Visualiseren van de effecten van oxidatieve schade op Drosophila Egg Chambers met behulp van Live Imaging

Ons lab gebruikt Drosophila melanogaster om genen en paden te identificeren en te karakteriseren die de mitochondriale functie reguleren tijdens de ontwikkeling en fysiologische homeostase. Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van live beeldvorming met toevoeging van waterstofperoxide om de effecten van oxidatieve schade op de lokalisatie en dynamiek van subcellulaire structuren in de volwassen Drosophila-eierstok te visualiseren. We gebruiken vaak beeldvormingsprotocollen om te bestuderen hoe mutaties normale mitochondriale lokalisatie en beweging in vrouwelijke kiemcellen veranderen.

In de loop van onze studies ontdekten we dat stress geïntroduceerd door dissectie of andere celstressoren een diepgaande impact had op mitochondriale lokalisatie. Als een controle om te bepalen of algemene stress, in tegenstelling tot experimentele behandeling, de oorzaak is van veranderingen in de lokalisatie of het gedrag van subcellulaire structuren. We hebben dit protocol ontwikkeld om controlespanning in te voeren met waterstofperoxide.

In deze video laten we zien hoe waterstofperoxide geïnduceerde oxidatieve schade de verdeling van mitochondriën en het ribonucleoproteïne Clu verandert. De media die het meest geschikt waren voor deze live beeldvormingstechniek bevatten Schneiders Drosophila-media die 15% warmte-inactivated foetale runderserum, 0,6 X Pen-Strep en 200 microgram per microliter runder insuline bevatten, hierna complete Schneiders media genoemd. Door het mediapreparaat onder steriele omstandigheden uit te voeren, zorgt u ervoor dat het niet besmet raakt.

Meng de inhoud goed door elkaar en bewaar 's nachts op vier graden. Insuline lost niet volledig op in de volledige Schneider's media en u zult merken dat een neerslag zich in de bodem van de buis nestelt. Maak aliquots, zorg ervoor dat je dit neerslag achterlaat, omdat het de beeldvorming zal verstoren.

Deze oplossing kan gedurende een maand worden gebruikt als deze in aliquots op vier graden wordt bewaard. Voor een optimale beeldvorming van vrouwelijke kiemcellen, bereidt u eerst een flacon met een beetje natte gistpasta die de consistentie van pindakaas is. Dit zorgt ervoor dat de vrouwtjes goed worden gevoed en produceert alle follikelontwikkelingsfasen voor beeldvorming.

Voor optimaal gezonde vliegen, verzamel nul tot een dag oude vrouwtjes en breng met mannetjes over in een flacon met natte gistpasta. Zorg ervoor dat de slapende vliegen geen contact maken met de gistpasta omdat ze eraan kunnen blijven plakken. Voer de vliegen drie tot zeven dagen en verander de gistpasta dagelijks.

Zorg ervoor dat de gistpasta in contact komt met het vliegvoedsel, zodat het niet uitdroogt. Om oxidatieve schade te veroorzaken, gebruiken we een voorraadoplossing van 30% waterstofperoxide en om mitochondriën te visualiseren, gebruiken we een voorraadoplossing van 100 millimolar TMRE. Het is belangrijk om de mediaoplossingen vers voor te bereiden, omdat waterstofperoxide gevoelig is voor oxidatie en TMRE na verloop van tijd afbreekt.

Vlak voor de dissectie, in volledige Schneider's media, bereid een verse aliquot van twee micromolar waterstofperoxide, een verse aliquot van 46 nanomolar TMRE, en een verse aliquot van 46 nanomolar TMRE plus twee micromolar waterstofperoxide. Voor eierstokdissectie heb je twee paar fijne tangen en een paar elektrolytisch geslepen wolfraamnaalden nodig. Om de eierstokken te ontleden, vult u een horlogeglas met complete Schneiders media die zijn opgewarmd tot kamertemperatuur en plaatst u vervolgens een enkele vlieg in de media met behulp van een tang.

Pak de vlieg voorzichtig vast aan de thorax met één paar fijne tangen. Pak met de andere tang de achterste vast en trek voorzichtig om de eierstokken te verwijderen. Verwijder eventuele vreemde nagelriem of weefsel en breng de eierstok over naar een nieuwe put met verse media.

De eierstokken moeten nog steeds bewegen van de omliggende spierschede. Gebruik de geslepen wolfraamnaalden en plaag de ovarioles voorzichtig uit elkaar en zorg ervoor dat de omliggende spierschede wordt verwijderd. Als de spierschede niet wordt verwijderd, zoals hier is aangetoond, zal de ovaria trillen, wat problemen veroorzaakt met het verkrijgen van afbeeldingen.

Zodra de ovarioles netjes zijn ontleed, breng je ze over in een druppel van 100 microliter media in een MatTek-schaal als je endogene gelabelde structuren visualiseert. Breng de ovarioles over in een druppel TMRE-media van 100 microliter in een MatTek-schaal als u mitochondriën met TMRE visualiseert. De ovarioles zinken naar de bodem van de druppel.

Het is belangrijk om dissecties te oefenen om zo snel mogelijk te beginnen met het in beeld brengen van het weefsel. Zodra de ovarioles zijn gemonteerd, plaatst u de schotel op de omgekeerde microscoop en krijgt u stilstaande beelden of korte video's als een record van voorbehandelingsomstandigheden. Zodra dit is gebeurd, pauzeer de live beeldvorming, verwijder het deksel en voeg voorzichtig 100 microliters van de twee micromolar waterstofperoxide bereide oplossing toe.

Vermijd het breken van het oppervlak van de bestaande mediadruppel of het te snel toevoegen van de oplossing, om de ovarioles die op de bodem rusten niet te verplaatsen. Vervang de schotelafdekking, verplaats en heroriënteer de gewenste ovariole en hervat de beeldvorming. Zorg ervoor dat de beeldvorming zo snel mogelijk wordt hervat, omdat de experimentele behandeling tijdgevoelig is.

Hier zijn stilstaande beelden te zien van een film, genomen na een waterstofperoxidebehandeling. Mitochondriën en vrouwelijke kiemcellen worden verspreid over het cytoplasma wanneer de vliegen goed gevoed en gezond zijn. Na toevoeging van waterstofperoxide zorgt de oxidatieve schade ervoor dat mitochondriën samenklonteren, wat tot 10 minuten na de behandeling kan worden gezien.

Na 20 minuten zorgt de schade ervoor dat het mitochondriale membraanpotentieel verdwijnt. Zo vervagen de meeste mitochondriën. In deze live film van het proces zijn mitochondriën snel te zien klonteren en de meerderheid van de mitochondriën vervaagt uiteindelijk.

Het pulserende knipperen in het cytoplasma, met name in de omringende follikelcellen, lijkt kenmerkend voor TMRE-toevoeging. Zoals eerder vermeld, moet de beeldvorming snel plaatsvinden na toevoeging van waterstofperoxide. Zoals hier wordt getoond, als er te veel tijd verstrijkt, is het mitochondriale membraanpotentieel al verloren en verdwijnt de TMRE-etikettering, waardoor de gegevens niet kunnen worden geïnterpreteerd.

In deze videostille beelden zijn GFP-endogene Clu-deeltjes robuust en overvloedig in het kiemplasma van goed gevoede vrouwtjes. Na toevoeging van waterstofperoxide verspreiden Clu-deeltjes zich binnen 10 minuten. Dit wordt gedemonstreerd in de bijbehorende video.

Na toevoeging van waterstofperoxide verspreiden de Clu bliss-deeltjes zich snel. We hebben ontdekt dat dit protocol een nuttig hulpmiddel is om een nauwkeurige beeldvorming te garanderen van wild-type lokalisatie van mitochondriën en Clu bliss deeltjes in Drosophila vrouwelijke kiemcellen. Dit protocol moet van toepassing zijn op een breed scala aan live beeldvormende studies en kan ook worden gebruikt om weefsels te behandelen vóór fixatie.

De belangrijkste stappen zijn om ovarioles vrij van de spierschede te isoleren, om voorzichtig het waterstofperoxide toe te voegen, om de ovarioles niet los te maken, en om snel na waterstofperoxidetoevoeging in beeld te komen. We hopen dat u dit een nuttige controle zult vinden voor live beeldvorming van een verscheidenheid aan subcellulaire structuren. Bedankt voor het kijken en veel succes met je experimenten.