Systematische scoringsanalyse voor darmontsteking in een muriene dextran natriumsulfaat-geïnduceerde colitismodel

De systematische scoringsanalyse is een techniek voor het evalueren van mucosale letsels, waardoor histologische interpretatie wordt vergemakkelijkt die kan worden uitgevoerd door getrainde onderzoekers. De belangrijkste voordelen van deze methode is dat het gratis en gemakkelijk te gebruiken is. Het maakt kwantitatieve analyse mogelijk van histologische gegevens verkregen uit de darmen van muizen met colitis.

Dit protocol biedt een snelle en reproduceerbare manier om de ernst van de ziekte van de hele dikke darm te interpreteren, wat nodig is om ziektes van dieren met verschillende genetische achtergronden te vergelijken. Voor weefselvoorbereiding is het belangrijk om alle reagentia en materialen te organiseren. Begin met het plaatsen van een geëuthanaseerde muis op een ontleedkussen in een liggende positie en immobiliseer de uiteinden van de muis met behulp van 20 gauge 1,5 inch naalden.

Maak met behulp van een tang en schaar een kleine incisie op de buikhuid en trek deze naar de zijkant om het peritoneum bloot te leggen en open vervolgens de buikholte met een middellijnincisie in het buikvlies van het schaambeen naar de zijkanten van de buik. Verwijder voorzichtig weefsels en organen totdat de dikke darm wordt gevisualiseerd. Snijd het bekkenbeen aan beide zijden van de dikke darm om het orgaan volledig te visualiseren, dat zich uitstrekt van de anus naar het cecum.

Verwijder voorzichtig vet, kleine aderen en slagaders die aan de dikke darm zijn bevestigd terwijl u het orgaan zorgvuldig ontleedt, snijdt het gewoon proximaal naar de anus en distaal naar het cecum. Spoel de dikke darm voorzichtig door met PBS om de fecale inhoud te verwijderen met behulp van een flexibele plastic galpenaald die door de anus wordt ingebracht. Plaats de dikke darm in een rechte lijn en open in de lengterichting langs de mesenterische slagader.

Bisect de dikke darm in de lengterichting van het distale naar het proximale uiteinde. Gebruik de helft van het weefsel voor histologische analyse en de andere helft voor westerse vlek, PCR, of gerold in een tweede Zwitserse rol voor verse bevroren immunofluorescentiemicroscopie. Knip extra weefsel uit de proximale dikke darm met een scheermesje tot ongeveer dezelfde breedte over de lengte van de hele dikke darm is verkregen.

Lijn de dikke darm uit om het lumen bloot te leggen en het weefsel volledig af te vlakken met behulp van een flexibele galnaald. Voeg indien nodig meer PBS toe om het weefsel vochtig te houden tijdens de procedure. Verwijder de overtollige PBS met een papieren doekje.

Voeg met een spuit en gavage naald gedurende twee tot drie minuten 10% neutrale gebufferde formalineoplossing toe om het weefsel te fixeren en af te vlakken, gebruik vervolgens rechte tang om het uiteinde van de distale dikke darm te grijpen en draai de dikke darm in concentrische cirkels van het distale naar proximale uiteinde. Steek een naald van 27 gauge om de dikke darm in het midden te spelden en houd de Zwitserse rolvorm vast en plaats de Zwitserse rol vervolgens in een insluitcassette in een histologische monstercontainer die het weefsel parallel ten opzichte van de cassette oriënteert. Fixeer het weefsel in 10%neutrale gebufferde formalineoplossing 's nachts bij vier graden Celsius.

Was het weefsel na een nachtfixatie driemaal met PBS. Voeg 70% ethanol toe voorafgaand aan het inbeddingsproces van paraffine en verwijder de naald van de Zwitserse rol voordat u verdergaat. Het weefsel kan bij kamertemperatuur in ethanol worden bewaard tot paraffine-inbedding.

Controleer na het openen van de gescande afbeeldingen in de beeldverwerkingssoftware of de hele dubbele punt zichtbaar is en of er geen ontbrekende delen van het voorbeeld zijn. Activeer de gereedschappen labelafbeelding en schaalbalk om gescande dia's correct te identificeren door op labelafbeelding te klikken. Open het gereedschap annotaties door op annotaties te klikken en maak drie verschillende lagen door op een nieuwe laag te klikken om de totale lengte van de Zwitserse rol, ontsteking of letsel en erosie of ulceratie te kwantificeren.

Kies een andere kleur voor elke laag door op laagkleur te klikken. Meet de lengte van elke laag of categorie door op het pengereedschap te klikken om een lijn te tekenen langs het muscularis-slijmvlies en beweeg de aanwijzer indien nodig om het aangrenzende gebied voor analyse te visualiseren. Bekijk het beeld op 400 micrometer zoom om een adequate visualisatie van het muscularis slijmvlies te vergemakkelijken.

Telkens wanneer de pen wordt gestopt, wordt een klein nieuw laaggebied gegenereerd. Het kan worden gevisualiseerd en bewerkt met het tabblad laaggebieden. Bekijk de totale lengte, ontsteking of letsel, en erosie of ulceratie gemeten met behulp van het muscularis-slijmvlies als referentie.

Zodra alle lagen zijn gedefinieerd, exporteert u de gegevens met behulp van het exportraster naar de knop tekstbestand in de opties voor laaggebieden. Open de tekstbestanden en kopieer de gegevens naar een spreadsheetsoftware. Totaal alle segmenten uit elke regio en bereken het percentage letsel en ulceratie met betrekking tot de totale lengte.

Overweeg drie belangrijke kenmerken om de histologische colitisscore te berekenen en de ernst van de ziekte te evalueren. Controleer op gezond darmslijmvlies, dat wordt gekenmerkt door georganiseerde epitheelcellen in de cryptische luminale as, lamina propria met weinig immuuncellen en subjacent muscularis mucosa. Controleer vervolgens op ontsteking of letsel, dat wordt gekenmerkt door epitheliale crypten die verzwakt zijn of gedeeltelijk epitheelcellen missen en mucosale ontsteking met neutrofiele infiltratie in crypten.

Controleer ten slotte op de aanwezigheid van erosie of ulceratie, die wordt gekenmerkt door gebieden zonder oppervlakte-epitheel of gebieden die volledig ontbreken aan epitheel crypten met of zonder bijbehorende leukocyten. Om de betrouwbaarheid van deze histologische colitisscoreanalyse in de context van mucosale schade te illustreren, werd 2,5% DSS gedurende vijf dagen toegediend in het drinkwater van acht C57BL6 wilde muizen, gevolgd door een herstelperiode met regelmatig water gedurende vijf dagen. Het lichaamsgewicht bleef constant tijdens de acute toediening van DSS, maar nam dramatisch af toen muizen regelmatig kraanwater begonnen te drinken.

Bloed en zachte ontlasting verschenen na drie dagen DSS-toediening en gingen door tot dag acht van het experiment. Deze waarnemingen suggereerden dat de meest schadelijke effecten van blootstelling aan DSS werden waargenomen tijdens de herstelperiode tussen dag vijf en acht. Meting van de lengte van de dikke darm op dag 10 bevestigde een significante verkorting aan het einde van het experiment.

Colons werden geoogst op dag nul, twee, vijf, zeven, acht en 10 om paraffine Zwitserse broodjes te maken. Het weefsel was bevlekt met H&E en high definition scans werden geanalyseerd om de histologische colitisscore en het percentage letsel en ulceratie te berekenen. Normale cryptearchitectuur werd waargenomen bij onbehandelde muizen.

Na twee dagen DSS-toediening werd de rekrutering van immuuncellen waargenomen. Op dag vijf lijken epitheelcellen beschadigd en was er een infiltratie van neutrofielen in het epitheel geassocieerd met epitheliale verwonding. Vanaf dag vijf tot acht werden gebieden met epitheelverlies met ontsteking en ulceratie waargenomen.

Op dag 10 begonnen epitheelcellen gezwollen gebieden te regenereren en opnieuw te bevolken, waardoor het darmslijmvlies langzaam werd hersteld. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om een goed georiënteerde en goed bewaarde Zwitserse rol te creëren, evenals om mucosale ontsteking of letsel en ulceratie of erosie correct te identificeren. Deze methode kan worden gebruikt om letsel over de gehele lengte van het darmslijmvlies kwantitatief te evalueren in andere modellen van colitis, zoals TMS of T-cel transfermodel.