Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Deze methode biedt oplossingen voor de veeleisende biologische vragen van vandaag. Vanuit een in-cell FPOP-experiment kunnen we eiwit-ligandinteracties, eiwit-eiwitinteractieplaatsen en regio's van conformationele verandering bestuderen. Het voordeel van deze technologie is het gebruik van een geautomatiseerd zes-put plaat-gebaseerd IC-FPOP platform dat het mogelijk maakt om cellen te laten groeien en in-cell FPOP studies uit te voeren direct aan de laser.

Deze methode kan worden gebruikt in de farmaceutische en biotech-industrie, evenals grote academische en klinische onderzoeksinstituten, vooral door biologische onderzoekers aan universiteiten die eiwitdynamica bestuderen. Om te beginnen schroeft u de platformincubator los van de positioneringsfase en koppelt u de temperatuur-, gas- en luchtbevochtigerlijnen los. Besproei de incubator met 70% ethanol en plaats deze in de celkweekkap.

Verwijder de zes-put plaat uit de platform incubator, zet het originele deksel van de plaat vast en bevestig de samenvloeiing van de cellen met behulp van een microscoop, plaats vervolgens de zes-put plaat met samenvloeiende cellen terug in de platform incubator in de cel cultuur kap. Plaats drie voorgesneden Tygon-buizen in elke put via de ingebedde poorten door de buizen naar de putwanden te spoelen en ze vast te zetten met aangepaste 3D-geprinte ringen. Bereid een integratiesoftwarescript voor pomponttrekking voor.

Gebruik één peristaltische pomp om celmedia volledig uit alle zes putten te verwijderen. Priemmiddelen in elk kanaal van de andere drie peristaltische pompen, gieten vervolgens waterstofperoxide en Quench-buffer in hun respectieve wisselbuizen totdat de reagentia de incubatorpoorten bereiken. Controleer of de laserstraal correct is gehoekt en de incubator onbevangen bereikt.

Controleer de laserenergie met behulp van een externe sensor. Bereid het script van de integratiesoftware voor pompinfusie voor na het bevestigen van de uitlijning van de straal. Giet 200 millimolre waterstofperoxide met 35 milliliter per minuut in de eerste put.

Druk op de startknop van de lasersoftware bij de markering van vijf seconden om de puls te activeren bij de 11-secondenmarkering op de timer. Giet 125 millimolar Quench-oplossing met 35 milliliter per minuut in de eerste put direct na de laserpuls. Verplaats handmatig de positioneringsfase om de volgende put uit te lijnen met de laserstraal en herhaal het proces voor alle putten.

Gebruik in een celkweekkap een celschraper om de cellen van elke put over te brengen in individuele conische buizen van 15 milliliter. Centrifugeer cellen op 1, 200 keer G gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 100 microliters RIPA-lysisbuffer.

Breng cellen over op individuele polypropyleen buizen van 1,2 milliliter. Vries alle monsters in vloeibare stikstof in en plaats ze in een min 80 graden vriezer tot gebruik. Om FPOP-modificaties te lokaliseren, analyseert u het verteerd cellysaat met behulp van vloeistofchromatografie tandemmassaspectrometrieanalyse en berekent u vervolgens de mate van modificatie.

Om te bevestigen dat de platform incubator condities voldoende zijn voor celkweek op het laserplatform, werd GCaMP2 tijdelijk getransfecteerd in HEK293T en werd de transfectie-efficiëntie voor beide platen beoordeeld via fluorescentiebeeldvorming. Een luciferasetest werd uitgevoerd om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren. FPOP-modificaties in HEK293T-cellen met het label in het flowsysteem werden vergeleken met die in de platformincubator.

De platform incubator presteerde beter dan het flowsysteem, zowel in het aantal gemodificeerde eiwitten als in de totale FPOP-dekking in die eiwitten. In het stromingssysteem werden twee gemodificeerde peptiden gedetecteerd, die beperkte structurele informatie verstrekten. Echter, vijf gemodificeerde peptiden over de actine volgorde werden gedetecteerd in het platform incubator.

Tandem MS spectra van actine met gemodificeerde proline in beide systemen en ongewijzigd actine peptide worden hier getoond. De gewijzigde FPOP-residuen in de incubatormonsters van het platform bevatten 12 gewijzigde residuen, drie gewijzigde residuen in het stroomsysteem en één overlappend gemodificeerd residu. LC-MS MS-analyse toonde aan dat 792 eiwitten werden gewijzigd door in vivo FPOP in de platformincubator in vergelijking met de 545 eiwitten die met het stroomsysteem waren aangepast.

Het is noodzakelijk om cellen onder steriele omstandigheden te houden. Breng de platformincubator altijd in de steriele celkweekkap om alle benodigde zesputplaten, slangen en ringen in te voegen. Dit zorgt voor de integriteit van het experiment.