Generatie van Murine Primaire Colon Epitheliale Monolayers uit Intestinal Crypts

Ons protocol biedt een snelle, reproduceerbare en betrouwbare methode om directe primaire intestinale epitheelmonolagen op verschillende oppervlakken te genereren met minimaal puin. De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn een laag mediaverbruik en een laag kostenonderhoud van de celkweek. Het is een snelle methode om functionele tests en snelle downstream-toepassingen uit te voeren.

Dit protocol geeft inzicht in de studie van wondherstel, permeabiliteitsbarrière en transepitheliale migratie van verschillende celtypen. Dit model kan ook nuttig zijn bij interactie tussen gastheer en ziekteverwekker, beschadigde epitheel- en medicijnontdekking. Voeg om te beginnen 200 microliters coatingoplossing toe aan elke put van een 48-put plaat en kamerschuif.

Incubeer beide in een incubator van 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Coat 0,4 micrometer celmembraan inserts met 200 microliters collageenoplossing. Incubeer de plaat met de membraaninzetstukken op vier graden Celsius gedurende 30 minuten en breng deze vervolgens gedurende twee uur over naar een incubator van 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius.

Desinfecteer een geëuthanaseerde muis met 70% ethanol en ontleed vervolgens de dikke darm van rectum naar cecum met behulp van een schaar en tang. Spoel de uitwerpselen voorzichtig uit met ijskoude PBS in een spuit van 10 milliliter met een voedingsbuis van 20 gauge. Verwijder de proximale dikke darm en schuif de distale dikke darm voorzichtig op de 20 gauge voedingsbuis.

Bind de dikke darm aan het einde van de buis vast met 4-0 zijden hechtdraad. Keer de dikke darm binnenstebuiten om over het gebonden uiteinde en bind het andere uiteinde vast met draad en snijd vervolgens de dikke darm onder de punt van de voedingsbuis met behulp van een chirurgische schaar. Open voorzichtig het losgemaakte uiteinde van de omgekeerde dikke darm op de punt van een herhaalspuit van 1,25 milliliter met behulp van de zuiger.

Schuif het losgemaakte uiteinde van de omgekeerde dikke darm op de spuit en bind deze stevig vast met een draad. Steek de zuiger in de spuit en blaas de dikke darm op totdat deze er turgent uitziet zonder zichtbare rimpels. Doe de opgepompte darmworst in een buis van 15 milliliter met vijf milliliter celterugwinningsoplossing gedurende 20 minuten op ijs.

Blaas de dikke darm eens in de vijf minuten op en laat deze leeglopen. Bind de opgeblazen dikke darm onder de punt van de herhaalspuit vast met behulp van 4-0 zijden hechtdraad. Snijd de darmworst van de herhaalspuit en plaats deze gedurende 40 minuten in een buis van 15 milliliter met 10 milliliter 50 millimol EDTA.

Draai de buis op vier graden Celsius. Vervang de EDTA-oplossing door vijf milliliter schudbuffer en schud de worst twee minuten handmatig in verticale positie. Decanteer de schudoplossing in een nieuwe buis van 15 milliliter en herhaal de schudstap totdat in totaal 10 milliliter crypten en schudbuffer is verzameld.

Tel het aantal crypten in 20 microliters van de suspensie onder een microscoop en verdun het monster om de concentratie van vijf crypten per microliter te verkrijgen. Centrifugeer het cryptemonster gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius op 400 maal G. Verwijder ondertussen de 48-put plaat- en membraaninzetstukken uit de incubator en plaats deze in de bioveiligheidskast.

Aspireer de coatingoplossing met behulp van een P200 pipet en laat de plaat met het deksel iets verschoven totdat de cellen klaar zijn om te worden geplateerd. Verwijder na centrifugeren van de cryptesuspensie de schudbuffer en resuspend de intacte pellet in drie milliliter LWRN complete media. Voeg 200 microliters crypten toe aan elke put van de voorgecoate 48-put plaat en kamerschuif en incubeer beide in een incubator van 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius.

Aspireer de media de volgende dag en voeg nieuwe media toe. Over het algemeen worden de cellen samenvloeiend in 24 tot 48 uur. Voeg voor celkweekmembraaninzetstukken 200 microliters crypten toe aan de bovenkant van de inserts en 600 microliters complete LWRN-media aan de onderkant.

Aspireer de media de volgende dag en voeg alleen nieuwe media toe aan de bovenste kamer. Incubeer de plaat in een incubator van 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius. Meet elke dag transepitheliale elektrische weerstand met behulp van een epitheliale volt / ohm-meter.

Na het isoleren van de crypten van een muriene dikke darm en het verifiëren van de concentratie, werd de crypte-suspensie geconcentreerd tot vijf crypten per microliter. 48-put plaatputten werden onderworpen aan een kraswondtest bij het bereiken van de celconfluentie. Na 24 uur werd wondherstel waargenomen, wat aangeeft dat de cultuur gezond en levensvatbaar was.

Hogere niveauwaarden werden bereikt toen media werden gewijzigd van LWRN naar differentiatiemedia. Ook werden een afname van ISC-markers en een toename van differentiatiemarkers waargenomen, wat aangeeft dat de gedifferentieerde monolagen met succes werden gegenereerd. Bovendien werd het verschijnen van subtypes van gedifferentieerde epitheelcellen die in verschillende omstandigheden werden gekweekt, aangetoond door immunofluorescentie.

Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de dikke darm op geen enkel moment tijdens de voorbereiding wordt gescheurd en opgeblazen blijft om crypten vrij te geven in een uiterst schone voorbereiding. Zodra de 2d intestinale epitheelcelmonolagen zich vormen, kunnen we immunofluorescentie, kraswond- en permeabiliteitstesten en andere downstreamtoepassingen uitvoeren. Dit zal kennis verschaffen over wondgenezing, migratie van verschillende celtypen en epitheliale reparatie- en schadestudies.