Name: Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Leer alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila melanogaster met CRISPR/CasRx. Deze methode maakt efficiënte transcriptreductie mogelijk met fenotypische en moleculaire evaluatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van een DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) en NIH-awards (R21RAI149161A, DP2AI152071) toegekend aan O.S.A.

<ol><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Communications%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nat Communications. 9, 1911(2018).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), 5573(2016).</li>
<li>East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Targeting+by+Functionally+Orthogonal+Type+VI-A+CRISPR-Cas+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes.</a> Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).</li>
<li>Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+Engineering+with+RNA-Targeting+Type+VI-D+CRISPR+Effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.</a> Cell. 173 (3), 665-676 (2018).</li>
<li>Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+Targeting+Using+CasRx+in+Flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies.</a> The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+Induces+Efficient+mRNA+Knockdown+in+Animal+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> Nature. 550, 280-284 (2017).</li>
<li>Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNAi%3A+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo RNAi: today and tomorrow.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640(2010).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature Methods. 8, 405-407 (2011).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+and+parameters+for+targeted+transgenic+RNA+interference+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster.</a> Nature Methods. 5, 49-51 (2008).</li>
<li>Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+%28RNAi%29+Screening+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila.</a> Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+off-target+effects+associated+with+long+dsRNAs+in+Drosophila+melanogaster+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays.</a> Nature Methods. 3, 833-838 (2006).</li>
<li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li>
<li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+arising%3A+off-targets+and+genome-scale+RNAi+screens+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila.</a> Fly. 1 (1), 1-5 (2007).</li>
<li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).</li>
<li>Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheating+evolution%3A+engineering+gene+drives+to+manipulate+the+fate+of+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations.</a> Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103(2020).</li>
<li>Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-mediated+suppression+of+dengue+viruses+in+the+salivary+glands+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).</li>
<li>Franz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).</li>
<li>Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+miRNAs+induce+dual+arboviral-resistance+phenotypes+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> Communications Biology. 1, 11(2018).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li>
<li>Addgene. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/">https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/</a> (2020).</li>
<li>Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Addgene. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr/">https://www.addgene.org/protocols/pcr/</a> (2020).</li>
<li>Indiana University Bloomington. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL</a> (2020).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3Aultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).</li>
<li>Poe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+CRISPR%2FCas9-Mediated+Tissue-Specific+mutagenesis+reveals+gene+redundancy+and+perdurance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila.</a> Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).</li>
<li>Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+ger+mLine+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li>
<li>Yang, S., Li, S., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+the+Half-Life+of+Cas9+maintains+its+gene+editing+ability+and+reduces+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity.</a> Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).</li>
<li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> eLife. 9, 53865(2020).</li>
<li>Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+Effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264(2015).</li>
<li>Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolkit+for+CRISPR-Cas13-based+RNA+manipulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila.</a> Genome Biology. 21, 279(2020).</li>
</ol>

O.S.A. is een van de oprichters van Agragene, Inc., heeft een aandelenbelang en is lid van de wetenschappelijke adviesraad van het bedrijf. De voorwaarden van deze regeling zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Universiteit van Californië, San Diego in overeenstemming met haar beleid inzake belangenconflicten. Alle andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Met drie verschillende toepassingsontwerpen van het CasRx-systeem demonstreerde dit werk in vivoprogrammeerbare RNA-targeting in vliegen. De verschillende strategieën komen tegemoet aan verschillende projectbehoeften, zoals endogene versus exogene gentargeting en alomtegenwoordige versus weefselspecifieke RNA-targeting. De effecten van RNA-targeting omvatten doelgenspecifieke fenotypische veranderingen, doel-RNA-transcriptreductie en incidentele letaliteitsfenotypen geassocieerd met hoge expressie van CasRx-eiwit en collaterale activiteit. Over het algemeen toonden deze resultaten aan dat het CasRx-systeem in staat is om op een programmeerbare en efficiënte manier RNA-transcriptreductie op organismeniveau te targeten.
Een van de belangrijkste factoren bij het succesvol aanpassen van het CasRx-systeem is het ontwerp van gRNA's. In het bijzonder moet het volgende advies in acht worden genomen: de doelsequentie is ongeveer 30 nucleotiden lang, de lengte van poly-U-rekken in de doelsequentie is 4 basenparen of minder, het doelsequentie GC-gehalte ligt in het bereik van 30% - 70%, de doelsequentie zal naar verwachting geen sterke RNA-haarspeldstructuren vormen en de doelsequentie bevat een minimale voorspelde secundaire of tertiaire structuur van RNA5.
Naast de gRNA-ontwerpen is de vlieggeneticastap in elk protocol ook van cruciaal belang voor een succesvolle implementatie. De aanwezigheid of het ontbreken van de gedefinieerde fenotypen die van de ouders in de nakomelingen zijn doorgegeven, zijn belangrijk voor het identificeren en kwantificeren van fenotypen geïnduceerd door het CasRx-systeem in de transheterozygote nakomelingen. Ook het parallel opzetten van controlekruisen met behulp van de dCasRx-vliegen is ook nuttig bij het uitsluiten van niet-specifieke fenotypen in de transheterozygote nakomelingen.
Het is vermeldenswaard dat deze resultaten toxiciteitsprobleem onthulden dat werd geïntroduceerd door alomtegenwoordig CasRx- en dCasRx-eiwit in de vlieg tot expressie te brengen, een beperking van het CasRx-systeem. Alomtegenwoordige expressie van CasRx of dCasRx onder de Ubiq-promotor alleen, zonder gRNA's, kwam met niet-triviale fitnesskosten, omdat noch Ubiq-CasRx noch Ubiq-dCasRx-vliegen konden worden vastgesteld als homozygote lijnen. Integendeel, UASt-CasRx- en UASt-dCasRx-vliegen kunnen worden vastgesteld als gezonde homozygote bestanden, hoewel ze vanwege het ontwerp van het kruisschema werden gehouden als dubbel uitgebalanceerde bestanden, een feit dat het bestaan van toxiciteit ondersteunt die wordt geïnduceerd door alomtegenwoordige CasRx-eiwitexpressie. Een ander bewijsstuk is dat in controle-experimenten met dCasRx, dat katalytisch inactief is, de percentages vliegen die zowel dCasRx- als gRNA-constructies dragen van het totale aantal vliegen in de F1-generatie consistent lager waren dan 50%, de verhouding die werd verwacht op basis van Mendeliaanse genetica als er geen dCasRx-geassocieerde toxiciteit aanwezig was. Dit gaf aan dat het alomtegenwoordig tot expressie brengen van dCasRx, samen met gRNA's, toxiciteit in de vlieg induceert, wat resulteert in een minder dan verwachte overervingsverhouding. De overervingsverhoudingen van transheterozygote UASt-dCasRx, gRNA, GAL4-vliegen volgden de Mendeliaanse genetica, wat opnieuw de toxiciteit suggereert die specifiek wordt geïnduceerd door alomtegenwoordige expressie van CasRx- en dCasRx-eiwitten. Toxiciteit in CRISPR/Cas-systeem is niet nieuw. Van grote hoeveelheden Cas9-eiwit is aangetoond dat ze giftig zijn in verschillende organismen, waaronder vliegen29,30,31,32. Een recente studie heeft een aangepast GAL4 / UAS-systeem ontwikkeld dat de hoeveelheid Cas9-eiwit uitgedrukt in vliegen kan afstemmen door een open leesframe van verschillende lengte toe te voegen tussen de UAS-sequentie en de Cas9-sequentie in de UAS-Cas9-construct33. Daarom is het de moeite waard om manieren te onderzoeken om casrx-geïnduceerde toxiciteit te verminderen door het casrx-eiwitexpressieniveau af te stemmen.
Afgezien van de toxiciteit geïnduceerd door alomtegenwoordige expressie van CasRx- en dCasRx-eiwitten, toonden de resultaten ook dodelijkheid gekoppeld aan de niet-specifieke collaterale off-target effecten van het CasRx-systeem, een kenmerk van veel CRISPR-systemen1,2,7,34. In sommige van de CasRx en niet-essentiële gen gRNA-tot expressie brengende dubbele of drievoudige transheterozygote vliegen, bijvoorbeeld bij het richten op Notch, hebben de transheterozygote CasRx-vliegen aanzienlijk lagere overlevingskansen in vergelijking met de transheterozgyous dCasRx-vliegen. In de RNA-seq-analyse van deze CasRx- en gRNA-tot expressie brengende transheterozygote vliegen werden zowel de verlaging van de transcriptieniveaus van het doelgen als de vermindering van niet-doelgentranscripten waargenomen. Deze neveneffecten waren CasRx-afhankelijk en doelafhankelijk, omdat ze alleen werden waargenomen bij transheterozygote vliegen die zowel het CasRx-eiwit als het gRNA tot expressie brachten. Het is de moeite waard erop te wijzen dat een van de doelgenen, wit, slechts een beperkte, niet-statistisch significante vermindering van transcripten vertoonde wanneer het witte gen werd aangevallen door CasRx, wat in tegenstelling was tot het duidelijke pigmentreductiefenotype. Er wordt verondersteld dat dit te wijten kan zijn aan het feit dat 1) de timing van de RNA-seq-monsterverzameling niet goed was afgestemd op de timing wanneer het witte gen zijn piekexpressie bereikte tijdens de vroege ontwikkeling, en 2) de gelokaliseerde expressie van het witte gen in de ogen het een uitdaging maakt om de relevante weefsels te verzamelen tijdens de vroege ontwikkelingsfase wanneer alleen het verzamelen van monsters van het hele lichaam haalbaar is. Om de nevenactiviteit in het CasRx-systeem te verminderen, zijn toekomstige studies nodig om de mechanismen die ten grondslag liggen aan het off-target fenomeensysteem op organismaal niveau volledig te begrijpen.
Interessant is dat een recente studie35 die RNA-targeting Cas13-tools bij vliegen beschreef, om verschillende mogelijke redenen de algemene toxiciteit geassocieerd met CasRx-expressie leek te verbeteren. Ten eerste hercodeerden de auteurs de Cas13-transgenen om de expressie in Drosophila te optimaliseren en gebruikten ze een zwakker tot expressie brengende promotor (actine 5C) in vergelijking met de ubiquitinepromotor die in de huidige studie werd gebruikt, wat waarschijnlijk leidde tot lagere niveaus van Cas13-expressie en dus minder toxiciteit. Dit wordt inderdaad ondersteund door de observaties dat UASt-gedreven CasRx- en dCasRx-expressie op zichzelf niet giftig was, omdat deze studie (en de auteurs in 35) geen duidelijke dodelijkheid in UASt-CasRx-vliegen waarnam. Bovendien codeerden deze auteurs hun gRNA's anders in vergelijking met deze studie, wat hun expressie kan hebben beïnvloed en de toxiciteit van het systeem in transheterozygote Cas13 / gRNA-vliegen kan hebben verminderd. In hun studie werden bijvoorbeeld twee gRNA's tot expressie gebracht met behulp van de U6: 3-promotor en geflankeerd door tRNA-verwerking bij tRNA-rijping zonder CasRx35. Omgekeerd werden in deze studie de gRNA's gecodeerd als arrays gericht op maximaal 4 locaties per gen en het nabootsen van de endogene Cas13-arraystructuur in bacteriën, waarvoor het Cas13-enzym nodig is om elk gRNA te verwerken. Deze verschillende benaderingen kunnen hebben geleid tot verschillen in gRNA-expressieniveaus en andere factoren die inherente effecten kunnen hebben op de toxiciteit van het hele systeem. Ten slotte richtten Huynh et al. zich op andere genen dan die waarop de huidige studie was gericht, die resulteren in verschillen in target-Cas / gRNA-interactie en collaterale activiteit en effecten kunnen hebben op de waargenomen niveaus van letaliteit. Deze verschillen in waargenomen toxiciteit rechtvaardigen verder onderzoek om manieren te vinden waarop de algehele systemen kunnen worden verbeterd.
Over het algemeen is deze studie de eerste demonstratie van een functioneel genetisch gecodeerd programmeerbaar RNA-targeting Cas-systeem in D. melanogaster, hoewel verdere optimalisatie van het CasRx-systeem (in overeenstemming met wat wordt gemeld35) nodig zal zijn om de off-target-geassocieerde letaliteit verder te verminderen en de werkzaamheid van CasRx on-target splitsing te verhogen. RNA-targeting met Cas-enzymen is een snel evoluerend veld met veel potentiële toepassingen, variërend van insectenvectorcontrole tot therapeutisch gebruik1,2,3,4,5,6,7, en dit protocol biedt een startpakket voor iedereen die geïnteresseerd is in het ontwerpen van hun eerste CasRx-systeem in vliegen, terwijl het compatibel is met maatwerk en verdere optimalisatie van het systeem. De hier gepresenteerde voorbeelden tonen een reeks resultaten die men kan tegenkomen tijdens de implementatie van dit systeem in vivo en kunnen dienen als benchmarks voor andere gebruikers bij het evalueren van de prestaties van het CasRx-systeem in hun toepassingen.

Sinds de komst van Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) technologieën, is veel van de focus op dit gebied gericht op DNA-bewerking, die transformatieve toepassingen biedt in de geneeskunde en biotechnologie1. Permanente verandering van DNA-sequenties is echter niet altijd gewenst vanwege ethische overwegingen. In het licht hiervan begonnen recente studies met het ontwikkelen van CRISPR-gebaseerde hulpmiddelen voor het richten van RNA en toonden aan dat CRISPR-technologieën inderdaad kunnen worden gebruikt voor RNA-targeting in een verscheidenheid aan biologische systemen2,3,4,5,6,7. In veel van deze geteste systemen is de huidige veelgebruikte aanpak voor het richten op RNA en transcriptreductie RNA-interferentie (RNAi), die verre van perfect is en vaak een gevarieerde werkzaamheid en hoge off-target activiteit vertoont bij gebruik in vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Daarom is het, gezien de status van deze technologieën, de moeite waard om de mogelijkheden van CRISPR-gebaseerde tools voor RNA-targeting verder te onderzoeken.
Een opmerkelijke recente studie meldde dat ribonuclease CasRx, een lid van de Cas13d-klasse, de gentranscriptieniveaus in menselijke celkweek efficiënt kan verlagen en een aantrekkelijk off-target profiel heeft4. Deze bevinding leidde tot de vraag of dit nieuwe ribonuclease zijn werkzaamheid en lage off-target rate voor RNA-targeting op organismeniveau kan behouden. Een recente studie beantwoordde deze vraag door aan te tonen dat het CasRx-systeem kan worden gebruikt om alomtegenwoordige en weefselspecifieke gentranscriptreductie in Drosophila melanogaster5 te bereiken.
Om de bruikbaarheid van deze onlangs gepubliceerde aanpak te stroomlijnen, beschrijft dit protocol de methoden uit dit recente werk, dat bestaat uit drie hoofdonderdelen: 1) alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem; 2) alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem; en 3) weefselspecifiekin vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem.
Gids-RNA's (gRNA) gericht op verschillende doelgenen onder controle van een alomtegenwoordige promotor werden ontworpen en vlieglijnen die deze gRNA-bevattende constructies tot expressie brengen, werden gegenereerd. CasRx-constructies onder controle van een alomtegenwoordige promotor of een voorwaardelijke upstream activation sequence (UASt) promotor die kan worden geactiveerd door de GAL4-transcriptiefactor, werden ook ontworpen en vliegen lijnen die deze CasRx-bevattende constructies bevatten gegenereerd. Katalytisch inactieve CasRx-constructies, dCasRx, werden ontworpen en gebruikt als negatieve controles. Alomtegenwoordige RNA-targeting in vliegen wordt bereikt door gRNA-tot expressie brengende vlieglijnen te kruisen met alomtegenwoordige CasRx-uitdrukkende vlieglijnen. Het nageslacht dat zowel het gRNA-construct tot expressie brengt dat zich richt op een specifiek gentranscript als het CasRx-eiwit, heeft een alomtegenwoordige reductie van gerichte gentranscripten. Weefselspecifieke RNA-targeting in vliegen wordt bereikt door eerst gRNA-tot expressie brengende vliegen te kruisen met UASt-CasRx die vliegen tot expressie brengt, waarbij transheterozygote vliegen worden verkregen die zowel gRNA- als UASt-CasRx-constructies dragen. Dergelijke vliegen worden op hun beurt gekruist met weefselspecifieke GAL4-tot expressie brengende vliegen, wat resulteert in het genereren van weefselspecifieke CasRx-expressie en RNA-targeting bij vliegen.
De programmeerbare aard van het CasRx-systeem biedt de mogelijkheid van aanpassing en optimalisatie om een hoge werkzaamheid en lage off-target activiteit te bereiken voor in vivo RNA-targeting. Potentiële toepassingen van CRISPR-gebaseerde RNA-targeting zijn talrijk, waaronder het vervangen van RNAi in het laboratorium en het bijdragen aan insectenvectorcontrole in het wild. Van de laatste is een van de wereldwijde onvervulde behoeften de ontwikkeling van efficiënte hulpmiddelen om infecties van RNA-virussen die via muggen worden overgedragen, te bestrijden. Veel RNA-virussen, zoals dengue, Zika en chikungunya-virus, worden overgedragen via muggen, waardoor de menselijke gezondheid wordt beïnvloed en sterfte wordt bijgedragen. Er zijn veel voorstellen gedaan voor het engineeren van muggenpopulaties met virusresistentie voor ziektepreventie; geen enkele huidige technologie is echter in staat om muggen tegelijkertijd resistent te maken tegen alle belangrijke RNA-virussen18,19,20,21,22,23. RNA-targeting Cas-systemen kunnen een startpunt bieden voor een dergelijke technologie door een programmeerbaar platform mogelijk te maken voor het richten op alle door muggen overgedragen RNA-virussen.

<table><tbody><tr><td>100% Grape Juice</td><td>Welch Foods Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Active Dry Yeast (908g)</td><td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DMC4500 color camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 20/20 Luminometer</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 Sequencer</td><td>Illumina, Inc.</td><td>HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC fluorescent stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>E7770</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 112686</td><td>Addgene</td><td>112686</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 112688</td><td>Addgene</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132416</td><td>Addgene</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132417</td><td>Addgene</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132419</td><td>Addgene</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132420</td><td>Addgene</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132421</td><td>Addgene</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132422</td><td>Addgene</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>plasmid # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>plasmid #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>plasmid pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases NotI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases PacI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases PstI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases SwaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>Restriction endonucleases XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-Fluc flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84986</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-N flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84122</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-w flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-y flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84123</td><td></td></tr><tr><td>UASt-CasRx flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kits</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

alomtegenwoordige en weefselspecifieke rna-targeting in drosophila melanogaster met crispr/casrx

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, een lid van de RNA-targeting Cas13-familie, is een veelbelovende nieuwe toevoeging van de CRISPR / Cas-technologieën in efficiënte gentranscriptreductie met een aantrekkelijk off-target profiel op zowel cellulair als organismaal niveau. Onlangs is gemeld dat het CRISPR /CasRx-systeem kan worden gebruikt om alomtegenwoordige en weefselspecifieke gentranscriptreductie in Drosophila melanogaster te bereiken. Dit artikel beschrijft de methoden uit het recente werk, bestaande uit drie delen: 1) alomtegenwoordige in vivo endogene RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem; 2) alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem; en 3) weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem. De effecten van waargenomen RNA-targeting omvatten gerichte genspecifieke fenotypische veranderingen, gerichte RNA-transcriptreductie en incidentele letaliteitsfenotypen geassocieerd met hoge expressie van CasRx-eiwit en collaterale activiteit. Over het algemeen toonden deze resultaten aan dat het CasRx-systeem in staat is om op een programmeerbare en efficiënte manier RNA-transcriptreductie op organismeniveau te targeten, wat aantoont dat in vivo transcriptoomtargeting en engineering haalbaar is en de basis legt voor toekomstige in vivo CRISPR-gebaseerde RNA-targetingtechnologieën.

Alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem De F1 transheterozygote vliegen die zowel de Ubiq-CasRx als het gRNA tot expressie brengen (gericht op zowel endogene als exogene genen) constructen vertoonden duidelijke fenotypes in vergelijking met de controlevliegen die de Ubiq-dCasRx- en gRNA-constructen tot expressie brachten (figuur 2 en figuur 4). In het bijzonder hebben de transheterozygote CasRx-vliegen een significant lagere overlevingskans in vergelijking met de transheterozgyous dCasRx-vliegen, wat wijst op toxiciteit van het Ubiq-CasRx-systeem (figuur 2A en figuur 4A). Het is vermeldenswaard dat zowel transheterozygote CasRx- als dCasRx-vliegen minder dan 50% overervingspercentage hebben, wat de verwachte verhouding is op basis van Mendeliaanse genetica. Van de drie doelgenen is de Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ vliegen en Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ vliegen zijn niet levensvatbaar (0% overerving) en groeiden niet verder dan het tweede stadium van de instarlarven (figuur 2A-2B). De overlevende Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ vliegen, waarvan de overerving 12,9% was, vertoonden een duidelijk volledig penetrant witogig fenotype (figuur 2B). Naast waarneembare eigenschappen geassocieerd met CasRx, konden we een significante vermindering van doelgenranscripten bevestigen voor 3 doelgenen: Notch, geel en GFP (figuur 2E-2G). Reductie van witte gentranscripten werd waargenomen bij Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ vliegen, vergeleken met de controle Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ vliegen, hoewel de reductie niet statistisch significant was (Figuur 2E - 2F). Bewijs van off-target activiteit geïnduceerd door CasRx werd gevonden bij het vergelijken van de differentieel uitgedrukte transcripten tussen monsters van CasRx-tot expressie brengende vliegen en monsters van dCasRx-tot expressie brengende vliegen (Figuur 2E, 2G). Het aantal niet-doeltranscripten dat significant differentieel wordt uitgedrukt, is als volgt: wit, 253 (1,4% van de totale transcripties); Inkeping, 300 (1,7%); geel, 41 (0.23%); GFP, 5.880 (33%) (Figuur2G). Van de in totaal 17.779 verschillende transcripten werden 6 niet-doeltranscripten significant differentieel uitgedrukt in alle 4 groepen monsters. Een van de 6 geïdentificeerde transcripten was Gadd45, een gen dat betrokken is bij apoptose en cellulaire arrestatie bij vliegen, waardoor de mogelijkheid ontstaat dat de enzymatische werking van CasRx direct cellulaire apoptose kan veroorzaken of indirect verkeerde expressie van andere genen kan veroorzaken, wat op zijn beurt leidt tot apoptose. Ten slotte is het vermeldenswaard dat de Ubiq-CasRx- en Ubiq-dCasRx-vliegen niet werden vastgesteld als homozygote bestanden, vermoedelijk als gevolg van toxiciteit veroorzaakt door een hoge alomtegenwoordige expressie. Als gevolg hiervan werden heterozygote Ubiq-CasRx / CyO- en Ubiq-dCasRx / CyO-vliegen gebruikt voor kruising met homozygote gRNA-vlieglijnen. Kortom, het tweecomponenten Ubiq-CasRx-systeem is in staat om alomtegenwoordige RNA-targeting te bereiken voor zowel endogene als exogene doelen, wat resulteert in waarneembare fenotypen en transcriptreductie. Deze resultaten toonden ook aan dat CasRx-gemedieerde RNA-targeting in vivo toxiciteit kan introduceren.
Alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem De resultaten van de tweestapskruising toonden aan dat ondanks de exogene aard van het doelgen (d.w.z. Fluc), het tot expressie brengen van alle drie de transgenen in F2 triple transheterozygoten (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resulteerde in 100% letaliteit in vergelijking met controlekruisingen met Ubiq-dCasRx, waarbij geen letaliteit werd waargenomen in de F2 triple transheterozygoten (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (Figuur 3B-C ). Meer specifiek resulteerde alleen de combinatie van alle drie de transgenen (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) in 100% letaliteit (figuur 3B en D), terwijl (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) en (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) genotypen waren levensvatbaar en hadden geen fenotypes met hun overervingspercentages die overeenkwamen met de verwachte Mendeliaanse transmissiesnelheden, wat suggereert dat de beschikbaarheid van de doelsequentie (d.w.z. firefly luciferase) in combinatie met Ubiq-CasRx/+ en het gRNAFluc is wat resulteerde in de waargenomen letaliteit fenotypes, vermoedelijk afkomstig van de collaterale activiteit van Cas13 enzymen2,8 . Bovendien geen onderscheidbare fenotypen of dramatische invloed op overerving in F1-transheterozygoten (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ of Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) werden waargenomen in vergelijking met Ubiq-dCasRx-controles (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ of Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Figuur 3B), wat aangeeft dat een katalytisch actief enzym essentieel is om de waargenomen letaliteitsfenotypen te verkrijgen. Bovendien vertoonden fluc- en rluc-expressieniveaus bij vliegen van alle levensvatbare genotypen geen significante vermindering van fluc-expressie in de Ubiq-dCasRx drievoudige transheterozygoten (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) in vergelijking met dual luciferase reporter controls. Dit suggereert dat fluc-eiwitexpressieniveaus niet werden verlaagd door dCasRx-targeting (figuur 3D). Alles bij elkaar geven de gemeenschappelijke letaliteit fenotype in de twee verschillende CasRx-gemedieerde alomtegenwoordige RNA-targetingexperimenten aan dat casRx-gemedieerde RNA-targeting bij gebruik op weefsels alomtegenwoordig toxisch kan zijn voor het organisme.
Weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem Het hoge niveau van toxiciteit waargenomen in alomtegenwoordige RNA-targetingexperimenten heeft ons ertoe aangezet om de weefselspecifieke RNA-targeting te onderzoeken met behulp van een driecomponenten CasRx-systeemontwerp dat wordt beschreven in de sectie methoden. Inderdaad, het waargenomen toxiciteitsniveau werd verminderd wanneer de totale CasRx-expressie werd verlaagd met behulp van de UASt-promotor in vergelijking met die van de Ubiq-promotor, dit wordt geïllustreerd in drie aspecten: 1) de UASt-CasRx- en UASt-dCasRx-lijnen werden gehandhaafd als homozygote lijnen, hoewel op basis van het tweestapskruisschema dubbel gebalanceerde UASt-CasRx- en UASt-dCasRx-lijnen werden gebruikt om de kruisingen uit te voeren, 2) alle F2-generatie dCasRx triple transheterozygote overervingspercentages kwamen overeen met de verwachte 25% Mendeliaanse overervingsratio, en 3) de F2-generatie CasRx triple transheterozygote letaliteit fenotype was matig verminderd. In het white targeting experiment, van de 25% Mendeliaanse overervingspercentages verwacht in de F2 triple transheterozygoten, werd slechts 0,57% levensvatbare volwassen vliegen (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4) waargenomen, die allemaal ernstige oogspecifieke pigmentatie en morfologie fenotypes vertoonden (figuur 4A en 4B). Voor het wit-gerichte kruis was de CasRx-expresserende drievoudige transheterozygote F2-overervingssnelheid significant lager dan die van de dCasRx-uitdrukkende drievoudige transheterozygote controlegroep (27,6%) (figuur 4A). In het Notch-targetingexperiment waren CasRx-tot expressie brengende drievoudige tranheterozygoten die alle drie de transgenen droegen 100% dodelijk, terwijl de dCasRx-controle-overerving 29,3% was (figuur 4A). In het gele targetingexperiment vertoonden F2 triple transheterozygote CasRx-expressing, gRNAy en y-GAL4 marginale chitinepigmentreductie als kleine vlekken van gele cuticula op de thorax en buik met een overervingspercentage van 2,67%, veel lager dan dat van de dCasRx-controlegroep (25,2%) (Figuur4A ). Alle dCasRx-controle drievoudige transheterozygote vliegen vertoonden geen duidelijke fenotypen als de CasRx-tot expressie brengende vliegen, wat aangeeft dat katalytische activiteit van CasRx bijdroeg aan de waargenomen fenotypen. De lage overervingssnelheid in de CasRx triple transheterozygote groep suggereerde dat er twee bronnen van toxiciteit bestaan in CasRx RNA-targeting: één is geassocieerd met een hoge expressie van CasRx, waarvan de toxiciteit werd verminderd door restrictieve CasRx-expressie, de andere is geassocieerd met de nevenactiviteit. Samen toonden deze resultaten aan dat het CasRx-systeem weefselspecifieke in vivo RNA-targeting kan bereiken door gebruik te maken van het klassieke Gal4 / UASt-systeem en in de tussentijd de toxiciteit te verminderen. Toxiciteit en incidentele letaliteitsfenotypen werden echter nog steeds waargenomen op een lager niveau van ernst in vergelijking met die van de alomtegenwoordige benaderingen, wat aangeeft dat collaterale splitsingsactiviteit geassocieerd is met toxiciteit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg"> Figuur 1: Algemeen overzicht van RNA-targeting met behulp van een Cas13D-systeem. (A) Schema's van de eenstaps genetische kruising in de alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem. (B) Schema's van een genetische kruising in twee stappen in het alomtegenwoordige in vivo exogene RNA dat zich richt op het driecomponenten CasRx-systeem. (C) Schema's van een tweestaps genetisch kruising in het weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg"> Figuur 2: Alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem (herdrukt5). (A) Totale overervingspercentages van transheterozygote vliegen die Ubiq-CasRx (of Ubiq-dCasRx) en gRNA's erven. Blauwe arcering in de boxplot geeft fenotype penetrantie aan. (B) Fenotypen van transheterozygote vliegen. Pijlen duiden op weefselnecrose in het oog. Zwart-witte vlieg gemarkeerd met ''X'' staat voor dodelijkheid. (C) Totale overervingspercentages van transheterozygote vliegen van bidirectionele kruisingen tussen Ubiq-CasRx (of Ubiq-dCasRx) en gRNAGFP-OpIE2-GFP-vliegen. M, maternale overerving van CasRx; P, vaderlijke erfenis van CasRx. (D) F1-larven nakomelingen in het vaderlijke kruis. (E) De maximale a posteriori schattingen van transcripties voor de logaritmische vouwverandering. De DESeq2-pijplijn werd gebruikt. (F) Transcripties per miljoen (TPM) gericht met CasRx of dCasRx. (G) CasRx-depentent differentieel uitgedrukt transcriptpercentage van transcripten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg"> Figuur 3: Alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem. (A) Schema's van het tweestaps genetisch kruis. (B) Totale overervingspercentages voor alle genotypen die in de F2-generatie ontstaan . Het erven van alle drie de transgenen (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc en gRNAFLuc) in F2-nakomelingen resulteerde in 100% letaliteit en was significant lager in vergelijking met de Ubiq-dCasRx triple transheterozygotes controlegroep (p = 0,001, t-test). (C) Het dragen van Ubiq-CasRx/gRNAFluc alleen of Ubiq-CasRx en Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc alleen leidde niet tot ernstige letaliteit, en de overervingsverhoudingen tussen Ubiq-CasRx en Ubiq-dCasRx transheterozygoten waren niet significant verschillend (p = 0,41 en p = 0,51, respectievelijk, t-test). (D) Luciferase-verhoudingen normaliseren Fluc-metingen tot Rluc-metingen. Drievoudige transheterozygote vliegen die Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc tot expressie brachten, waren embryonaal dodelijk, die werd vertegenwoordigd door een vlieg met een "X", en als gevolg daarvan werd luciferase-expressie niet gemeten. Fluc/Rluc ratio van Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygoten was significant lager dan die van de andere Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-expresserende groepen (p = 1,2e-06 of lager, t-test). De resultaten van de gRNAFLuc-only groep waren significant lager dan die van alle andere groepen (p = 1,2e-06 of lager, t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg"> Figuur 4: Weefselspecifieke in vivo RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem (herdrukt5). (A) Totaal overervingspercentage van drievoudige transheterozygote vliegen die drie transgenen dragen (UASt-CasRx of UASt-dCasRx, gRNA's en Gal4-driver. (B) Fenotypen van de drievoudige transheterozygote vliegen. De witte pijl duidt op chitine pigmentreductie in de thorax. Zwart-witte vlieg gemarkeerd met ''X'' staat voor dodelijkheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bouwen</td>
			<td>Beschrijving</td>
			<td>Abc</td>
			<td>Primer-reeks (5' tot 3')</td>
			<td>PCR-sjabloon</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">Casrx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG AACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050r</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG Gaaca</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Artrose-1050l</td>
			<td rowspan="2">UASt promotor</td>
			<td>1041,C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA CAACACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">PJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041,C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC TTTCTCTTCTTCT TGGGGCTCATGT TTAAACCCAATT CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Casrx</td>
			<td>1050l. C1</td>
			<td>AATACAAGAAGA GAACTCTGAATA GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTA GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050s</td>
			<td rowspan="2">UASt promotor</td>
			<td>1041,C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC Gacggtcacg GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">PJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041,C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGCT CATGTTTAAAC CCAATTCCCTA TTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050l. C1</td>
			<td>AATACAAGAAG AGAACTCTGAAT AGGGAATTGGG TTTAAACATGAG CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">PDCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTAG CTAGCTTAAGCG TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Artrose-1043</td>
			<td rowspan="2">U6:3 promotor</td>
			<td>1043,C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmide #164586</td>
		</tr>
<tr>
<td>1043,C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT Ctctagaggtac CGTTGCGGCCG CAAAAAAGTTGT AATAGCCCCTCA AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT TGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">OA-1052b</td>
			<td rowspan="2">Ubiq promotor</td>
			<td>1052b. C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA ATATTTAAATGGC GGCTGCAGC GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmide #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>1052b. C2</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA Gagatg</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG AAGGGCGGAAA GATCGCCGTGG AGGGCAGAGGA AGTCTTCTAACAT GC</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmide #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908a2</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC Gtccatgcc</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Omgekeerde Ubiq promotor</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmide #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908a4</td>
			<td>GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAATAGAG Atgt</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Lijst van moleculaire constructen en primers die in deze studie zijn gebruikt. Deze lijst bevat alle constructen (zowel de ID als de beschrijving) en de bijbehorende primers van elk construct (zowel de ID als de sequenties (5' tot 3')) en gebruikte sjablonen.

Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het gebruik van het RNA-targeting Cas13D-enzym (RfxCas13D) in vliegen.

Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Zoals ons protocol laat zien, kunnen CRISPR CasRx-technologieën worden gebruikt om alomtegenwoordige en weefselspecifieke gentranscriptreducties in fruitvliegen te bereiken. Onze techniek biedt een startpakket voor iedereen die geïnteresseerd is in het gebruik van CRISPR-gebaseerde gentranscriptreductie in fruitvliegen, terwijl het compatibel is met verdere aanpassing en optimalisatie. Om een alomtegenwoordige in vivo RNA-targeting op te zetten met behulp van een tweecomponenten CasRx-systeem, verzamelt u 10 maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit de homozygote gRNA-lijn van belang en vijf volwassen mannelijke vliegen uit de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq CasRx CurlyO.Plaats de ouderlijke vliegen in een injectieflacon aangevuld met 100 microgram droog gistpoeder en laat de injectieflacons gedurende 48 uur achter bij 26 graden Celsius. Observeer de flesjes elke dag om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen uit het schaamgebied van de F1-generatie zijn gekomen en verdoof een van de volwassenen met koolstofdioxide gedurende 10 seconden. Zodra de vliegen onbeweeglijk worden, leegt u de flacon op een vliegenkussen dat is verbonden met de kooldioxidetank met continu koolstofdioxide en gebruikt u een kleurencamera die is aangesloten op een fluorescerende stereomicroscoop om de fenotypen van de vliegen te scoren en in beeld te brengen.Tel vervolgens de aantallen nakomelingen met verschillende fenotypen, volgens de fluorescerende signaalexpressie. Op basis van mendeliaanse genetica wordt verwacht dat 50% van het nageslacht het beoogde RNA tot expressie brengt. Merk op dat toxiciteit van het Ubiq CasRx-systeem de verhouding van gericht RNA dat nakomelingen tot expressie brengt kan verminderen tot minder dan 50% Om een alomtegenwoordige in vivo exogene RNA-targeting op te zetten met behulp van een driecomponenten CasRx-systeem, verzamel acht tot 10 Maagdelijke volwassen vrouwelijke vliegen uit een dubbele luciferase-expressielijn en vier tot vijf volwassen mannelijke vliegen uit de uitgebalanceerde heterozygote Ubiq CasRx Curly plus TM6, STB-lijn die tegelijkertijd witte ogen, krullende vleugels en ds-rode fluorescentie vertoont.Plaats de ouderlijke stap één cross-by in een flacon aangevuld met 100 microgram droog gistpoeder en laat dit kruis gedurende 48 uur op 26 graden Celsius. Verwijder aan het einde van de incubatie alle ouderlijke vliegen uit elke injectieflacon en breng de injectieflacons gedurende ten minste 14 dagen terug naar de couveuse van 26 graden Celsius. In de loop van 14 dagen verzamelen, zoals eerder vermeld, acht tot 10 vrouwelijke maagden uit de homozygote vuurvlieg luciferase gericht op gRNA-lijn drie keer.Observeer de stap één kruisflacons elke dag om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen uit de poppen zijn gekomen, verdovend met koolstofdioxide om de verzameling van vier tot vijf mannelijke vliegen mogelijk te maken die zowel de Ubiq CasRx als de dubbele Luciferase-verslaggever tot expressie brengen, indien beschikbaar. Plaats de vliegen in een nieuwe flacon met 10 Maagdelijke vrouwtjes van de fruitvlieg luciferase gericht op gRNA-lijn en plaats deze stap twee kruisen op 26 graden Celsius gedurende 48 uur. Verzamel nog eens vijf eendagsvliegjes die zowel de Ubiq CasRx als de dual luciferase reporter uit de stap één kruisflacons uitdrukken en incubeer de vliegen gedurende twee tot vier dagen alleen bij 26 graden Celsius voordat ze worden overgebracht naar een centrifuge van 1,5 milliliter voor opslag van min 80 graden Celsius.Verwijder aan het einde van de incubatie alle injectieflacons van de ouderlijke injectieflacons uit elk van de stap twee kruisflacons. En breng de flacons gedurende ten minste 20 dagen terug naar de incubator van 26 graden Celsius. Observeer de stap twee kruisflacons elke dag om te zien of er nieuwe volwassen nakomelingen uit de schaamstreek zijn gekomen, verdoving de vliegen met koolstofdioxide zodra ze beschikbaar komen en scoor en beeld hun fenotypen zoals aangetoond.Mendeliaanse genetica suggereert dat, als alle vliegen levensvatbaar zijn, 25% van het nageslacht het beoogde RNA tot expressie zou moeten brengen. Om een luciferase-assay uit te voeren, genereert u de drievoudige trans heterozygote vliegen en de controlevliegen zoals gedemonstreerd. Het verzamelen van de mannelijke vliegen bij de geboorte en ze laten rijpen tot drie dagen oud.Breng de drie dagen oude vliegen over in centrifugebuizen van 1,5 milliliter en lyseer ze met behulp van een buffer in de luciferaselysisbuffer uit een in de handel verkrijgbare luciferase-testkit. Gebruik vervolgens vijf microliter gelyseerd weefsel van elk monster en elke luminometer om zowel de fruitvliegjes als de uitgevoerde Luciferase-activiteit te meten, volgens standaard luciferase-testprotocollen. F1, trans heterozygote CasRx, hebben significant lagere overlevingskansen in vergelijking met trans heterozygote dCasRx-vliegen.Om de toxiciteit van het Ubiq CasRx-systeem van de drie doelgenen te bevestigen, zijn de U6 gRNA Y heterozygote vliegen niet levensvatbaar en groeien ze niet verder dan het tweede instar larvale stadium. De overlevende Ubq CasRx en U6 gRNA W heterozygote vliegen, vertonen een duidelijk volledig penetrant fenotype met grote ogen. Daarnaast wordt ook een significante vermindering van doelgentranscripten voor drie doelgenen waargenomen.Bewijs van off-target activiteit geïnduceerd door CasRx wordt ook waargenomen wanneer differentiële uitgedrukte transcripties tussen monsters van CasRx die vliegen tot expressie brengen en monsters van dCasRx-tot expressie brengende vliegen worden vergeleken. In de kruising in twee stappen resulteert alleen de combinatie van alle drie de transgenen in een 100% letaliteit. Wanneer weefselspecifieke RNA-targeting met behulp van een driecomponenten CasRx-systeemontwerp wordt gebruikt, wordt het toxiciteitsniveau verlaagd wanneer de totale CasRx-expressie wordt verlaagd met behulp van de UAST-promotor in vergelijking met die van de Ubiq-promotor.Het is belangrijk om het genetische proces correct in te stellen met behulp van vliegen van het juiste geslacht en correcte fenotypen.

ubiquitous-tissue-specific-rna-targeting-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

RNA-interferentie is bewezen zeer effectief te genfunctie te analyseren...

RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo&#39;s

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier presenteren we een methode voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door vervanging van de eerste codering exon van genen met transcriptie stuurprogramma's. De CRISPR/Cas9 gebaseerde methode plaatst een transactivator reeks onder de endogene regulering van een vervangen gen, en bijgevolg vergemakkelijkt transctivator expressie uitsluitend in gen-specifieke Spatio patronen.

Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Hier gepresenteerd is een protocol om de CRISPR-Cas9 systeem te gebruiken voor het verminderen van de productie van een eiwit in de volwassen honingbij hersenen om antilichaam specificiteit te testen.

Anti-RDL en Anti-mGlutR1 Receptoren Antibody Testen in Honingbij Hersensecties met behulp van CRISPR-Cas9

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Hier presenteren we een vereenvoudigd endogene gentagging-protocol voor Drosophila, dat gebruik maakt van een op PCR gebaseerde techniek voor markervrije identificatie van succesvolle genetische modificaties, waardoor de ontwikkeling van stabiele knock-in-lijnen wordt vergemakkelijkt.

Op CRISPR gebaseerde strategie in één stap voor endogene gentagging in Drosophila melanogaster

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila melanogaster met CRISPR/CasRx. Deze methode maakt efficiënte transcriptreductie mogelijk met fenotypische en moleculaire evaluatie.

Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx

Meer video's verkennen