Name: Een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie voor neuroHIV-onderzoek met stereotaxische injectie. Dit model maakt gedetailleerde studies van HIV-gerelateerde neurocognitieve stoornissen en comorbiditeit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624.

Alle dierprotocollen werden herzien en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina (federaal betrouwbaarheidsnummer: D16-00028). Zes volwassen mannelijke F344/N rat werd gekoppeld in een gecontroleerde omgeving onder een 12/12 licht: donkere cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle dieren werden verzorgd aan de hand van richtlijnen die zijn vastgesteld door de National Institutes of Health in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virusverpakking in cellen van 293 FT
<ol><li>Kweek de 293 FT cellen (5×105/ml) in gelatine gecoate 75 cm2 kolven met DMEM plus 10% FBS11. Kweek cellen bij 37 °C tot 50% samenvloeiing bij transfectie.</li>
	<li>Verdun 22,5 μL transfectiereagens (bijv. Lipofectamine 3000) in 750 μL medium (bijv. Opti-MEM) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en vortex gedurende 3 s.</li>
	<li>Verdun 20 μg EcoHIV plasmide DNA in 750 μL medium in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng goed.</li>
	<li>Voeg verdund DNA toe aan de buis van verdund transfectiereagens en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg het mengsel toe aan 10 ml voorverwarmd DMEM-medium in een kolf van 75 cm2. Incubeer cellen gedurende 2 dagen bij 37 °C.</li>
	<li>Oogst en combineer 24 ml voorwaardelijk medium uit de twee kolven die het verpakte lentivirus bevatten.</li>
	<li>Centrifugeer alle 24 ml voorwaardelijk medium bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het geklaarde supernatant over in een steriele buis van 50 ml.</li>
	<li>Combineer 8 ml Lenti-x concentrator met 24 ml geklaard supernatans (verhouding 1:3). Mix door zachte inversie. Incubeer het mengsel gedurende twee dagen bij 4 °C.</li>
	<li>Centrifugeer het mengsel gedurende 45 minuten bij 4 °C op 1500 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant.</li>
	<li>Hang de pellet voorzichtig opnieuw op met 100 μL van 100 mM PBS.</li>
	<li>Titer virusconcentratie met een p24 ELISA kit.</li>
</ol>2. EcoHIV-EGFP virus stereotaxic operaties
<ol><li>Verdoof ratten met 3% sevofluraan. Ga verder met stap 2.2 wanneer de ratten niet reageren op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn.</li>
	<li>Scheer de haren uit het hersengebied en steriliseer de huid twee keer met 70% ethanol en een scrub op basis van chloorhexidine. Zet de rat in een gevoelige positie in het stereotaxic-apparaat.</li>
	<li>Maak een incisie (5-6 cm) door de huid langs de hoofdhuidmiddenlijn.</li>
	<li>Markeer twee boorposities op 0,8 mm zijdelings, 1,2 mm rostral tot bregma. Boor een gat (diameter 0,4 mm) in elke schedelpositie.</li>
	<li>Vul de ecoHIV lentivirusoplossing (1,04 × 106 TU/ml) in een injectiespuit van 10 μL. Bevestig de spuit aan het stereotaxic-apparaat.</li>
	<li>Beweeg de naald dicht bij het boorgatoppervlak. Meet en beweeg 2,5 mm diep.</li>
	<li>Infuseer 1 μL virusoplossing met een snelheid van 0,2 μL/min. Houd de naald gedurende 5 minuten in het injectiegebied. Beweeg de naald langzaam omhoog tot deze zich buiten de rattenschedel bevindt.</li>
	<li>Hecht de huid met een 4-0 zijden draad.</li>
	<li>Steriliseer de incisie eenmaal met 70% ethanol. Subcutaan injecteren butorfenol (Dorolex, 0,1 mg/kg lichaamsgewicht).</li>
	<li>Breng de rat over naar een herstelkamer met een verwarmingskussen totdat hij wakker wordt.</li>
</ol>3. Visualisatie van hersensecties
OPMERKING: Wacht één tot acht weken na de virale infusie van EcoHIV.
<ol><li>Verdoof de rat met 5% sevofluraan. Ga verder met stap 3.2 wanneer de ratten niet reageren op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn.</li>
	<li>Bevestig de rat in een liggende positie in een zuurkast.</li>
	<li>Inciseer de huid langs de thoracale middellijn. Snijd het middenrif door en open de borstholte.</li>
	<li>Steek een naald van 20 G × 25 mm in de linkerventrikel.</li>
	<li>Open direct het rechter atrium met een schaar.</li>
	<li>Perfuseer 50 ml voorgeknepen 100 mM PBS met een snelheid van 5 ml/min.</li>
	<li>Perfuseer 100 ml koude 4% paraformaldehyde met een snelheid van 5 ml/min.</li>
	<li>Onthoofd de rat, open de hoofdhuid en verwijder de hersenen.</li>
	<li>Postfix 's nachts met 4% paraformaldehyde.</li>
	<li>Breng de hersenen over naar 40 ml 30% sacharose in 100 mM PBS in een buis van 50 ml totdat de hersenen naar de bodem drijven (ongeveer 3 dagen).</li>
	<li>Snap bevries de hersenen in methylbutanol gedurende 2 minuten bij - 80 °C.</li>
	<li>Bevestig het hersenweefsel op een metalen platform in een cryostaat van -20 °C.</li>
	<li>Snijd 50 μm dikke coronale secties met behulp van de cryostaat.</li>
	<li>Breng de hersenschijfjes met een fijne borstel over op glazen dia's.</li>
	<li>Monteer secties in 0,3 ml antivetmedium en dek af met 22 mm 50 mm afdeklips.</li>
	<li>Houd de glazen glazhouders in het donker bij kamertemperatuur droog.</li>
	<li>Beeld de beoogde neuronen met een confocale microscoop met behulp van Z-stack op basis van hersengebied grenzen en morfologische kenmerken van neuronen. OPMERKING: De gebruikte confocale microscoopinstellingen waren: vergroting van 60 X (A/1.4, olie) en een Z-vlakinterval van 0,15 μm (pinholegrootte 30 μm; teruggeprojecteerde pinholeradius 167 nm) met een golflengte van 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.

In dit protocol hebben we een EcoHIV-geïnduceerd HIV-infectiemodel bij ratten vastgesteld. In het bijzonder beschreven we een bilaterale stereotaxic injectie van EcoHIV in de cortex die met succes een actieve HIV-infectie in de rattenhersenen veroorzaakte 7 dagen na de injectie. Bovendien tonen we aan dat EcoHIV-infectie bij ratten een goed biologisch systeem kan zijn om belangrijke aspecten van HAND te bestuderen. Acht weken na de EcoHIV-infectie vertoonden ratten significante neurocognitieve stoornissen, waaronder de v...

Biologische systemen hebben ons begrip van hiv-1 geassocieerde neurocognitieve aandoeningen (HAND) en hun onderliggende neurale mechanismen verbeterd2. Het bepalen welk biologisch systeem het meest geschikt is voor een bepaalde studie is vaak afhankelijk van de kwestie van belang2. De beperking van het scala aan modellen van gastdieren daagt studies uit naar de ontwikkeling van hiv-1-ziekten. Om hiv-1 virale replicatie en pathogenese te onderzoeken, creëerden Potash et al.3 een muismodel van actieve HIV-1-infectie, waarbij het coderingsgebied van HIV-oppervlakte-envelopglycoproteïne, gp120, werd vervangen door ecotropische MLV gp80, wat leidde tot succesvolle virale replicatie bij muizen4. Na staartaderinjecties bij chimerische HIV (EcoHIV) muizen werden veel kenmerken waargenomen die lijken op die van HIV-1 seropositieve personen (bijv. geïnfecteerde lymfocyten en macrofagen, gericht op antivirale immuunresponsen, en ontsteking3,5,6).
Hoewel muizen en ratten beide lid zijn van de Muridae, kunnen fundamentele soortenverschillen hun geschiktheid voor specifieke experimentele vragenbeïnvloeden 7. Daarom zou de uitbreiding van het EcoHIV-infectiemodel tot ratten (vaak gebruikt in studies naar drugsmisbruik en neurocognitieve aandoeningen) voordelig zijn in de studie van neuroHIV. Hun grotere formaat maakt bijvoorbeeld de implantatie van de halskatheter voor zelftoedieningsprocedures van geneesmiddelen praktischer8. Zelftoedieningstechnieken voor geneesmiddelen bij ratten zijn gebruiktom de motivatie bij HIV-19 te evalueren . Bovendien werden veel neurocognitieve / gedragstaken aanvankelijk ontworpen voor ratten10. Hier rapporteren we het gebruik van stereotaxic injecties van EcoHIV bij ratten om het EcoHIV-infectiemodel uit te breiden en een belangrijke kans te bieden om nieuwe vragen met betrekking tot neuroHIV en HAND te beantwoorden.

<table><tbody><tr><td>293FT cellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic oplossing</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatin 75cm&sup2; Rechthoekige Cell Culture Flask met gekanteld hals en geventileerde dop</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM met L-Glutamine, 4,5 g/L Glucose en Sodium Pyruvaat</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>boor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus Antibacteriële, 4-0 Polyglactin 910 Naald, 27in. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfectie Reagens</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Iris Schaartjes</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Concentrator</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevofluraan</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>stereotaxisch apparaat</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Dia's</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schaartjes</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

een rattenmodel van ecohiv-herseninfectie

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Het is goed bestudeerd dat het ecoHIV geïnfecteerde muismodel van aanzienlijk nut is bij het onderzoeken van hiv-geassocieerde neurologische complicaties. De vaststelling van het ecoHIV-geïnfecteerde rattenmodel voor studies naar drugsmisbruik en neurocognitieve aandoeningen zou gunstig zijn bij de studie van neuroHIV- en HIV-1-geassocieerde neurocognitieve aandoeningen (HAND). In deze studie tonen we de succesvolle creatie van een rattenmodel van actieve hiv-infectie met chimeric HIV (EcoHIV). Ten eerste werd de lentivirale constructie van EcoHIV gedurende 48 uur verpakt in gekweekte cellen van 293 FT. Vervolgens werd het voorwaardelijke medium geconcentreerd en getiterd. Vervolgens voerden we bilaterale stereotaxic injecties uit van de EcoHIV-EGFP in F344/N rattenhersenweefsel. Een week na infectie werden EGFP-fluorescentiesignalen gedetecteerd in het geïnfecteerde hersenweefsel, wat aangeeft dat EcoHIV met succes een actieve HIV-infectie bij ratten induceert. Bovendien werd immunostaining uitgevoerd voor de microgliale celmarker, Iba1. De resultaten gaven aan dat microglia het overheersende celtype was dat EcoHIV herbergde. Bovendien vertoonden EcoHIV-ratten veranderingen in de temporele verwerking, een potentieel onderliggend neurobehavioral mechanisme van HAND en synaptische disfunctie acht weken na infectie. Gezamenlijk breidt de huidige studie het EcoHIV-model van HIV-1-infectie uit naar de rat die een waardevol biologisch systeem biedt om hiv-1 virale reservoirs in de hersenen te bestuderen, evenals HAND en bijbehorende comorbiditeiten zoals drugsmisbruik.

Het geconditioneerde medium werd verzameld uit lentivirus van EcoHIV-EGFP geïnfecteerde 293FT cellen. Vervolgens werd het geconcentreerd en getiterd, waarna stereotaxisch werd geïnjecteerd in de hersenen (corticale regio) van F344 / N-ratten. Zeven dagen na de injectie werden ratten opgeofferd en werden beelden genomen van coronale hersenschijfjes variërend van bregma 5,64 mm tot bregma -4,68 mm. In figuur 1Azijn er significante EcoHIV-EGFP-signalen in de hersenen, vooral in de cortex en de ...

Hier presenteren we een protocol om een nieuw rattenmodel van actieve hiv-infectie met chimerische hiv (EcoHIV) vast te stellen, wat van cruciaal belang is voor het verbeteren van ons begrip van hiv-1 virale reservoirs in de hersenen en het aanbieden van een systeem om hiv-geassocieerde neurocognitieve aandoeningen en bijbehorende comorbiditeiten (d.w.z. drugsmisbruik) te bestuderen.

Een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Met behulp van ratten kan dit protocol worden gebruikt om een nieuw model van actieve hiv-infectie met chimerische hiv vast te stellen. met ratten kan de vaststelling van het EcoHIV-infectiemodel voor studies naar drugsmisbruik en neurocognitieve aandoeningen gunstig zijn voor de studie van neuro-hiv en hiv-1 geassocieerde neurocognitieve aandoeningen. De demonstratieprocedure is Hailong Li, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium.Voor het verpakken van het virus in 293 T-cellen, zaad vijf keer 10 tot de vijfde 293 T-cellen per milliliter DMEM aangevuld met 10% FBS in elk van de twee met gelatine bedekte kolven van 75 vierkante centimeter en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius totdat de culturen 50% samenvloeiing bereiken. Verdun op de dag van de transfectie 22,5 microliter transfectiereagens in 750 microliter medium per kolf in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en draai de oplossing gedurende drie seconden. Verdun 20 microgram van het chimerische EcoHIV plasmide DNA in 750 microliter medium in een tweede microcentrifugebuis van 1,5 milliliter per kolf met grondige menging.Combineer het verdunde DNA met het verdunde transfectiereagens met een zachte menging en incubeer de resulterende oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie elke virussuspensie toe aan 10 milliliter dmem-medium vóórwarm en voeg elke virusoplossing toe aan één kolf van 293 T-cellen. Na twee dagen celkweek, pool het supernatant uit de kolven in een enkele 50 milliliter conische buis voor centrifugeren en breng het geklaarde supernatant over naar een nieuwe buis van 50 milliliter.Voeg acht milliliter Lenti-X Concentrator toe aan het geklaarde supernatant en meng met zachte inversie. Na een incubatie van twee dagen bij vier graden Celsius, centrifugeer het mengsel en verwijder voorzichtig het supernatant, resuspend de pellet vervolgens voorzichtig met 100 microliter van 100 millimolar PBS en gebruik een P24 ELISA-kit om de virusconcentratie te titeren. Voor EcoHIV-EGFP-injectie, na het bevestigen van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, scheert u het haar uit het hersengebied en steriliseert u de blootgestelde huid twee keer met 70% ethanol en een scrub op basis van chloorhexidine.Zet de rat in een gevoelige positie in een stereotaxisch apparaat en maak een incisie van vijf tot zes centimeter door de huid langs de hoofdhuidmiddenlijn. Markeer één boorpositie op 0,8 millimeter zijdelings en één 1,2 millimeter rostral naar bregma en boor een gat met een diameter van 0,4 millimeter bij elke schedelpositie. Laad 1,04 maal 10 tot de zesde transductie-eenheden per milliliter getiterde EcoHIV Lentivirus-oplossing in een injectiespuit met 10 microliter en bevestig de spuit aan het stereotaxic-apparaat.Beweeg de naald dicht bij het oppervlak van één boorgat en steek de naald 2,5 milliliter in het gat. Infuseer één microliter virusoplossing met een snelheid van 0,2 microliter virus per minuut. Wanneer al het virus is geïnjecteerd, laat u de naald vijf minuten in het injectiegebied staan voordat u de naald langzaam terugtrekt totdat deze zich buiten de schedel van de rat bevindt.Sluit de huidincisie met een 4-0 zijden draad hechtdraad en steriliseer de oplossing met 70% ethanol en plaats de rat vervolgens in een herstelkamer met een verwarmingskussen met bewaking tot ligfiets. Een tot acht weken na virale infusie, na het bevestigen van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, fixeer de rat in een liggende positie in een zuurkast en inciseer de huid langs de thoracale middellijn. Snijd het membraan om de borstholte te openen en steek een naald van 20 bij 25 millimeter in de linkerventrikel.Open onmiddellijk het rechter atrium met een schaar en doordrenkt 50 milliliter voorgekoelde 100 millimolar PBS met een debiet van vijf milliliter per minuut. Wanneer alle PBS is geleverd, perfuseren met 100 milliliter koude 4%paraformaldehyde. Wanneer al het fixatief is geleverd, verwijdert u de hersenen uit de schedel en bevestigt u het weefsel 's nachts in verse 4%paraformaldehyde.Plaats het monster de volgende ochtend in 40 milliliter 30% sacharose in 100 millimol PBS in een buis van 50 milliliter gedurende ongeveer drie dagen totdat de hersenen zich op de bodem van de buis nestelen voordat het hersenweefsel twee minuten in methyl butanol wordt bevroren bij min 80 graden Celsius. Gebruik na het invriezen een minus 20 graden Celsius cryostaat en een fijne kwast om 50 micron dikke coronale secties te verkrijgen. Wanneer alle secties zijn verkregen, dek de monsters af met 300 microliter anti-fade medium en monteer ze met 22 coverslips van 50 milliliter.Wanneer het medium is opgedroogd, beeldt u de secties in door confocale microscopie. Zeven dagen na lentivirus injectie, rat coronale hersenen slice beelden onthullen een significante aanwezigheid van EcoHIV-EGFP signalen in het hersenweefsel, vooral in de cortex en de hippocampale dentate gyrus. Dubbele etikettering met en Iba1- en EcoHIV-EGFP-sondes leveren sterk bewijs dat microglia het overheersende celtype zijn dat EcoHIV-expressie in de hersenen herbergt.Acht weken na infectie vertonen ecoHIV geïnjecteerde dieren een relatieve ongevoeligheid voor de manipulatie van het interstimulusinterval, zoals blijkt uit een relatief vlakkere intervalfunctie in vergelijking met zoutoplossingscontroles. Bovendien vertonen ecoHIV geïnjecteerde ratten diepgaande veranderingen in hun dendritische wervelkolommorfologie, zoals blijkt uit een verhoogde relatieve frequentie van kortere dendritische stekels met verhoogde hoofd- en nekdiameters ten opzichte van controledieren. De concentratie en titratie van het conditiemedium vóór stereotaxic injectie is van cruciaal belang om de consistente en reproduceerbare resultaten in experimenten te garanderen.Deze specifieke regionale stereotaxic injectie van EcoHIV zorgt voor een efficiënte HIV-infectie in de hersenen en produceert tijdelijke verwerkingstekorten bij ratten. Het gebruik van stereotaxic HIV-injecties bij ratten om het EcoHIV-infectiemodel uit te breiden, biedt een belangrijke kans om nieuwe vragen met betrekking tot neuro-hiv bij de hand te beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De postnatale rat model voor hypoxisch-ischemische hersenschade is een goed uitgewerkt model van de menselijke neonatale hypoxische ischemische encefalopathie (HIE). In dit artikel beschrijven we het model van HIE in post-natale rattenjongen.

De hypoxische ischemische encefalopathie Model van de Perinatale ischemie

This video demonstrates the procedure of injecting chimeric HIV viruses into the cortex of a rat's brain, where the virus RNA integrates into the host genome, replicates, and spreads to establish an active HIV infection in the experimental model.

Establishing an Active HIV Infection in a Rat Model

Encephalopathie van prematuriteit omvat de afwijkingen van het centrale zenuwstelsel die geassocieerd zijn met letsel door vroeggeboorte. Dit rapport beschrijft een klinisch relevante rattenmodel van in utero tijdelijke systemische hypoxie-ischemie en intra-amniotische lipopolysaccharide toediening (LPS) die chorioamnionitis nabootst, en de gerelateerde impact van infectieuze stimuli en placentale ondervoeding op de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel.

Modellering Encephalopathie van Prematurity gebruik van prenatale hypoxie-ischemie met Intra-vruchtwater Lipopolysaccharide bij ratten

Het hier gepresenteerde protocol maakt de reproductie mogelijk van een wijdverspreide demyelinatie van grijze stof van beide corticale hemisferen bij volwassen mannelijke Dark Agouti-ratten. De methode bestaat uit intracerebrale implantatie van een katheter, subklinische immunisatie tegen myeline oligodendrocyt glycoproteïne en intracerebrale injectie van een pro-inflammatoir cytokinemengsel via de geïmplanteerde katheter.

Rat model van wijdverspreide cerebrale corticale demyelinatie geïnduceerd door een intracerebrale injectie van pro-inflammatoire cytokinen

Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een immunocompetente ICR (Institute of Cancer Research) Murine model van infectie van het centrale zenuwstelsel om de ontwikkeling van neuropathie weer te geven. Monitoring van acute virale encefalitische stoornissen door identieke ziekte scores kan worden uitgevoerd voor het tonen van Denguevirus-geïnduceerde neuropathie in vivo.

Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte

Het doel van deze studie is het vaststellen en valideren van een diermodel voor onderzoek in de herstel-en sequela stadia van hersen ischemie door het testen van herseninfarct en sensorimotorische functie na de middelste cerebrale slagader occlusion/reperfusie (MCAO/R) na 1-90 dagen bij ratten.

Een preklinisch model om hersen herstel na acute beroerte bij ratten te beoordelen

Hier presenteren we een hydrofobe weefselontruimingsmethode die het mogelijk maakt om doelmoleculen te bekijken als onderdeel van intacte hersenstructuren. Deze techniek is nu gevalideerd voor F344/N-bestrijding en HIV-1 transgene ratten van beide geslachten.

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Posthemorragische hydrocefalie van prematuriteit (PHHP) kan worden gemodelleerd bij neonatale ratten door chorioamnionitis en intraventriculaire bloeding te combineren. De combinatie van deze prenatale en postnatale gebeurtenissen vat nauwkeurig de klinische kenmerken van PHHP samen, waaronder macrocefalie, ventriculomegalie en verhoogde intracraniale druk, gedurende de hele levensduur.

Modellering van posthemorragische hydrocefalie van prematuriteit bij ratten

Dit protocol beschrijft hoe de combinatie van EcoHIV-infectie met Tmem119-EGFP-muizen een waardevol biologisch systeem biedt voor het onderzoeken van microgliale veranderingen en virale reservoirs in knaagdiermodellen van HIV-geassocieerde neurocognitieve stoornissen.

Identificatie van EcoHIV-geïnfecteerde cellen in microglia-gemanipuleerde transgene muizen

Dit artikel presenteert een protocol voor de inductie van een uniek rattenmodel van bipolaire stoornis dat zowel manie-achtig als depressief-achtig gedrag vastlegt.

Het ontwikkelen van een rattenmodel voor bipolaire stoornis

Leer een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie voor neuroHIV-onderzoek met stereotaxische injectie. Dit model maakt gedetailleerde studies van HIV-gerelateerde neurocognitieve stoornissen en comorbiditeit mogelijk.

Een rattenmodel van EcoHIV-herseninfectie

Meer video's verkennen