Name: In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer in vivo calciumbeeldvorming van geniculate ganglion neuronen in muizen met GCaMP. Deze methode monitort real-time smaakprikkelreacties op cellulair niveau voor inzicht in perifere gustatoire functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken S. Humayun voor de muizenhouderij. Financiering voor dit werk is gedeeltelijk verstrekt door UTSA's Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) en NIH-SC2-GM130411 aan L.J.M.

Dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de University of Texas San Antonio.
1. Pre-operatieve installatie
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de eerste installatie van apparatuur hier niet wordt behandeld, omdat deze varieert op basis van het gebruikte pompsysteem, microscoop, camera en beeldbewerkingssoftware. Raadpleeg voor installatie-instructies het instructiemateriaal van de leverancier van de apparatuur. Voor apparatuur die door de auteurs wordt gebruikt, zie de tabel met materialen.
<ol><li>Zorg ervoor dat er vloeistof door alle voertuig (water) en smaakleidingen stroomt. Als de lijn is geblokkeerd, koppelt u de verbinding los en spoelt u deze met water. Als de lijn geknikt is, masseer dan totdat er vloeistof stroomt. Zorg ervoor dat de vloeistof start en stopt op cue.</li>
	<li>Zodra alle lijnen zijn gedeblokkeerd, laat u het voertuig gedurende 10 s lopen en sluit u vervolgens alle kleppen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de beeldbewerkingssoftware klaar is met alle vereiste variabelen (bijv. proeflengte, bestandsnamen, framesnelheid, enz.). Met behulp van μManager, een open-source softwarepakket voor beeldacquisitie, voert u 200 ms in het veld exposure time in voor een frame per seconde van 5Hz, selecteert u x2 onder binningen drukt u op de knop met het label Live. Wanneer de video wordt gestart, drukt u op de knop aan de linkerkant met het label ROI. Dit resulteert in een gezichtsveld van 512x512.</li>
</ol>2. Het dier verdoven en immobiliseren
OPMERKING: Het volgende protocol is een terminale procedure die is geoptimaliseerd voor muizen van beide geslachten met een gewicht van 18-35 g. Het wordt aanbevolen voor gebruik met dieren tussen de 10 en 12 weken oud. Het kan worden gebruikt met transgene dieren die genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECIs) tot expressie brengt, zoals de Snap25-GCaMP6s, of dieren die stereotaxisch zijn geïnjecteerd met virale GECIs. Handschoenen, laboratoriumjas en gezichtsmasker moeten gedurende het hele protocol worden gedragen.
<ol><li>Scruff dier en voer een intraperitoneale injectie van Ketamine (100 mg / kg) en Xylazine (10 mg / kg). Beoordeel de diepte van de anesthesie via teenknijpen voordat u doorgaat.</li>
	<li>Scheer de bovenkant van het hoofd en het operatiegebied aan de voorkant van de nek.</li>
	<li>Zet het verwarmingskussen aan en plaats het dier op het kussen.</li>
	<li>Breng zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging van de ogen te voorkomen.</li>
	<li>Maak een incisie (~ 1 cm) in de middellijn van het hoofd om de schedel van het dier bloot te leggen. Verwijder bindweefsel met een steriel wattenstaafje zodat het blote bot toegankelijk is. Gebruik een applicator met katoenen punt om ervoor te zorgen dat de schedel droog is.</li>
	<li>Breng dierenartsbinding aan op de schedel. Zorg ervoor dat u de blootgestelde schedel bedekt. Wacht tot de lijm is droog.</li>
	<li>Meng in een petrischaaldeksel en breng een laag tandcement aan op de schedel. De achterkant van de applicator met katoenen punt die in stap 2.5 wordt gebruikt, werkt goed voor dit proces. Plaats de hoofdpost bovenop het tandcement en breng een tweede laag tandcement aan om de hoofdpost op zijn plaats op de schedel te sandwichen.</li>
	<li>Laat het zitten totdat het tandcement droog en stevig is. Breek de applicator met katoenen punt in tweeën en gebruik de puntige uiteinden om het tandcement te prikken om te testen. Als het tandcement niet toegeeft om te worden geprikt, kan het dier in rugligging worden gedraaid.</li>
</ol>3. Tracheotomie
<ol><li>Breng pre-chirurgische scrub aan op het operatiegebied. Maak na het scrub een middellijnincisie ~ 2 cm in de huid van de keel van het borstbeen tot de kin.</li>
	<li>Trek de huid en sub-maxillaire klieren terug en zorg ervoor dat de digastrische spieren volledig worden blootgesteld.</li>
	<li>Zoek de naad in de paratracheale musculatuur, scheid deze met stompe dissectie en trek deze open.</li>
	<li>Snijd voorzichtig een opening in de bovenkant van de luchtpijp die groot genoeg is om polyethyleenbuizen te passen (I.D. 0,86 mm, O.D. 1,27 mm). Snijd niet meer dan halverwege de diameter van de luchtpijp. Steek slangen in de luchtpijp richting de longen.</li>
	<li>Herpositioneer retractors om paratracheale musculatuur vrij te maken en de submaxillaire klieren in te trekken.</li>
	<li>Lijm paratracheale spieren aan elkaar over slangen met een minimale hoeveelheid veterinaire lijm (zie figuur 1A).</li>
</ol>4. De trommelvliesbula openbreken
<ol><li>Plaag zachtjes de gewenste digastrische spier (links of rechts) omhoog en trek het bindweefsel uit elkaar. Snijd aan het voorste uiteinde van de spier, vermijd bloedvaten en trek je naar achteren terug totdat je vrij bent van de trommelvliesbula.</li>
	<li>Kantel het hoofd iets naar achteren om de trommelvliesbula op te tillen. Lokaliseer de tak van de halsslagader anterieur naar het achterste inbrengpunt van de digastrische spier. Voel je net achter dit bloedvat voor de bolle structuur van de trommelvliesbula.</li>
	<li>Zoek op deze locatie naar een naad in de musculatuur (zie figuur 1B). Met behulp van twee sets fijne tang, stomp ontleden bij de naad totdat het bot van de trommelvlies bulla zichtbaar is. Gebruik retractors om een duidelijk zicht te houden op de trommelvlies bulla.</li>
	<li>Zoek de naad die van voor naar achter loopt op de bulla (zie figuur 1C). Prik met behulp van een chirurgische sonde een gat in het bot in het midden van deze naad. Gebruik een set fijne eindscharen om een cirkelvormig gebied in het bot te knippen, waarbij u ervoor zorgt dat de bloedvaten niet vooraan, achterste en diep onder de bulla worden afgesneden.</li>
</ol>5. Het geniculate blootstellen
<ol><li>In dit gat zit een boll stukje bot, dit is het slakkenhuis. Voor het slakkenhuis bevindt zich een spier, de tensor tympani (zie figuur 1D). Knip met de veerschaar de tensor tympani en verwijder deze.</li>
	<li>Voer een teenknijp uit. Als het dier reageert, geef dan een ketamine / xylazine-mengsel in een dosis van 1/3 om opnieuw te proberen.</li>
	<li>Bereid irrigatievloeistof en een zuigleiding voor. Prik met behulp van de chirurgische sonde een gat in het cochleaire voorgebergte. Irrigeer onmiddellijk de vloeistof die eruit stroomt en verwijder deze met afzuiging. Deze vloeistof zal vanaf dit punt min of meer continu stromen en zal periodiek moeten worden aangepakt.</li>
	<li>Vergroot het gat in het slakkenhuis. Wees voorzichtig met het bloedvat dat het slakkenhuis omringt tot aan de achterste en laterale rand.</li>
	<li>Kantel de kop van de muis naar voren. Lokaliseer het gat in het temporale bot onder wat het slakkenhuis was (zie figuur 1E). Let op de richel voorin dit gat, deze richel zit direct boven de zevende zenuw.</li>
	<li>Steek een chirurgische sonde in het gat en til het temporale bot voorzichtig op om de zevende zenuw bloot te leggen (zie figuur 1F). Inventariseer hoeveel van de zevende zenuw zichtbaar is en als het geniculate niet volledig is blootgesteld, kantel dan het hoofd van het dier naar achteren en probeer bot op te trekken van de voorste naar de zenuw.</li>
	<li>Als het ganglion nog steeds niet volledig zichtbaar is, trek dan meer bot van onderaf omhoog. Wees heel voorzichtig om de sonde niet diep onder het bot te plaatsen, omdat dit het geniculate kan beschadigen.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2.jpg"> Figuur 1: Chirurgische blootstelling van het geniculate ganglion. (A) Afbeelding van de nekholte van de muis na tracheotomie. Arrow wijst naar de digastrische spier die over het operatiegebied ligt dat in de rest van de figuur wordt onderzocht. (B) Afbeelding van regio onder de eerder aangegeven digastrische spier. Pijl geeft de naad in musculatuur aan voor stompe dissectie. (C) Afbeelding van de Tympanic Bulla. Pijl geeft aan dat de naad in het bot moet breken met een chirurgische sonde. (D) Afbeelding van chirurgisch gebied na het openen van de bulla. Pijl linksonder geeft het slakkenhuis aan, bovenste pijl wijst naar de tensor tympani. De regel in het kader geeft het gebied in (E) en (F) aan. (E) Afbeelding van chirurgisch gebied nadat het slakkenhuis is gebroken en de inhoud is verwijderd. Witte pijl geeft aan waar chirurgische sonde moet worden plaats waarnaar wordt verwezen in protocolstap 5.6. (F) Een afbeelding van het blootgestelde geniculate ganglion. Pijl geeft het lichaam van de zevende zenuw aan, onderbroken driehoek omringt het geniculate ganglion. Panelen A-B, Schaal = 5 mm. Panelen C-F, Schaal = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
6. Voer het smakelijke paneel uit
<ol><li>Gebruik zuigkracht om vloeistof over het geniculate te verwijderen. Plaats eventueel een absorberend punt om kwel te verminderen en te helpen bij microscoopnavigatie.</li>
	<li>Plaats het dier op absorberend kussen onder de microscoop. Lokaliseer het geniculate ganglion: nuttige oriëntatiepunten zijn het gat in de bulla, het gat in het temporale bot en de zevende zenuw. Controleer met behulp van het FITC/GFP-filter op de epifluorescentiescope op individuele GCaMP-tot expressie brengende geniculate ganglionneuronen. Een 10x objectief (werkafstand 10mm) biedt voldoende resolutie om de activiteit van individuele cellen te volgen, maar een 20x objectief (werkafstand 12 mm) kan ook worden gebruikt.</li>
	<li>Plaats de doseernaald voor smakelijke lijn stevig in de mond van het dier. Plaats een petrischaaltje onder de mond van het dier om vocht op te vangen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de camera het gezichtsveld van de microscoop bekijkt. Synchroniseer het begin van de video-opname met het begin van de smakelijke presentatie.</li>
	<li>Bekijk tijdens het opnemen live feed voor reacties, drift en kwel.</li>
	<li>Als er kwel optreedt, zuigt u de vloeistof af totdat het zicht op het geniculate helder is en herhaalt u dit. Als er drift optreedt, controleer dan of alle delen van de koppaal stevig zijn aangespannen. Als er geen reacties optreden, controleer dan of er vloeistof stroomt en of de microscoop en camera op de juiste locatie zijn gericht zonder dat het gezichtsveld wordt verduisterd.</li>
	<li>Herhaal dit totdat het gewenste aantal video's is verkregen. Maak de retractors voorzichtig gemakkelijk en herhaal vervolgens stap 3-6 aan de andere kant.</li>
	<li>Nadat de gewenste video's zijn verkregen voor alle gewenste ganglia, euthanaseer het dier via cervicale dislocatie.</li>
</ol>

<ol><li>Krimm, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+that+regulate+embryonic+gustatory+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Factors that regulate embryonic gustatory development.</a> BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4(2007).</li>
<li>Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+taste+cells+lacking+synapses+mediate+neurotransmission%3F+CALHM1%2C+a+voltage-gated+ATP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel.</a> Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).</li>
<li>Taruno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+transduction+and+channel+synapses+in+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv-European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste transduction and channel synapses in taste buds.</a> Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).</li>
<li>Kinnamon, S. C., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+for+ATP%3A+neurotransmission+in+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A taste for ATP: neurotransmission in taste buds.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264(2013).</li>
<li>Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptors+and+cells+for+mammalian+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The receptors and cells for mammalian taste.</a> Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+sense+about+taste%3A+from+mammals+to+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common sense about taste: from mammals to insects.</a> Cell. 139 (2), 234-244 (2009).</li>
<li>Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+neural+response+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Gustatory neural response in the mouse.</a> Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).</li>
<li>Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opponent+effects+of+quinine+and+sucrose+on+single+fiber+taste+responses+of+the+chorda+tympani+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve.</a> Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).</li>
<li>Frank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+classification+of+mammalian+afferent+taste+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">The classification of mammalian afferent taste nerve fibers.</a> Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).</li>
<li>Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+gustatory+nerve+fiber+discharge+pattern+with+change+in+stimulus+concentration+and+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality.</a> Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).</li>
<li>Sollars, S. I., Hill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recordings+from+rat+geniculate+ganglia%3A+taste+response+properties+of+individual+greater+superficial+petrosal+and+chorda+tympani+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones.</a> Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).</li>
<li>Yokota, Y., Bradley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geniculate+ganglion+neurons+are+multimodal+and+variable+in+receptive+field+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics.</a> Neuroscience. 367, 147-158 (2017).</li>
<li>Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+modulates+taste+responsiveness+and+stimulates+gustatory+neurons+in+the+rat+geniculate+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%3A+A+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress.</a> Neuron. 98 (4), 865(2018).</li>
<li>Barreto, R. P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517, 373-376 (2015).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+animal+calcium+imaging+of+the+geniculate+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion.</a> Protocol Exchange. , 106(2015).</li>
<li>Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewiring+the+taste+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rewiring the taste system.</a> Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6, 8171(2015).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html">http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html</a> (2008).</li>
<li>Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/5817461">https://gist.github.com/ackman678/5817461</a> (2014).</li>
<li>Cantu, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZcalcium%3A+Open-source+toolbox+for+analysis+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data.</a> Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sour+sensing+from+the+tongue+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sour sensing from the tongue to the brain.</a> Cell. 179 (2), 392-402 (2019).</li>
<li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079(2019).</li>
<li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.

Dit werk beschrijft een stapsgewijs protocol om het geniculate ganglion operatief bloot te leggen en de activiteit van zijn neuronen visueel vast te leggen met GCaMP6s. Deze procedure lijkt erg op die eerder beschreven17, met een paar opmerkelijke uitzonderingen. Ten eerste zorgt het gebruik van een hoofdpost voor een eenvoudige aanpassing van de hoofdpositie tijdens de operatie. Ten tweede, met betrekking tot stimulusafgifte, stroomt de aanpak van Wu en Dvoryanchikov smaakprikkels door slokdarmbu...

Een belangrijk onderdeel van het perifere smaaksysteem van zoogdieren is het geniculate ganglion. Naast enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren, bestaat het geniculate uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren. Net als andere perifere sensorische neuronen zijn de geniculate ganglionneuronen pseudo-unipolair met een lang axon dat perifeer projecteert naar de smaakpapillen en centraal naar de hersenstamkern van het solitaire kanaal1. Deze neuronen worden voornamelijk geactiveerd door de afgifte van ATP door smaakreceptorcellen die reageren op smaakprikkels in de mondholte2,3. ATP is een essentiële neurotransmitter voor smaaksignalering en P2rx-receptoren uitgedrukt door de smaakganglionneuronen zijn nodig voor hun activering4. Gezien het feit dat smaakreceptorcellen specifieke smaakreceptoren uitdrukken voor een bepaalde smaakmodaliteit (zoet, bitter, zout, umami of zuur), is verondersteld dat smaakganglionneuronreacties op smaakprikkels ook nauw afgestemd zouden zijn5.
Hele zenuwopnamen hebben aangetoond dat zowel de chorda tympani als de grotere superieure petrosale zenuwen smaaksignalen geleiden die alle vijf smaakmodaliteiten vertegenwoordigen voor het geniculate ganglion6,7. Dit liet echter nog steeds vragen over de specificiteit van neuronale reacties op een bepaalde smaakstof: als er smaakmodaliteitsspecifieke neuronen, polymodale neuronen of een mengsel van beide zijn. Enkelvoudige vezelopnamen geven meer informatie over de activiteit van individuele vezels en hun chemische gevoeligheden8,9,10,maar deze methodologie is beperkt tot het verzamelen van gegevens van kleine aantallen vezels. Evenzo geven in vivo elektrofysiologische opnames van individuele ratgeniculate ganglionneuronen informatie over de reacties van individuele neuronen11,12,13, maar verliezen nog steeds de activiteit van de populatie en leveren relatief weinig neuronregistraties per dier op. Om de responspatronen van neuronale ensembles te analyseren zonder de activiteit van individuele neuronen uit het oog te verliezen, moesten nieuwe technieken worden gebruikt.
Calciumbeeldvorming, vooral met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren zoals GCaMP, heeft deze technische doorbraakopgeleverd 14,15,16,17,18. GCaMP gebruikt calcium als een proxy voor neuronale activiteit, waardoor groene fluorescentie toeneemt naarmate het calciumgehalte in de cel stijgt. Nieuwe vormen van GCaMP worden nog steeds ontwikkeld om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de bindingskinetiek aan te passen en aan te passen voor gespecialiseerde experimenten19. GCaMP biedt resolutie van één neuron, in tegenstelling tot hele zenuwopname, en kan tegelijkertijd reacties van ensembles van neuronen meten, in tegenstelling tot enkelvoudige vezel- of enkele celregistratie. Calciumbeeldvorming van de geniculate ganglia heeft al belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen16,20, en heeft perifere smaakmisdrading fenotypes geïdentificeerd in genetisch gemanipuleerde muizen18.
Een grote moeilijkheid bij het toepassen van in vivo calciumbeeldvormingstechnieken op het geniculate ganglion is dat het is ingekapseld in de benige trommelvliesbula. Om optische toegang tot het geniculate te verkrijgen, is delicate chirurgie vereist om de lagen botten te verwijderen, terwijl het ganglion intact blijft. Voor dat doel hebben we deze gids gemaakt om andere onderzoekers te helpen toegang te krijgen tot het geniculate ganglion en de GCaMP-gemedieerde fluorescerende reacties van deze neuronen op smaakstimuli in vivo in beeld te brengen.

<table><tbody><tr><td>1 x #5 Inox Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9792102</td><td></td></tr><tr><td>1ml Syringe with luer lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>2 x #3 Inox Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>M3S 11200-10</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge Blunt Dispensing Needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1372532</td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0398332</td><td></td></tr><tr><td>4-40 Machine Screw Hex Nuts</td><td>Fastenere</td><td>3SNMS004C</td><td></td></tr><tr><td>4-40 Socket Head Cap Screw</td><td>Fastenere</td><td>3SSCS04C004</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent Points</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-930-668</td><td></td></tr><tr><td>Acesulfame K</td><td>Fisher Scientific</td><td>A149025G</td><td></td></tr><tr><td>Artificial Tears</td><td>Akorn</td><td>59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-6D</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Retractors</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thor Labs</td><td>MB8</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A95-3</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Contemporary Ortho-Jet Liquid</td><td>Lang</td><td>1504</td><td></td></tr><tr><td>Contemporary Ortho-Jet Powder</td><td>Lang</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Fisher</td><td>19-062-616</td><td></td></tr><tr><td>Custom Head Post Holder</td><td>eMachineShop</td><td></td><td>Zie het bijgevoegde bestand 202410.ems</td></tr><tr><td>Custom Metal Head Post</td><td>eMachineShop</td><td></td><td>Zie het bijgevoegde bestand 202406.ems</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440</td><td></td></tr><tr><td>Disection Scope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Hair Clippers</td><td>Kent Scientific</td><td>CL7300-Kit</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6195906</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Ketaved</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>LED Cold Light Source</td><td>Leica Mcrosystems</td><td>KL300LED</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock 1/16" Tubing Adapters</td><td>Fisher</td><td>01-000-116</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Mini-series Optical Posts</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R</td><td></td></tr><tr><td>MPG</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1723230</td><td></td></tr><tr><td>MXC-2.5 Rotatable probe Clamp</td><td>Siskiyou</td><td>14030000E</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-947-346</td><td></td></tr><tr><td>petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pressurized air</td><td>Airgas</td><td>AI Z300</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC163720050</td><td></td></tr><tr><td>Self Sticking Labeling Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot)</td><td>Automate Scientific</td><td>05-14</td><td></td></tr><tr><td>Sola SM Light Engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td><td>JAX</td><td>025111</td><td></td></tr><tr><td>Student Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Probe</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6067</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Probe Holder</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6061</td><td></td></tr><tr><td>Thread</td><td>G&uuml;termann</td><td>02776</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046941</td><td></td></tr><tr><td>Two Stage Gas Regulator</td><td>Airgas</td><td>Y12FM244B580-AG</td><td></td></tr><tr><td>Tygon vinyl tubing - 1/16"</td><td>Automate Scientific</td><td>05-11</td><td></td></tr><tr><td>Valvelink8.2 digital/manual controller</td><td>Automate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System</td><td>Automate Scientific</td><td>17-pp-54</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Anased</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In de afgelopen tien jaar heeft de vooruitgang in genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GESI's) een revolutie in in vivo functionele beeldvorming bevorderd. Met behulp van calcium als een proxy voor neuronale activiteit, bieden deze technieken een manier om de reacties van individuele cellen binnen grote neuronale ensembles op een verscheidenheid aan stimuli in realtime te volgen. Wij, en anderen, hebben deze technieken toegepast om de reacties van individuele geniculate ganglionneuronen op smaakprikkels toegepast op de tongen van levende verdoofde muizen in beeld te brengen. Het geniculate ganglion bestaat uit de cellichamen van smaakneuronen die de voorste tong en het gehemelte innerveren, evenals enkele somatosensorische neuronen die de pinna van het oor innerveren. Het in beeld brengen van de smaak-opgeroepen reacties van individuele geniculate ganglion neuronen met GCaMP heeft belangrijke informatie opgeleverd over de afstemmingsprofielen van deze neuronen in wild-type muizen, evenals een manier om perifere smaak misdrainende fenotypes in genetisch gemanipuleerde muizen te detecteren. Hier demonstreren we de chirurgische procedure om het geniculate ganglion bloot te leggen, GCaMP fluorescentiebeeldacquisitie, eerste stappen voor gegevensanalyse en probleemoplossing. Deze techniek kan worden gebruikt met transgeen gecodeerde GCaMP of met AAV-gemedieerde GCaMP-expressie en kan worden gewijzigd om bepaalde genetische subsets van belang in beeld te brengen (d.w.z. Cre-gemedieerde GCaMP-expressie). Over het algemeen is in vivo calciumbeeldvorming van geniculate ganglionneuronen een krachtige techniek voor het monitoren van de activiteit van perifere smaakneuronen en biedt het aanvullende informatie aan meer traditionele chorda tympani-opnames van de hele zenuw of smaakgedragstests.

Volgens het protocol werd een transgeen Snap25-GCaMP6s-dier verdoofd, geniculate ganglia werden blootgesteld en tastant werd op de tong aangebracht terwijl video werd opgenomen. Het doel van het experiment was om te definiëren welke smaakstoffen reacties uitlokten van elke cel. Tastanten (30 mM AceK, 5 mM Kinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Citroenzuur)18 werden opgelost in DI-water en werden gedurende 2 s gescheiden door 13 s DI-water op de tong aangebracht.
<p class="jove_content...

Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

Deze techniek kan belangrijke functionele vragen beantwoorden over neuronale reacties op smaak in de geniculate ganglia, een cruciaal onderdeel van de inwendige chorda tympani smaakroute. Deze techniek kan worden gebruikt om de real-time reacties van meerdere individuele neuronen in een enkele experimentele proef te volgen, omdat cellen die per dier worden geregistreerd aanzienlijk hoger zijn dan gewoonlijk wordt waargenomen via de elektrofysiologische methode. Met de op de hoofdpost gemonteerde muis in rugligging op een verwarmingskussen, maak een twee centimeter middellijnincisie in de huid over de keel, van het borstbeen tot de kin.En trek de huid en sub-maxillaire klieren terug om de digastrische spieren volledig bloot te leggen. Na het lokaliseren van de naad in de paratracheale musculatuur, scheidt u de naad met stompe dissectie en trekt u het weefsel terug om het te openen. Snijd voorzichtig een opening in de bovenkant van de luchtpijp die groot genoeg is om een stuk polyethyleenbuis te passen zonder meer dan halverwege de diameter van de luchtpijp te snijden en steek de slang in de luchtpijp richting de longen.Verplaats de retractors om de paratracheale musculatuur vrij te

in-vivo-calcium-imaging-mouse-geniculate-ganglion-neuron-responses-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Shannonhouse, J., et al.In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (2023).The video demonstrates an in vivo calcium imaging technique to monitor neuronal activity in the dorsal root ganglia (DRG) of a transgenic mouse. DRG neurons express a calcium indicator that increases fluorescence intensity upon binding to calcium. Mechanical or thermal stimuli applied to a hind paw generate action potentials that...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse

Source: Fowler, B. E., et al. In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli. J. Vis. Exp. (2021) This video demonstrates a protocol for delivering tastants to the surgically exposed geniculate ganglion in an anesthetized mouse and using GCaMP fluorescence with epifluorescent microscopy to visualize real-time neuronal responses, aiding studies on peripheral taste signal processing.

In Vivo Imaging of Geniculate Ganglion Neuron Responses Using Epifluorescent Microscopy

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Het huidige protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming voor het meten van de reacties van ensembles van lumbale-6 DRG-neuronen op somatische en viscerale stimuli. Er kunnen grondige vergelijkingen worden gemaakt tussen neuronen die reageren op verschillende stimuli. Dit protocol is waardevol voor het onderzoeken van mechanismen van viscerale pijn en somatische stimulatie, zoals acupunctuur.

In Vivo calciumbeeldvorming van de respons van neuronen in dorsale wortelganglia op somatische en viscerale stimuli

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Een calciumbeeldvormingsbenadering maakt het mogelijk om smaakgeïnduceerde reacties in de hersenen van wakkere vliegen vast te leggen terwijl een oplossing op het labellum wordt aangebracht. Primaire smaakresponsen in Drosophila melanogaster worden als voorbeeld gebruikt, maar dit protocol kan worden aangepast om stroomafwaartse neuronen of andere soorten te bestuderen.

In vivo Calciumbeeldvorming van smaakgeïnduceerde neurale reacties bij volwassen Drosophila

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Leer in vivo calciumbeeldvorming van geniculate ganglion neuronen in muizen met GCaMP. Deze methode monitort real-time smaakprikkelreacties op cellulair niveau voor inzicht in perifere gustatoire functie.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

Meer video's verkennen