Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Deze methode gebruikt fluorescentie om te bepalen of een eiwit wordt overgedragen aan biologisch belangrijke liqiden tussen synthetische membraan en zo bijdragen aan de verdeling van deze lipiden in eukaryote cellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de extractie en het transport van een natuurlijk lipide door een eiwit, het vereist en fluorescentiecellen en liposomen die gemakkelijk te maken zijn. Deze methode kan worden gebruikt en aangepast om inzicht te krijgen in de cellulaire biologie door eiwitten achter de verdeling van enkele essentiële lipiden tussen orgaan en membranen.

Visuele demonstratie is van cruciaal belang om uit te leggen hoe real-time metingen van lipidenoverdracht door fluorescentie kunnen worden uitgevoerd. Dus de procedure zal ook Maud Magdeleine demonstreren, een ingenieur voor mijn laboratorium. Begin met het bereiden van vers gefilterde en ontgaste HEPES kaliumacetaatbuffer, aangevuld met één millimolair magnesiumchloride om HKM-buffer te vormen.

Bereid vervolgens liposomen die alleen van PC zijn gemaakt of bovendien zijn gedopeerd met twee molaire procent PS of PI (4) P. Plaats nu de kolf op een roterende verdamper om het lipide onder vacuüm te drogen. Meng in één put liposomen met twee molaire procent PS met lipidensensor, NBD-C2 Lact, tot een eindconcentratie van 250 nanomolair en een volume van 100 microliter.

Vul een tweede put met dezelfde hoeveelheid liposoom en NBD-C2 lact gemengd met drie micromolaire lipide transfer eiwit of LTP. Vul een derde put met 250 nanomolaire NBD-C2 lact gemengd met pure 80 micromolaire PC liposomen en een vierde put met pure 80 micromolaire PC liposomen. Herhaal deze stappen om drie extra series van vier putten voor te bereiden.

Plaats vervolgens de multi-well plaat in de fluorescentielezer. Registreer voor elke put een NBD-spectrum van 505 tot 650 nanometer met een bandbreedte van vijf nanometer bij excitatie bij 490 nanometer bij 25 graden Celsius. Trek voor elke reeks het opgenomen spectrum met alleen liposomen af van de andere spectra.

Bereid voor de PI(4)P extractietest liposomen gedopeerd met twee molaire procenten fosfatidylinositol-4-fosfaat en voer metingen uit met de NBD-PH FAPP-sonde. Voer controle-experimenten uit en bepaal het extractiepercentage. Na het afwerken vullen liposomen een buisje Met deze geëxtrudeerde liposomen.

Bereid vers ontgaste en gefilterde HKM-buffer en bewaar de buizen met geëxtrudeerde liposomen op kamertemperatuur. Wikkel tubes met liposomen met rhodamine gelabeld fosfatidylethanolamine in aluminiumfolie en bewaar ze in een ondoorzichtige doos om fotobleking te voorkomen. Stel de temperatuur in tussen 25 en 37 graden Celsius en pas de excitatiemonochromemeters aan op 460 nanometer met een korte bandbreedte van één tot drie nanometer en emissie op 530 nanometer met een grote bandbreedte van meer dan 10 nanometer.

Stel de acquisitietijd in op vijfentwintig minuten met de tijdresolutie van maximaal één seconde. Verdun in het kwartscuvet 30 microliter van de LA liposoomsuspensie en NBD-C2 lactbouillonoplossing en voorwarm HKM-buffer om een monster van 570 microliter te bereiden dat 200 micromolaire totale lipiden en 250 nanomolaire of NBD-C2 lact bevat. Voeg een kleine magnetische roerstaaf toe en plaats de cuvette in de fluorometerhouder.

Zodra het monster thermisch in evenwicht is, activeert u de meting. Voeg na één minuut 30 microliter van de LB liposoomsuspensie toe aan het monster. Injecteer na drie minuten LTP in het monster zodat de uiteindelijke concentratie van de LTP 200 nanomolair is en verwerf vervolgens het signaal gedurende de resterende 21 minuten.

Voer een parallel experiment uit om het NBD-signaal te normaliseren. Meng 30 microliter LA-evenwichtsliposoomsuspensie met 250 nanomolaire NBD-C2 lact in HKM-buffer bij een eindvolume van 570 microliter. Injecteer na één minuut 30 microliter LB-evenwichtsliposoomsuspensie.

Converteer de kinetische curven gemeten met een LTP van belang om de hoeveelheid PS te bepalen die in de loop van de tijd van LA naar LB liposomen wordt overgedragen. Normaliseer vervolgens elk gegevenspunt van de curve. Voer het PI(4)P-experiment uit met dezelfde instellingen en omstandigheden voor de vloerstraler als voor de PS-overdrachtstest.

Meng in de cuvette 30 microliter lb liposoomsuspensie en NBD-PH FAPP-sonde met voorverwarmde HKM-buffer om een eindvolume van 570 microliter te verkrijgen. Zodra de thermische evenwichtslibratie van het monster is bereikt, start u de meting. Injecteer na één minuut 30 microliter LA liposoom suspensie.

Injecteer na drie minuten de LTP van belang en neem het signaal op. Voer een tweede experiment uit om het NBD-signaal te normaliseren. Meng 30 microliter lb evenwicht liposoom suspensie met 250 nanomolaire NBD-PH FAPP en 570 microliter HKM-buffer.

Injecteer na één minuut 30 microliter LA-evenwichtsliposoomsuspensie. Converteer de kinetische curven om de hoeveelheid PI(4)P te bepalen die in de loop van de tijd van LB naar LA liposomen wordt overgedragen en normaliseer vervolgens elk gegevenspunt. Om te kwantificeren in hoeverre een LTP efficiënt is.

Voer een lineaire regressie uit van de eerste gegevenspunten van de overdrachtskinetiek om een helling te verkrijgen. Deel de hellingswaarde door de LTP-concentratie in het reactiemengsel om het aantal lipidemoleculen te bepalen dat per eiwit per tijdseenheid wordt overgedragen. Efficiënte terugwinning van C2-lact uit de kralen werd geverifieerd met SDS-pagina-analyse.

Het ultraviolette zichtbare absorberende spectrum van C2-lact gelabeld met NBD bevestigde dat alle C2-lactmoleculen waren gelabeld met een NBD-groep. De zuiverheid van NBD-C2 lact en de fluorescentie ervan werden bepaald door SDS-pagina-analyse. De fluorescentie van NBD-C2 lact of NBD-PH FAPP was maximaal wanneer alleen liposomen met PS of PI(4)P werden gebruikt voor incubatie, wat aangeeft dat de sensor membraangebonden was.

Een lage fluorescentie werd gezien toen Osh6p ook aanwezig was, wat aangeeft dat dit eiwit efficiënt PS of PI(4)P uit liposomen heeft geëxtraheerd. De resultaten van een PS-overdrachtstest met Osh6p als LTP worden weergegeven. De gemiddelde kinetische curven van PS-overdracht van LA-liposomen naar LB-liposomen, gedopeerd of niet gedopeerd met fosfatidylinositol-4-fosfaat werden berekend.

De gemiddelde initiële PS-transportsnelheid werd bepaald aan de hand van drie verschillende experimenten. Evenzo worden hier resultaten weergegeven van een PI(4)P-overdrachtstest met Osh6p als LTP. Samen met de gemiddelde kinetische curven verkregen na signaalnormalisatie.

Gemiddelde overdrachtssnelheden werden gemeten met LA-liposomen die wel of niet gedopeerd waren met PS. Gebruik bij het uitvoeren van dit protocol verse buffer en bereid dezelfde dagen voor. Minimaliseer de lichtexpositie van fluorescerende liposomen en eiwitten, gebruik goed gezuiverde NBD-gelabelde eiwitten en houd ze op ijs. kan worden bevestigd door ps- en pi(4)p-overdracht tussen organel in de prokaryote cel te meten met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende lipidesensoren.

Deze techniek effent een weg naar een beter begrip van PS en PI(4) zijn verdeeld in de cel, en hun activiteit ondergaan specificiteit van verschillende LTPS.