.
<ol><li>Bereid buffer 1 voor zoals vermeld in het aanvullend bestand. Verzadig buffer 1 met zuurstof door 20 minuten op ijs te borrelen met 95%/5% (O2/CO2). Verwijder 50 ml buffer 1 en laat afkoelen op ijs in een klein bekerglas of een petrischaaltje. Deze buffer wordt gebruikt om de acuut geoogste hele hersenen vast te houden.</li>
	<li>Verdoof een of twee volwassen ratten (250-350 g) met 1% -2% isofluraan, onthoofd ze met een guillotine en verwijder snel hun hersenen. Plaats de hersenen onmiddellijk in ijskoude zuurstofbuffer 1 in de container vanaf stap 1.1. OPMERKING: Zorg ervoor dat isofluraan en guillotine veilig worden gebruikt. Open isofluraan onder een zuurkast.</li>
	<li>Snijd met behulp van een vibratome of compresstome 300 μm coronale hersensecties uit elk interessegebied (figuur 1). Bubbling Buffer 1 moet aanwezig zijn tijdens het maken van secties. Breng met behulp van een roestvrijstalen spatel voorzichtig en onmiddellijk hersenplakken over in een nieuwe petrischaal gevuld met ijskoude zuurstofbuffer 1 (figuur 2).</li>
	<li>Ontleed verder hersenplakken (bijv. stoten, uitgesneden) door de plakjes voorzichtig naar glazen dia's te verplaatsen (figuur 1G) met behulp van rattenhersenatlas57. Identificeer bijvoorbeeld het dorsale striatum op basis van zijn donkere, dwarsgestreepte structuur en identificeer de hippocampus op basis van de nabijheid van de cortex en de unieke spiraalstructuur. De rechter- en linkerhersenhelft kunnen worden gescheiden om te gebruiken als controle- en experimentele plakjes (figuren 2G - H). Hier werd het dorsale striatum verder ontleed in 2 mm stoten (figuur 1G).</li>
	<li>Gebruik een plastic transferpipet met de punt afgesneden, breng plakjes of hersenstoten over in kleine containers ondergedompeld in zuurstofrijke ijskoude Buffer 1 met zuurstof die borrelt. Deze containers kunnen roestvrijstalen gaas zijn, of kleine petrischaaltjes gevuld met buffer (figuur 1H).</li>
</ol>2. Ex-vivo endogene monoamineafgifte uit hersenplakken of -stoten
OPMERKING: Het apparaat dat voor dit gedeelte wordt gebruikt, bestaat uit een plaat met 48 putten en een weefselhouder van zes microcentrifugefiltereenheden zonder dat de inzetfilters zijn aangesloten op een carbogenlijn (figuur 2). Om de houder te maken, gebruikt u een stevige plastic staaf (bijvoorbeeld van een celschroot) en lijmt u de microcentrifugefiltereenheden zonder de inzetfilters erop. Laat het 1-2 dagen drogen. De tijd die nodig is voor het endogene monoamine-afgifte-experiment en de concentraties van amfetamine, fluoxetine en cocaïne zijn gebaseerd op de huidige literatuur en eerdere protocollen13,20,58.
<ol><li>
Weefselactivering
	<ol>
<li>Breng het hersenweefsel van stap 1.1.5 over naar elke put van de effluxkamer en laat herstel gedurende 30-50 minuten bij 37 °C toe op een schuifverwarmer in 0,5-1 ml zuurstofbuffer 2, met constante, zachte borrel (figuur 2B1).</li>
		<li>Verdun tijdens deze incubatie de geneesmiddelen tot de gewenste concentratie voor het experiment. Alle geneesmiddelen moeten worden opgelost in Buffer 2 en de concentraties zijn gebaseerd op de huidige literatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eerste incubatie
	<ol>
<li>Verplaats de weefselhouder met hersenweefsel naar putjes met 500 μL zuurstofbuffer 2 en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Zorg ervoor dat er minimale tot geen buffer wordt getransporteerd door op de houder op de rand van de put te tikken totdat er geen overtollige buffer in de houder zit.</li>
		<li>In experimenten met farmacologische middelen zoals monoaminetransporterremmers, incubeer de weefselmonsters met de geneesmiddelen verdund in zuurstofbuffer 2 (bijv. 10 μM fluoxetine, 40 μM cocaïne; zie figuur 2B2). Het uiteindelijke volume in elke put is 500 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tweede incubatie
	<ol>
<li>Verplaats de houder met het weefsel naar een nieuwe set putjes met 500 μL totale Buffer 2 met of zonder de gewenste concentratie van elk medicijn. Zorg ervoor dat er geen overtollige buffer overblijft. Elke put vertegenwoordigt een n = 1 voor experimentele omstandigheden. Elke experimentele aandoening wordt in drievoud uitgevoerd.</li>
		<li>Eén put bevat een zuurstofrijke buffer 2, de volgende 10-30 μM AMPH en de laatste put bevat 10-30 μM AMPH plus monoaminetransporterremmers. Elk medicijn is opgelost in zuurstofrijke buffer 2.</li>
		<li>Incubeer het weefsel gedurende 20 minuten bij 37 °C met 500 μL van de medicijnconditie. OPMERKING: Extra putten kunnen een zuurstofrijke hoge K + Buffer 2 bevatten met of zonder de monoaminetransporterremmers. Los elk medicijn op in de zuurstofrijke buffer 2 (500 μL).</li>
		<li>Verzamel tijdens deze tweede incubatie van 20 minuten de oplossing uit de putten van de eerste incubatie in stap 2.2.1 en breng over naar microcentrifugebuizen met 50 μL 1 N perchloorzuur of fosforzuur (afhankelijk van het type HPLC, eindconcentratie 0,1 N). Het uiteindelijke volume van het monster is 550 μL. Houd microcentrifugebuizen op ijs en label de buizen # 1.</li>
		<li>Na de tweede incubatie van 20 minuten verplaatst u de weefselhouder met hersensecties of stoten naar een lege put en houdt u de plaat op ijs. Breng het supernatant over in microcentrifugebuizen die 50 μL 1 N perchloorzuur of fosforzuur bevatten. Het uiteindelijke volume van het monster is 550 μL. Houd microcentrifugebuizen op ijs en label de buizen # 2.</li>
		<li>Voeg 1 ml ijskoude buffer 1 toe aan elk putje met weefsel. Verzamel al het weefsel met behulp van een klein pincet en breng het over naar schone microcentrifugebuizen.</li>
		<li>Houd buisjes met hersenweefsel op -80 °C. Gooi de 1 ml buffer 1 weg (figuur 2B4).</li>
		<li>Filteroplossingen verkregen uit elke incubatie met behulp van microcentrifugefilterbuizen (0,22 μm) bij 2.500 x g gedurende 2 minuten. Gebruik het filtraat om het monoaminegehalte te bepalen met behulp van HPLC met elektrochemische detectie (figuur 2B5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Levensvatbaarheid van weefsel
<ol><li>MTT-test OPMERKING: Een belangrijk punt van zorg met betrekking tot deze experimentele opstelling is de levensvatbaarheid van het weefsel, omdat het weefsel maximaal enkele uren kan worden gebruikt59. Een MTT-test60,61 wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van weefsel aan het einde van het experiment te bepalen. Deze test is gebaseerd op de omzetting van het gele tetrazoliumzout MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) naar paarse formazankristallen door levensvatbare cellen met voldoende metabolisme.<ol>
<li>Onderhoud na het experiment een aparte groep weefselmonsters en scheid ze in twee groepen.</li>
		<li>Incubeer één groep gedurende 20 minuten bij 37 °C in Triton X-100 (1%) opgelost in Buffer 2 als controle. Triton X-100 behandeling resulteert in celdood. Handhaaf de tweede groep in Buffer 2 en incubateer niet in Triton X-100 (weefsel levensvatbaarheidscontrole).</li>
		<li>Voeg MTT (stockoplossing 5 mg/ml in PBS, pH 7,4) toe aan beide groepen in de zuurstofhoudende buffer 2 tot een eindconcentratie van 0,5 mg/ml.</li>
		<li>Incubeer de weefselmonsters gedurende 20 minuten bij 37 °C, was met PBS en breng ze over in microcentrifugebuizen met 250 μL van een mengsel van SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) en water om de formazankristallen op te lossen.</li>
		<li>Incubeer de monsters gedurende 24 uur.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 10.000 x g en meet de absorptie van het supernatant (200 μL) bij 562 nm en 690 nm met behulp van een microplaatlezer. De levensvatbaarheid van het weefsel wordt als volgt berekend: (A562-A690)/weefselgewicht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. HPLC-analyse van monoaminen
<ol><li>Kwantificeer monoamineafgifte van elke experimentele aandoening met behulp van HPLC-ECD volgens eerdere protocollen13,44, met behulp van een omgekeerde fasekolom.<ol>
<li>Bereid de mobiele fase voor die nodig is voor detectie. Deze bestaat uit 100 mM fosforzuur, 100 mM citroenzuur, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L octanesulfonzuur, 8% v/v acetonitril (uiteindelijke pH 6,0). De samenstelling van de mobiele fase is afhankelijk van het type HPLC en de gebruikte kolom.</li>
		<li>Stel de potentiaal van de elektrochemische detector (2 mm glasachtige koolstofelektrode) in op 0,46 V en stel het debiet in op 0,05 ml/min.</li>
		<li>Laad 5 μL van elk monster, inclusief neurotransmitterstandaarden in de HPLC voor auto-injectie en detectie. De hoeveelheid van elk toegevoegd monster is afhankelijk van het type HPLC dat wordt gebruikt.</li>
		<li>Zodra de HPLC de run heeft voltooid, gebruikt u de gegeven HPLC-analysesoftware om de chromatografische gegevens te verzamelen en te analyseren.</li>
		<li>Analyseer monoamine inhoud met behulp van een standaard curve samengesteld uit elke monoamine (Dopamine: DA, Noradrenaline: NE, en serotonine: 5-HT; Figuur 2C). Gebruik de resulterende chromatogrammen om het gebied onder de curve (AUC) te verkrijgen op basis van de richtlijnen van de fabrikant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Weefsellysaten voorbereiden voor eiwitkwantificering
<ol><li>
Eiwit assay
	<ol>
<li>Voeg ijskoude lysisbuffer plus proteaseremmers (0,1 g/1 ml) toe aan elke microcentrifugebuis met hersensecties/ponsen en homogeniseer met behulp van een stamperhomogenisator. De microcentrifugebuizen moeten tijdens het homogeniseren op ijs worden gehouden om eiwitafbraak te voorkomen.</li>
		<li>Incubeer weefselhomogenaten gedurende 1 uur bij 4 °C met lichtrotatie.</li>
		<li>Centrifugeer weefsel homogeneert bij 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en herstel het supernatant.</li>
		<li>Bepaal de eiwitconcentratie in de supernatanten, met runderserumalbumine (BSA) als standaard.</li>
		<li>Normaliseer het monoaminegehalte in elk hersenmonster tot het totale eiwitgehalte (μg) gemeten in 250 μL hersenweefsel gelyseerd. Gebruik de onderstaande formule om het nmol monoamine/g eiwit te bepalen. df = verdunningsfactor.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62127/62127eq01.jpg">
6. Statistische analyse
<ol><li>Analyseer monoamine release (nmol / g) met behulp van eenrichtings ANOVA gevolgd door Sidak's meerdere vergelijkingstest voor post-hoc vergelijkingen.</li>
	<li>Analyseer de levensvatbaarheid van weefsel met behulp van een Unpaired Student's t-test voor onafhankelijke groepen (Controle vs. 1% Triton X-100).</li>
	<li>Stel voor alle statistische analyses het alfaniveau in op ≤ 0,05.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen.

Monoamine-afgiftemetingen worden al jaren uitgevoerd in een aantal systemen zoals heterologe cellen, neuronale culturen, hersensynaptosomen, ex vivo acute hersenplakken en hele dieren13,20,41,42,58,64,65,66,67,68</sup...

Een overvloed aan neurologische en psychiatrische ziekten worden geassocieerd met ontregeling of onvoldoende onderhoud van monoamine neurotransmitter (dopamine [DA], serotonine [5-HT], noradrenaline [NE]) homeostase1,2,3. Deze aandoeningen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, depressie1,2, schizofrenie2, angst2, verslaving4, menopauze5,6,7, pijn8 en de ziekte van Parkinson3. Verschillende rattenmodellen van de menopauze hebben bijvoorbeeld aangetoond dat de ontregeling of vermindering van monoaminen in de hippocampus, prefrontale cortex en striatum kan worden geassocieerd met zowel depressie als cognitieve achteruitgang, wat wordt gezien bij vrouwen die de menopauze ervaren. De ontregeling van monoaminen in deze modellen is uitgebreid onderzocht met behulp van HPLC-ECD, hoewel de studies geen onderscheid maakten tussen gemeten neurotransmittergehalte versus neurotransmitterafgifte5,6,7. Monoaminen worden klassiek vrijgegeven in de extracellulaire ruimte via Ca2 +-afhankelijke vesiculaire afgifte9, en worden gerecycled via hun respectieve plasmamembraanheropnamesysteem (dopaminetransporter, DAT; serotoninetransporter, SERT; noradrenalinetransporter, NET)10,11. Omgekeerd suggereren gegevens dat deze transporters monoaminen kunnen vrijgeven of effluxeren, aangezien van misbruikmiddelen zoals amfetamine (AMPH) en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA) bekend is dat ze DA en 5-HT vrijgeven, respectievelijk via hun transportersystemen12,13,14,15,16,17 . Een goed mechanistisch begrip van de dynamiek van monoamineafgifte is dus cruciaal voor het ontwikkelen van specifieke en gerichte farmacotherapieën.
Een breed scala aan technieken is gebruikt om monoamineafgifte te bestuderen, zoals Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo microdialyse13, imaging19, pre-integratie met radioactief gelabelde monoaminen20, optogenetica en meer recent, genetisch gecodeerde fluorescerende sensoren en fotometrie21,22 . FSCV en in vivo microdialyse zijn de primaire technieken die worden gebruikt voor het bestuderen van de afgifte van monoamine. FSCV wordt gebruikt om de gestimuleerde exocytotische afgifte van voornamelijk DA in acute hersenschijfjes en in vivo23 te bestuderen. Omdat FSCV elektroden gebruikt om afgifte te stimuleren of op te roepen, is de primaire bron van afgifte van neurotransmitters Ca2 + -afhankelijke vesiculaire afgifte18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo microdialyse in combinatie met HPLC meet veranderingen in extracellulaire neurotransmitterniveaus met behulp van een sonde geplaatst in een hersengebied van belang13,32. Net als bij FSCV is een belangrijke beperking van in vivo microdialyse de moeilijkheid om de bron van neurotransmitterafgifte te bepalen: Ca2 + afhankelijke vesiculaire afgifte of transporterafhankelijk. Opmerkelijk is dat beide methoden de directe meting van monoamineafgifte mogelijk maken. Door de recente vooruitgang van de optogenetica toont onderzoek detectie van 5-HT en DA-afgifte in een korte tijdspanne met prachtige celtype specificiteit21,22. Deze strategieën vereisen echter complexe en kostbare technieken en apparatuur en meten indirect de afgifte van monoamine, met name door monoaminebinding aan receptoren. Verder worden radioactief gelabelde monoaminen ook gebruikt voor het bestuderen van monoaminedynamica. Radioactief gelabelde monoaminen kunnen vooraf worden geladen in verschillende modelsystemen, zoals heterologe cellen die elke monoaminetransporter overexpressie geven20,33,34,35,36,37,38,39,40, primaire neuronen20, synaptosomen33,39,41, 42, en acute hersenplakken43,44. Radioactiviteit vormt echter potentiële schade voor de experimentator en de tritium-gelabelde analyten kunnen de endogene monoaminedynamiek niet getrouw samenvatten45,46. Superfusiesystemen in combinatie met offline detectiemethoden zoals HPLC-ECD hebben de detectie van monoaminen uit meerdere weefselbronnen mogelijk gemaakt. Hier biedt dit protocol als een geoptimaliseerde en goedkope, eenvoudige en nauwkeurige methode met behulp van acute hersenplakken om endogene basale en gestimuleerde monoamineafgifte direct te meten.
Acute hersenplakken maken het mogelijk om mechanistische hypothesen te testen, voornamelijk omdat ze de in vivo anatomische micro-omgeving behouden en intacte synapsen behouden47,48,49,50,51,52. In enkele studies zijn acute hersenplakken of gehakt hersenweefsel gebruikt in combinatie met een superfusietechniek met behulp van KCl om Ca2 + gemedieerde afgifte te stimuleren53,54,55,56. Superfusiesystemen zijn van cruciaal belang geweest om het begrip van het veld van neurotransmitterafgiftemechanismen, waaronder monoaminen, te bevorderen. Deze systemen zijn echter relatief duur en het aantal kamers dat beschikbaar is voor weefselanalyse varieert van 4-12. Ter vergelijking: de hier gepresenteerde methode is goedkoop, maakt het mogelijk om 48 weefselmonsters te meten en kan worden verfijnd om maximaal 96 weefselmonsters te gebruiken. Elke put in de 48-putplaat bevat weefselhouders die filters gebruiken om het vrijgegeven product van het weefsel te scheiden, en vrijgegeven monoaminen worden vervolgens verzameld en geanalyseerd door HPLC-ECD. Belangrijk is dat deze methode de gelijktijdige meting van 5-HT, DA en NE-afgifte mogelijk maakt uit verschillende hersengebieden zoals de prefrontale cortex, de hippocampus en het dorsale striatum na behandeling met farmacologische middelen die de afgifte van monoamine moduleren. Zo kan de experimentator meerdere vragen beantwoorden met behulp van een goedkoop multi-well-systeem dat het aantal geteste monsters verhoogt en daardoor het aantal gebruikte dieren vermindert.

<table><tbody><tr><td>48 Well plate</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Assay</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fischer Scientific</td><td>A998-1</td><td>Mobile Phase</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Ahydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Modified Artificial Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td></tr><tr><td>Clarity Software</td><td>Anetc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Mobile Phase</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>1002608421</td><td>Dissection Buffer</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td>MTT Assay</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Mobile Phase</td></tr><tr><td>GraphPad Software</td><td>Graphpad Software, Inc</td><td></td><td>Statistical Analysis</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Lysis buffer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Lysis buffer</td></tr><tr><td>HPLC, Decade Amperometric</td><td>Anetc</td><td></td><td>HPLC, LC-EC system</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Amuza</td><td></td><td>HPLC HTEC-510.</td></tr><tr><td>L-Asrobic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>Dissection Buffer</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma</td><td>7487-88-9</td><td>KH Buffer</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Filter Units UltraFree</td><td>Millipore</td><td>C7554</td><td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Thermo Fisher</td><td>M6494</td><td>MTT Assay</td></tr><tr><td>Nanosep</td><td>VWR</td><td>29300-606</td><td>Assay; protein assay</td></tr><tr><td>Octanesulfonic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800010</td><td>Mobile Phase</td></tr><tr><td>Pargyline Clorohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8013</td><td>Modified Artificial Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer</td></tr><tr><td>Phosphoric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Mobile Phase</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td>KH Buffer</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma</td><td>1001655559</td><td>KH Buffer</td></tr><tr><td>Precisonary VF-21-0Z</td><td>Precissonary</td><td></td><td>Compresstome</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2714</td><td>Lysis buffer.</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Dissection Buffer</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Dissection Buffer</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>KH Buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Lysis buffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>MTT Assay / Lysis buffer</td></tr></tbody></table>

een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters worden geassocieerd met tal van neurologische en psychiatrische aandoeningen. Diermodellen van dergelijke omstandigheden hebben veranderingen in de afgifte en opnamedynamiek van monoamine-neurotransmitters aangetoond. Technisch complexe methoden zoals elektrofysiologie, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), beeldvorming, in vivo microdialyse, optogenetica of gebruik van radioactiviteit zijn vereist om de monoaminefunctie te bestuderen. De hier gepresenteerde methode is een geoptimaliseerde tweestapsbenadering voor het detecteren van monoamineafgifte in acute hersenplakken met behulp van een 48-well plaat met weefselhouders voor het onderzoeken van monoamineafgifte en hoogwaardige vloeistofchromatografie in combinatie met elektrochemische detectie (HPLC-ECD) voor monoamine-afgiftemeting. Kortom, rattenhersensecties met interessante gebieden, waaronder prefrontale cortex, hippocampus en dorsaal striatum, werden verkregen met behulp van een weefselsnijder of vibratome. Deze interessegebieden werden ontleed uit de hele hersenen en geïncubeerd in een zuurstofrijke fysiologische buffer. De levensvatbaarheid werd onderzocht gedurende het experimentele tijdsverloop, door middel van 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay. De acuut ontleedde hersengebieden werden geïncubeerd in verschillende medicijnomstandigheden waarvan bekend is dat ze monoamineafgifte induceren via de transporter (amfetamine) of door de activering van exocytotische vesiculaire afgifte (KCl). Na incubatie werden de vrijgekomen producten in het supernatant verzameld en geanalyseerd via een HPLC-ECD-systeem. Hier wordt basale monoamineafgifte gedetecteerd door HPLC uit acute hersenplakken. Deze gegevens ondersteunen eerdere in vivo en in vitro resultaten waaruit blijkt dat AMPH en KCl monoamineafgifte induceren. Deze methode is met name nuttig voor het bestuderen van mechanismen die verband houden met monoaminetransporterafhankelijke afgifte en biedt de mogelijkheid om verbindingen die de afgifte van monoamine beïnvloeden op een snelle en goedkope manier te screenen.

Deze techniek beschrijft het gebruik van hersenplakken om de afgifte van endogene monoaminen te meten met behulp van HPLC met elektrochemische detectie op basis van een 48-putplaat met een interne weefselhouder. De experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Aanvankelijk werd, om de levensvatbaarheid van het weefsel tegen het einde van het experiment te garanderen, een MTT-test (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2...

Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Deze techniek is een aanpassing van veelgebruikte methoden voor het onderzoeken van monoamineafgifte, waardoor de endogene afgifte kan worden gemeten in plaats van vooraf geladen radioactief gelabelde monoaminen onder meerdere farmacologische omstandigheden tegelijk. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het redelijk kosteneffectief is, meerdere farmacologische aandoeningen tegelijk kunnen worden onderzocht en we endogene monoamineafgifte kunnen bestuderen met het vermogen om onderscheid te maken tussen vesiculaire en transporter-gemedieerde afgifte. Om hersenplakken van volwassen 250 tot 350 gram mannelijke ratten na de oogst te bereiden, plaatste onmiddellijk de hersenen en ijskoude zuurstofrijke dissectiebuffer en verkreeg 300 micron coronale hersensecties uit elk gebied van belang.Voor verdere dissectie van de hersenplakken, verplaats de weefsels zorgvuldig naar glazen dia's en gebruik een rattenhersenatlas om het dorsale striatum te identificeren op basis van zijn donkere dwarsgestreepte structuur en om de hippocampus te identificeren op basis van de nabijheid van de cortex en zijn unieke spiraalstructuur. Scheid de rechter- en linkerhersenhelft voor hun gebruik als controle- en experimentele plakjes. Het dorsale striatum kan verder worden ontleed in twee millimeter stoten.Gebruik vervolgens een plastic transferpipet met een aangepaste punt om de monsters over te brengen in kleine containers ondergedompeld in zuurstofrijke ijskoude dissectiebuffer met zuurstofborrelen. Om monoamineafgifte te induceren, brengt u de weefselmonsters over naar elke put van een op maat gemaakte 48 put effluxkamer met 0,5 tot één milliliter effluxbuffer per put met constant zacht borrelen en laat u de monsters gedurende 30 tot 50 minuten herstellen bij 37 graden Celsius. Verplaats aan het einde van de evenwichtsperiode de weefselhouder met hersenweefsel naar putjes met 500 microliter zuurstofrijke effluxbuffer met of zonder farmacologisch middel en tik de houder op de rand van de put om de minimale overdracht van buffer tussen putten te voorkomen gedurende een incubatie van 20 minuten bij 37 graden Celsius.Verplaats de houder aan het einde van de incubatie naar een nieuwe set putten met 500 microliter effluxbuffer met of zonder het medicijn van belang en breng de plaat nog eens 20 minuten terug naar de celkweekincubator. Breng tijdens de tweede incubatie de oplossing van de putten van de eerste incubatie over in microcentrifugebuizen met 50 microliter van één normaal perchloorzuur of fosforzuur op ijs en label de buizen nummer één"Aan het einde van de tweede incubatie verplaatst u de weefselhouder naar lege putten met de plaat op ijs en brengt u de supernatanten over van de tweede incubatie naar nieuwe microcentrifugebuizen met 50 microliter van één normale perchloor of fosforzuur zuur op ijs. Label deze buizen nummer twee "Wanneer alle supernatanten zijn overgebracht, voegt u een milliliter ijskoude dissectiebuffer toe aan elke put weefsel en gebruikt u een klein pincet om elk weefselmonster over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis.Verwijder de buffer uit de monsterbuizen en bewaar de weefsels bij min 80 graden Celsius, breng vervolgens de verzamelde incubatieoplossingen over in microcentrifugefilterbuizen voor centrifugering en plaats het filtraat op ijs tot HPLC-analyse. Stel het potentieel van de ECD en het debiet in op de aanbeveling van de fabrikant voor het detecteren van monoaminen. Belasting en passend aliquot van elk monster, inclusief neurotransmitterstandaarden in de HPLC voor automatische injectie en detectie en laat het instrument de analyse voltooien.Gebruik vervolgens de HPLC-analysesoftware om de chromatografische gegevens te verkrijgen en te analyseren met behulp van een standaardcurve die uit elk monoamine bestaat om het gebied onder de curve te verkrijgen op basis van de richtlijnen van de fabrikant. Na zes uur functionele analyse blijven weefselmonsters levensvatbaar, terwijl monsters geïncubeerd met 1% Triton X-100 een significante vermindering van MTT-transformatie laten zien. Acute behandeling van 20 minuten van hippocampale en prefrontale cortex hersensecties met amfetamine induceert een significante toename van het extracellulaire niveau van elke monoamine.Wanneer de monsters worden voorbehandeld met fluoxetine, een selectieve serotonineheropnameremmer, induceert de amfetamine een toename van extracellulaire serotonine in de hippocampus en de prefrontale cortex niet, terwijl de toename van extracellulaire dopamine- en noradrenalineproductie niet wordt beïnvloed. Bovendien induceert acute behandeling van 20 minuten van dorsale striatumstoten met amfetamine een 35-voudige toename van extracellulaire dopamineniveau-expressie, terwijl dorsale striatum punchbehandeling met cocaïne, een monoaminetransporterblokker, resulteert in een significante remming van amfetamine geïnduceerde extracellulaire dopamine. Het verhogen van de concentratie van extracellulair kaliumchloride om membraandepolarisatie op te roepen is voldoende om de exocytotische afgifte van monoaminen te induceren in vergelijking met onbehandelde controleomstandigheden, en noch fluoxetine noch cocaïnebehandeling blokkeert deze diepe polarisatie geïnduceerde toename.Het is absoluut noodzakelijk om schone gesneden secties te hebben, een nauwkeurige lokalisatie van ponsen en om consistente oxygenatie te behouden gedurende het hele experiment. De hersensecties kunnen na experimenten worden gebruikt voor verdere biochemische verwerking en analyse, zoals western blotting en histologie.

a-plate-based-assay-for-measurement-endogenous-monoamine-release

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dopamine is duidelijk geregeld in de middenhersenen kernen, die de cellichamen en dendrieten van de dopamine neuronen bevatten. Hier beschrijven we een dissectie en sample-handling aanpak om de resultaten te maximaliseren, en dus conclusies en inzichten, op dopamine regelgeving in de middenhersenen kernen van de substantia nigra (SN) en ventrale tegmentale gebied (VTA) bij knaagdieren.

Uitgebreide Profilering van Dopamine verordening in de substantia nigra en het ventrale tegmentale gebied

In this video, we demonstrate an assay that investigates monoamine release mechanisms from the neurons of metabolically active ex vivo rat brain slices, when treated with test drugs. The assay demonstrates that neurostimulant drugs induce monoamine release via the cellular monoamine transporters, whereas high KCl concentration induces synaptic vesicle exocytosis-mediated vesicular monoamine release.

A Plate-Based Assay to Measure Monoamine Release from Brain Slices on Test Drug Exposure

This video demonstrates a microelectrode array-based assay for studying neuronal network activity in mouse spinal cord sections. First, the electrophysiological activity from the superficial dorsal horn (SDH) of the slice is recorded. Then, a potassium channel inhibitor is introduced to prolong depolarization, resulting in synchronous rhythmic activity across the neuronal network.

Microelectrode Array-Based Assessment of Neuronal Networks in Mouse Spinal Cord Slices

This video demonstrates the assessment of dopamine uptake in synaptosomes harvested from mouse brains. It outlines steps for preparing synaptosomes for dopamine uptake via dopamine transporters, treating them with varying concentrations of radiolabeled dopamine, isolating the synaptosomes, and measuring radioactivity to quantify dopamine uptake.

Measuring Dopamine Uptake in Mouse Brain Synaptosomes Using Radiolabeled Dopamine

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Hier beschrijven we de setup, softwarenavigatie en gegevensanalyse voor een ruimte en tijd nauwkeurige werkwijze voor het meten tonische en fasische extracellulair glutamaat veranderingen in vivo middels enzymgekoppelde micro-elektrode arrays (MEA).

Met behulp van Enzyme-gebaseerde biosensoren te meten Tonic en Fasische glutamaat in de ziekte van Alzheimer muismodellen

Synaptosomal dopamine opname en krachtige vloeibare chromatografie vertegenwoordigen experimentele analysetools te onderzoeken van dopamine homeostase in muizen door beoordeling van de functie van de dopamine transporter en niveaus van dopamine in striatale weefsel, respectievelijk. Hier presenteren we protocollen voor dopamine weefsel inhoud meten en beoordelen van de functionaliteit van de dopamine transporter.

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Zuurstofverbruik (OCR) is een veel voorkomende proxy voor mitochondriale functie en kan worden gebruikt om verschillende ziektemodellen te bestuderen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen die fysiologisch relevanter is dan andere methoden.

Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen

Hier schetsen we een protocol voor het gebruik van complementaire metaaloxide-halfgeleider high-density micro-elektrode array-systemen (CMOS-HD-MEA's) om aanvalsachtige activiteit van ex vivo hersenplakjes vast te leggen.

Hoogwaardige aanvalsachtige activiteit van acute hersenplakjes met behulp van een complementair metaaloxide-halfgeleider micro-elektrode-array-systeem met hoge dichtheid

Leer een geoptimaliseerde plaatmethode voor het meten van endogene monoamine-afgifte in acute rattenhersensnedes met HPLC-ECD. Deze techniek onderscheidt vesiculaire en transporteur-gemedieerde afgifte voor neurochemisch onderzoek.

Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

Meer video's verkennen