Name: Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer een 3D epidermale sferoïde cultuurmethode met hoge doorvoer voor het modelleren van keratinocytstamcelplasticiteit. Dit protocol maakt gedetailleerd onderzoek naar epitheliale celgedrag en ziekteprocessen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bood toegang tot beeldvormings- en celsorteerapparatuur en technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door subsidie 1R21CA201853. De MCF en de IRF ontvangen gedeeltelijke steun van NIH-subsidie P20GM103499, SC INBRE. Het MCF ontvangt ook steun van NIH-subsidie P20GM109091. Yvon Woappi werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-06A1 (PREP) en R25GM076277 (IMSD), en door een Fellowship door het Grace Jordan McFadden Professors Program aan UofSC. Geraldine Ezeka en Justin Vercellino werden ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-10A1 (PREP) bij UofSC. Sean M. Bloos werd ondersteund door de Magellan Scholar Award 2016 bij UofSC.

Het protocol voor het verzamelen en hanteren van huidmonsters en isolatie van menselijke keratinocyten is herzien door de IRB van de Universiteit van South Carolina (UofSC) en geclassificeerd als "onderzoek waarbij geen menselijke proefpersonen betrokken waren", omdat de voorhuidmonsters chirurgische teruggooi waren die werden geproduceerd tijdens routinechirurgische procedures (besnijdenis van pasgeboren jongens) en volledig verstoken waren van identificerende informatie. Het protocol werd ook regelmatig herzien en goedgekeurd door het UofSC Biosafety Committee en al het laboratoriumpersoneel onderging een opleiding in laboratoriumbioveiligheid. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de veiligheids- en ethische normen van UofSC.
1. Isolatie en kweek van menselijke keratinocyten uit neonatale voorhuidweefsel
<ol><li>Bereid het wasmedium voor door 0,1 M HEPES-buffer toe te voegen aan 500 ml KSFM-medium en stel het in op een pH van 7,2. Steriliseer medium in een vacuümfilter van 500 ml (poriegrootte van 0,22 μm). MCDB 153-LB basaal medium kan ook worden gebruikt als alternatieve wasoplossing in plaats van KSFM.</li>
	<li>Was in een laminaire stromingskap neonatale voorhuid met 5 ml wasmedia in een conische buis van 50 ml. Herhaal dit twee keer.</li>
	<li>Breng gewassen voorhuid over op een steriele petrischaal. Schraap met behulp van een scalpel en tang vet en losse bindweefsels van de huidlaag af. Spoel de voorhuid opnieuw met 5 ml wasmedia in een conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Plaats de voorhuid epidermis naar boven in een 6-put plaat met 2 ml dispase enzym verdund in wasmedia (50 U/ml).</li>
	<li>Breng de plaat gedurende 4 uur over in een incubator (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Verwijder de voorhuid uit de incubator en breng deze onder steriele omstandigheden over in een petrischaal. Scheid met behulp van een fijnpuntige tang de opperhuid van de dermislaag.</li>
	<li>Plaats epidermis in een conische buis van 15 ml met 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA. Verpletter met behulp van een serologische pipet van 5 ml de drijvende epidermis mechanisch. Incubeer gedurende 15 min bij 37 °C met periodieke vortexing gedurende 5 s om de 5 min.</li>
	<li>Voeg na incubatie 2 ml soja trypsineremmer toe en meng door pipetten om de trypsine te neutraliseren.</li>
	<li>Centrifugeer celsuspensie gedurende 2 min bij 450 x gen vervolgens gedurende 8 min bij 250 x g.</li>
	<li>Verwijder drijvend vuil met een tang en zorg ervoor dat u de celkorrel niet loslaat. Aspireer voorzichtig supernatant uit de celkorrel.</li>
	<li>Resuspend pellet in 12 ml compleet KSFM-scm medium en plaat in een schaal van 10 cm. Incubeer de schotel 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Verwijder het medium de volgende dag met een aspirerende pipet en vervang het door 12 ml complete KSFM-scm. Herhaal dit op dag 4 en 7.</li>
	<li>Om een optimale groei van normale menselijke keratinocyt (NHKc) culturen te behouden, passage cellen 1:5 op dag 10 om te voorkomen dat cellen bereiken meer dan 80% confluency.</li>
</ol>2. Het genereren van huid epidermosfeer culturen in vitro
<ol><li>Bereid een 5% agarosemengsel door 2,5 g agarose toe te voegen aan 50 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), in een glazen fles van 50 ml. Autoclaaffles onder vloeibare cyclus. Laat afkoelen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Om borden te bereiden, plaatst u de gekoelde glazen fles met agarose-oplossing in een plastic bekerglas van 1 L gevuld met 200 ml gedeïoniseerd water (dH2O). Smelt het agarosemengsel gedurende maximaal 2 minuten in een magnetron van onderzoekskwaliteit en meng de agar om de 60 s door de fles voorzichtig van links naar rechts te kantelen. LET OP: Het smelten van agar in de magnetron zorgt ervoor dat de kolfcontainer extreem heet wordt, wat resulteert in drukopbouw. Laat drukopbouw om de 30 s los. Draag geschikte beschermingsmiddelen om letsel te voorkomen.</li>
	<li>Voeg 3 ml gesmolten 5% agarose toe aan 12 ml KSFM-scm voorverwarmd tot 42 °C voor een eindconcentratie van 1% agarose (wt/vol). Optioneel: verwarm de serologische pipetten en pipettips voor om voortijdige polymerisatie van de zachte agar te voorkomen.</li>
	<li>Pipetteer snel 200 μL van de 1% agarmix in individuele putten van een 96-put ronde bodemplaat met behulp van een meerkanaals pipettor (figuur 1A). Laat de plaat 4 uur in een steriele omgeving bij 25 °C staan om agarose volledig te laten polymeriseren. OPMERKING: Het experimenteren kan hier worden gestopt en de volgende dag worden voortgezet. Gepolymeriseerde agaroseplaten kunnen tot 24 uur op 37 °C of tot 4 °C worden gehouden wanneer ze worden afgedicht met parafilmfolie. Warme plaat tot 37 °C in een bevochtigde incubator gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.</li>
	<li>Passage sferoïdevormende NHKc door aspirerende media en wascellen in 2 ml PBS. Aspireer PBS en voeg 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe aan gewassen cellen. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C of totdat alle cellen volledig loskomen. Voeg 2 ml soja trypsine remmer toe aan de plaat en spoel cellen van de plaat af in een buis van 15 ml. Centrifugeer op 250 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspend pellet in 1 mL of PBS. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van trypan blauwe kleuring en een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller.</li>
	<li>Aliquot 2 x 104 NHKc in 100 μL KSFM-scm en zaad in individuele putten van eerder bereide 96-wells ronde bodemplaat. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop, analyseert u goed gezaaid voor epidermosfeervorming. OPMERKING: Menselijke epidermosfeeren van normale menselijke keratinocyten kunnen in 3D-suspensiecultuur tot 96 uur levensvatbaar blijven, zij het met een aanzienlijke afname van de levensvatbaarheid van cellen (figuur 2).</li>
</ol>3. Epidermale sferoïde re-plating assay
<ol><li>24-48 uur na 3D epidermosfeervorming, voeg 4 ml voorverwarmde KSFM-scm toe aan een schaal van 6 cm. Gebruik een brede boor van 1 ml pipetpunt om een enkele sferoïde op de plaat over te brengen, zodat deze niet uit elkaar valt. U kunt ook een pipetpunt van 1 ml verbreden met een steriel scheermesje om de punt te snijden.</li>
	<li>Incubeer de plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Analyseer gezaaide sferoïde voor bevestiging aan de bodem van de plaat en observeer voor het vermeerderen van cellen met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop (figuur 3). Voer cellen om de 96 uur door voorzichtig 2 ml van de media in de plaat te verwijderen en langzaam 2 ml verse KSFM-scm media aan de plaat toe te voegen.</li>
	<li>Passage spheroid-afgeleide (SD) NHKc zodra ze 70-80% samenvloeiing bereiken en doorgaan met het maken van een keuzetest. Monitor SD-NHKc regelmatig om te voorkomen dat cellen volledige samenvloeiing in cultuur bereiken, omdat dit resulteert in voortijdige differentiatie en celgroeistilstand (Figuur 3E-F).</li>
	<li>De epidermale sferoïde replating assay modellen keratinocyt-gemedieerde wondherstel door het vastleggen van elk van de belangrijkste opeenvolgende fasen van epidermale regeneratieve plasticiteit: a) homeostatisch onderhoud, b) differentiatie halt /omkering c) stress lineage mobiliteit, en d) weefselherstel (Figuur 1B; Tabel 2). Deze test kan ook worden gebruikt om celpopulaties voor organotypische vlotculturen te produceren of om HPV-gemedieerde neoplasie te modelleren, zoals aangetoond in ons vorige werk 11,12.</li>
</ol>4.3D fluorescentiecel het volgen
<ol><li>In een schaal van 6 cm, transfect sferoïde-vormende 2D monolayer NHKc culturen met 1 μg pMSCV-IRES-EGFP plasmide vector met het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP) gen. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid) microscoop(figuur 4A). OPMERKING: Het is belangrijk dat transfectie wordt voltooid in serumvrije antibioticavrije omstandigheden.</li>
	<li>Zonder transfectiemix te verwijderen, voegt u 2 ml voorverwarmde KSFM-scm toe aan cellen. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Aspireer alle transfectiemedia uit plaat- en voedingscellen met 3 ml voorverwarmde KSFM-scm. Beoordeel op aanwezigheid van EGFP-uitdrukkende cellen onder het FITC-kanaal van een fluorescerende microscoop.</li>
	<li>Passage en zaad 2 x 104 EGFP-getransfecteerde cellen in individuele putten van een eerder bereide 96-put ronde bodemplaat. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid). Visualiseer en bewaak egfppos spheroid celbeweging onder het FITC-kanaal van een fluorescentiemicroscoop (figuur 4B-C).</li>
	<li>Voeg 24 uur na het plateren 3 ml voorverwarmde KSFM-scm toe aan een schaal van 6 cm. Gebruik een brede boor van 1 ml pipetpunt om een enkele sferoïde op de plaat over te brengen, zodat deze niet uit elkaar valt. Incubeer plaat 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Observeer en analyseer de voortplanting van SD-NHKcEGFP met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Voer cellen om de 96 uur door voorzichtig 2 ml de media in de plaat te verwijderen en langzaam 2 ml verse KSFM-scm media aan de plaat toe te voegen.</li>
	<li>Oogst SD-NHKCEGFP voor FACS-isolatie of keuzetesten.</li>
</ol>5. Karakterisering van sferoïde-afgeleide (SD) subpopulaties door FACS
<ol><li>Passage SD-NHKc en bijbehorende autologe 2D monolayer culturen door het aanzuigen van oude media en wascellen in 2 ml PBS. Verwijder PBS en voeg 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe aan gewassen cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat alle cellen volledig loskomen.</li>
	<li>Voeg 2 ml soja trypsine remmer toe aan de plaat en breng cellen over in een buis van 15 ml. Centrifugeer op 250 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspend pellets in 1 mL of PBS. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met trypanblauw en een geautomatiseerde celteller van hemocytometer.</li>
	<li>Aliquot 100 μL met 0,1-4 x 106 NHKc-cellen tot 1,5 ml microcentrifugebuizen. Plaats de buis op ijs in een donkere omgeving, gecreëerd door felle lichten in de laminaire kap uit te schakelen.</li>
	<li>Voeg 2 μL FITC-geconjugeerde anti-integrinα6 en 2 μL PE-geconjugeerde anti-EGFR toe aan buizen om een verdunning van 1:50 te bereiken. Bereid een buis voor zonder toegevoegde antilichamen om te dienen als de niet-aangetaste controle. Incubeer buizen op ijs in het donker of bij 4 °C gedurende 30 minuten. Het gebruik van kralen of een huid SCC lijn kan dienen als positieve controle, als huid SCC cellen uitdrukken verhoogde niveaus van integrinα6 en EGFR.</li>
	<li>Voer flowcytometrieanalyse uit met behulp van flowcytometer naar keuze met geschikte lasers.</li>
	<li>Gebruik de negatieve en positieve bedieningselementen om poorten te maken. Sorteer de subpopulatie van integrinα6hi/EGFRlo cellen; dit is de epidermale stamcelfractie. Integrinα6hi/EGFRhi cellen zijn de proliferatieve voorloper celfractie. De integrinα6lo/EGFRhi cellen zijn de geëngageerde voorlopercelfractie (Figuur 4D). Sorteerbuis(en) moet(en) ten minste 1 ml ijskoude KSFM-scm bevatten.</li>
	<li>Test op proliferatieve capaciteit van gesorteerde celsubpopulaties door de inhoud van elke respectieve sorteerbuis over te brengen in een conische buis van 15 ml die 10x het volume gesorteerde cellen in PBS bevat. OPMERKING: Het is belangrijk om alle cellen die aan de rand zijn bevestigd te verwijderen door de wand van de sorteerbuis(en) meerdere keren te pipetten, omdat keratinocyten zich daar vaak kunnen hechten.</li>
	<li>Centrifugeer 15 ml buizen op 250 x g gedurende 5 min. Verwijder supernatant en resuspend pellet in 12 ml KSFM-scm. Breng de geresuspendeerde cellen over in een plaat van 6 cm en incubeer 's nachts (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).</li>
	<li>Verwijder de volgende dag media in platen en voeg 8 ml voorverwarmde KSFM-scm toe. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid. Voer cellen met een medium van 12 ml om de 3 dagen opnieuw tot 70-80% samenvloeiing (figuur 4E).</li>
</ol>6. Immunofluorescentie en kleuring van epidermosfeer voor basale stamcelmarkers
<ol><li>Breng epidermosfeer over op coverslips bedekt met polylysine. Laat SD-NHKc zich voortplanten tot 75% samenvloeiing.</li>
	<li>Was de cellen tweemaal in PBS (4 °C) gedurende elk 5 minuten.</li>
	<li>Fix cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Permeabiliseer cellen met 0,5% Triton X-100 in 1% glycine. Blokkeer met 0,5% BSA en 5% geitenserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer monsters met antilichamen tegen P63 (1:200) en cytokeratine 14 (1:200) in blokkeeroplossing 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Was driemaal met PBS (4 °C) met Tween 20 (PBST), gevolgd door incubatie met FITC-en Alexa 568-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:1000 verdunning).</li>
	<li>Vlekkernen met 4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (1:5000 verdunning) vóór montage van cellen.</li>
	<li>Observeer cellen met behulp van een fluorescentie-compatibele microscoop met FITC- en PE-laserlijnen (figuur 4F).</li>
</ol>7. Transcriptieanalyse van epidermosfeerculturen
<ol><li>Het instellen van drievoudsplaten van NHKc-culturen met een lage passage om RNA te isoleren, kan afkomstig zijn van monolaag-, sferoïde- en sferoïde-afgeleide culturen uit dezelfde autologe cellijn.</li>
	<li>Pool 3-5 overeenkomstige epidermospheres in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Oogst afzonderlijk autologe SD-NHKc- en 2D-monolaagculturen.</li>
	<li>Isoleer het totale RNA van alle drie de groepen.</li>
	<li>Voer omgekeerde transcriptie uit met 1 μg totaal RNA.</li>
	<li>Voer met behulp van cDNA real-time PCR uit, met GAPDH als interne controle (Tabel 1).</li>
	<li>Valideer de productgrootte van amplicon door agarosegelelektroforese (2% v/v). OPMERKING: Voor transcriptomische profilering van epidermosfeerculturen met behulp van microarrayanalyse van het hele genoom, isoleert u het totale RNA van massaculturen van één NHKc-donor en overeenkomstige SD-NHKc van dezelfde donor, in zes replica's elk.</li>
	<li>Beoordeel de RNA-kwaliteit met behulp van een bioanalyzer om RNA Integrity Numbers (RIN) te bereiken, variërend van ten minste 9,0 tot 9,1.</li>
	<li>Voer microarray-experimenten uit door het totale RNA-monster te versterken en te biotinyleren.</li>
	<li>Transcriber 100 ng totaal RNA per monster in ds-cDNA met behulp van NNN random primers die een T7 RNA polymerase promotorsequentie bevatten.</li>
	<li>Voeg T7 RNA-polymerase toe aan cDNA-monsters om RNA te versterken en kopieer RNA naar ss-cDNA. Degradatie overtollige RNA met behulp van RNase H.</li>
	<li>Fragment sscDNA moleculen en label met biotine.</li>
	<li>Bemonstering van etiketten gedurende 16 uur bij 45 °C versterken.</li>
	<li>Hybridiseer monsters met behulp van een hybridisatieoven en een was- en vlekkenset.</li>
	<li>Was en bevlek gehybridiseerde arrays.</li>
	<li>Arrays scannen met behulp van een systeem- en computerwerkstation.</li>
	<li>Na voltooiing van arrayscans importeert u CEL-bestanden (Probe Cell Intensity) in expressieconsolesoftware en verwerkt u op genniveau met behulp van een bibliotheekbestand en het Robust Multichip Analysis (RMA)-algoritme om WKK-bestanden te genereren.</li>
	<li>Nadat u de gegevenskwaliteit in Expression Console hebt bevestigd, importeert u WKK-bestanden met log2-expressiesignalen voor elke sonde in een transcriptoomanalysesoftware om celtypespecifieke transcriptiereacties te analyseren met behulp van eenrichtingsanalyse tussen onderwerpen van variantie.</li>
</ol>8. Beoordelen van SD-NHKc kolonievormende efficiëntie
<ol><li>Aspireer media uit platen wanneer cellen 70-80% samenvloeiing bereiken. Was de cellen driemaal in PBS (4 °C) gedurende elk 5 minuten.</li>
	<li>Fix cellen met 3 ml 100% methanol (4 °C) gedurende 15 min. Was drie keer in PBS gedurende elk 5 minuten.</li>
	<li>Vlekcellen in 3 ml 10% Giemsa gedurende 30 min. Was drie keer in PBS gedurende elk 5 minuten. Laat cellen 's nachts aan de lucht drogen.</li>
	<li>Analyseer de kolonievorming de volgende dag en kwantificeer het aantal verkregen kolonies</li>
</ol>9. Bepaal SD-NHKc populatie verdubbeling
<ol><li>Passage SD-NHKc en bijbehorende autologe 2D monolayer culturen door het aanzuigen van oude media en wascellen in 2mL PBS. Verwijder PBS en voeg 2 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe aan gewassen cellen. Incubeer gedurende 5 minuten of totdat alle cellen volledig loskomen (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Voeg 2 ml soja trypsine remmer toe aan de plaat en breng cellen over in een buis van 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer op 250 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en de resuspend pellet in 12 ml KSFM-scm.</li>
	<li>Zaadcellen met een lage dichtheid 1-2 x 104 NHKc in individuele gerechten van 10 cm en incuberen 's nachts (37 °C, 5% CO2,95% vochtigheid).</li>
	<li>Voerplaten met 8 ml KSMF-scm de volgende dag. Voer om de 4 dagen tot ten minste 25% samenvloeit en voer vervolgens om de 2 dagen.</li>
	<li>Serieel passage cellen 1:5 in 60 cm gerechten totdat celproliferatie capaciteit is uitgeput. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen door blauwe kleuring te proberen. Bepaal de populatieverdubbeling bij elke passage met behulp van de formule: log(N/N0) / log2, waarbij N het totale celnummer vertegenwoordigt dat bij elke passage is verkregen en N0 het aantal cellen vertegenwoordigt dat aan het begin van het experiment is geplateerd.</li>
</ol>

<ol><li>Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerous+keratinocyte+subtypes+involved+in+wound+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization.</a> Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).</li>
<li>Dekoninck, S., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+dynamics%2C+migration+and+plasticity+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).</li>
<li>Byrd, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+within+Stratified+Epithelial+Stem+Cell+Populations+Maintains+the+Oral+Mucosa+in+Response+to+Physiological+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress.</a> Cell Stem Cell. , (2019).</li>
<li>Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomorrow+today%3A+organ-on-a-chip+advances+towards+clinically+relevant+pharmaceutical+and+medical+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).</li>
<li>Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Multi-Cellular+Spheroids+for+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2000608(2020).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-bearing+human+skin+generated+entirely+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells.</a> Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-stage+bilayer+tissue-engineered+skin+substitute+formed+by+adult+skin+progenitor+cells+produces+an+improved+skin+structure+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407(2020).</li>
<li>Borena, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+capacity+as+an+enrichment+strategy+for+epithelial-like+stem+cells+from+equine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).</li>
<li>Vollmers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-+and+three-dimensional+culture+of+keratinocyte+stem+and+precursor+cells+derived+from+primary+murine+epidermal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).</li>
<li>Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere+formation+increases+the+ability+of+cultured+human+dermal+papilla+cells+to+induce+hair+follicles+from+mouse+epidermal+cells+in+a+reconstitution+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).</li>
<li>Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Properties+of+Normal+Human+Keratinocytes+Determine+Transformation+Responses+to+Human+Papillomavirus+16+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA.</a> Journal of Virology. 92 (11), (2018).</li>
<li>Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+3D+spheroid+cultures+of+human+neonatal+keratinocytes+have+enhanced+regenerative+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties.</a> Stem Cell Research. , (2020).</li>
<li>Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Epigenetic+Mark+5-hmC+in+Psoriasis%3A+Implications+for+Epidermal+Stem+Cell+Dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation.</a> Journal of Investigative Dermatology. , (2020).</li>
<li>Kuo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+targeting+versatile+tissue+bioassays+using+a+PDMS-based+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array.</a> Scientific Reports. , (2017).</li>
<li>Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSE94244+-+Expression+data+from+normal+human+spheroid-forming+keratinocytes+in+monolayer+mass+culture+and+from+corresponding+cornified-like+spheroid+ring+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Omnibus+%28GEO%29%22%5BJournal%5D)">GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures.</a> Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële relaties om openbaar te maken.

Het gebruik van 3D-sferoïde kweeksystemen heeft een breed nut gehad bij het beoordelen van celstamheid. Het is aangetoond dat deze systemen de verrijking van weefselstamcellenverbeteren 13, maar hun nut voor de studie van menselijke epidermale stamcellen is beperkt onderzocht. Hier beschrijven we een strategie voor het verrijken van menselijke keratinocytstamcellen met behulp van 3D-cultuurtechnieken. In dit systeem worden NHKc gekweekt als zelfassemblage multicellulaire sferoïde suspensuspensen, ...

Het zoogdier gelaagde epitheel is de meest complexe epitheelarchitectuur in alle levende systemen en is meestal onderhevig aan schade en letsel. Als beschermend weefsel is gelaagd epitheel geëvolueerd om een complexe en effectieve weefselschaderespons te genereren. Bij letsel moeten deze cellen afstammingsplasticiteitsprogramma's activeren, waarmee ze naar de gewonde plaats kunnen migreren en reparatie1,2,3kunnen uitvoeren. Deze veelzijdige reactie vindt plaats in verschillende opeenvolgende stappen die slecht begrepen blijven.
Een belangrijk obstakel bij het bestuderen van het ingewikkelde proces van epitheliale regeneratie ligt in het gebrek aan modelsystemen met hoge doorvoer die dynamische cellulaire activiteiten kunnen vastleggen in gedefinieerde stadia van celregeneratie. Hoewel in vivo muismodellen relevant inzicht bieden in wondgenezing en het menselijk regeneratieve proces het meest nauwkeurig samenvatten, vereist hun ontwikkeling moeizame inspanningen en aanzienlijke kosten, waardoor hun doorvoercapaciteit wordt beperkt. Er bestaat daarom een kritieke behoefte aan het opzetten van systemen die functioneel onderzoek van menselijke epitheliale weefselregeneratie op hoge doorvoerschaal mogelijk maken.
In de afgelopen jaren zijn verschillende pogingen gedaan om de schaalbaarheidsuitdaging aan te gaan. Dit wordt gezien door een grote uitbreiding van innovatieve in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen die de in vivo regeneratieve context nauw nabootsen. Dit omvat vooruitgang in organ-on-chip4, sferoïde5, organoïde6en organotypische culturen7. Deze 3D-celgebaseerde systemen bieden elk unieke voordelen en bieden verschillende experimentele beperkingen. Tot op heden blijft sferoïde cultuur het meest kosteneffectieve en meest gebruikte 3D-celcultuurmodel. En hoewel verschillende rapporten hebben aangegeven dat sferoïde culturen kunnen worden gebruikt om huidstamcelkenmerken te bestuderen, zijn deze studies grotendeels uitgevoerd met dierlijk weefsel8,9, of met huidfibroblasten10, met vrijwel geen rapporten die de regeneratieve eigenschappen van menselijke epidermale sferoïdeculturen grondig karakteriseren. In dit protocol beschrijven we de functionele ontwikkeling, cultuur en het onderhoud van epidermale sferoïde culturen van normale menselijke keratinocyten (NHKc). We beschrijven ook het nut van dit systeem om de sequentiële fasen van epidermale regeneratie en keratinocytstamcelplasticiteit in vitro te modelleren.

<table><tbody><tr><td>Affymetrix platform</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>Voor microarray experimenten</td></tr><tr><td>Affymetrix&rsquo;s HuGene-2_0-st bibliotheekbestand</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>Proces</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Voor microarray experimenten</td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Gebruikt voor RNA isolatie</td></tr><tr><td>Analysis Console Software versie 3.0.0.466</td><td></td><td></td><td>Analyseer celtype specifieke transcriptiereacties met behulp van eenrichtings tussen-onderwerp analyse van variantie</td></tr><tr><td>BD FACSAria II flow cytometer</td><td>Beckman</td><td></td><td>Voor flow cytometrie</td></tr><tr><td>Console Software versie 3.0.0.466/Expression console Software</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor het bevestigen van gegevenskwaliteit</td></tr><tr><td>Cytokeratin 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>Voor cel media</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-integrine&alpha;6</td><td>Abcam</td><td>ab30496</td><td>Voor FACS analyse</td></tr><tr><td>GeneChip Command Console 4.0 software</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor het bevestigen van gegevenskwaliteit</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor het wassen en kleuren van gehybridiseerde arrays</td></tr><tr><td>GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor hybridisatie en amplificatie van totaal RNA</td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization Oven 640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor hybridisatie en amplificatie van totaal RNA | Versterk gelabelde monsters</td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization Wash, en Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor het wassen en kleuren van gehybridiseerde arrays</td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G systeem</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Scannen van gehybridiseerde arrays</td></tr><tr><td>GeneChip WT PLUS Reagent Kit</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor amplificatie van biotinylering van totaal RNA</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8910</td><td>Voor cel media</td></tr><tr><td>Human Epidermal Growth Factor (hEGF)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8916</td><td>Voor cel media</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Millipore Sigma</td><td>9011-M</td><td>Voor cel media</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708880</td><td>Gebruikt voor RT-qPCR</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>Gebruikt voor RT-qPCR</td></tr><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005041</td><td>Aangevuld met 1% Penicilline/Streptomycine, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0,4% boviene serum albumine (BSA), en 4 &micro;g/ml insulin</td></tr><tr><td>KSFM-scm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005042</td><td>Aangevuld met 1% Penicilline/Streptomycine, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0,4% boviene serum albumine (BSA), en 4 &micro;g/ml insulin</td></tr><tr><td>MCDB 153-LB basaal medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>MCDB 153-LB basaal media met HEPES buffer</td></tr><tr><td>NEST Scientific 1-Well Cel Cultuur Chamber Slide, ZWARTE Muren op Glas Slide, 6/PK, 12/CS</td><td>Stellar Scientific</td><td>NST230111</td><td>Voor immunokleuring</td></tr><tr><td>P63</td><td>Thermo Scientific</td><td>703809</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd anti-EGFR ( San Jose, CA; catalogusnummer )</td><td>BD Pharmingen</td><td>555997</td><td>Voor FACS analyse</td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-EGFP plasmide vector</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>Voor transfectie</td></tr><tr><td>Promega TransFast kit</td><td>Promega</td><td>E2431</td><td>Voor transfectie</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Voor microarray experimenten</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Steriele Single Use Vacuum Filter Units</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-63D</td><td>Voor cel media</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 135 fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Gebruik met Axiovision Rel. 4.5 software</td></tr></tbody></table>

het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epitheliale dysregulatie is een knooppunt voor een verscheidenheid aan menselijke aandoeningen en kwalen, waaronder chronische wondvorming, ontsteking en meer dan 80% van alle menselijke kankers. Als voeringsweefsel is het huidepitheel vaak onderhevig aan letsel en heeft het zich evolutionair aangepast door de cellulaire plasticiteit te verkrijgen die nodig is om beschadigd weefsel te herstellen. In de loop der jaren zijn verschillende inspanningen geleverd om epitheliale plasticiteit te bestuderen met behulp van in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen. Deze inspanningen zijn echter beperkt in hun vermogen om de verschillende fasen van epitheliale celplasticiteit samen te vatten. We beschrijven hier een protocol voor het genereren van 3D epidermale sferoïden en epidermale sferoïde-afgeleide cellen van primaire neonatale menselijke keratinocyten. Dit protocol schetst het vermogen van epidermale sferoïde culturen om functioneel verschillende stadia van keratinocyt generatieve plasticiteit te modelleren en toont aan dat epidermale sferoïde re-plating heterogene normale menselijke keratinocyten (NHKc) culturen kan verrijken voor integrinα6hi/EGFRlo keratinocyt subpopulaties met verbeterde stamachtige kenmerken. Ons rapport beschrijft de ontwikkeling en het onderhoud van een systeem met hoge doorvoer voor de studie van de plasticiteit van keratinocyt en epidermale regeneratie van de huid.

Tijdens de huidepdermosfeertest worden NHKc-culturen gezaaid in met agarose bedekte putten van een 96-putplaat (figuur 1A). Sferoïdevormende cellen moeten zichzelf binnen 48 uur aggregeren. Autonome sferoïde vorming kan al na 24 uur worden beoordeeld met behulp van een standaard omgekeerde fasecontrastmicroscoop. huid epidermosfeer vorming en re-plating assay model verschillende fasen van epidermale weefsel regeneratie (Figuur 1B). Figuur 2<...

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Dit protocol presenteert een nieuwe methode voor de teelt en het onderhoud van epidermale bolculturen, en de strategie om ze nauwkeurig te onderzoeken met behulp van de sferoïde replating assay. Begin met het voorbereiden van wasmedium zoals beschreven in het teksthandschrift. Was in een laminaire flowkap de neonatale voorhuid tweemaal met vijf milliliter wasmedia in een conische buis van vijf milliliter en breng de gewassen voorhuid vervolgens over in een steriele petrischaal.Schraap met behulp van een scalpel en tang vetweefsel en losse bindweefsels van de huidlaag af en spoel de voorhuid vervolgens opnieuw met wasmedia. Plaats de voorhuid epidermis kant omhoog in een zes-put plaat met twee milliliter Dispase enzym verdund in wasmedia. Breng de plaat vier uur in een incubator.Breng na incubatie de voorhuid over naar een petrischaal en gebruik een tang met fijne punt om de opperhuid van de dermislaag te scheiden. Doe de opperhuid in een conische buis van 15 milliliter met twee milliliter van 0,25% Trypsine-EDTA. Plet de drijvende epidermis met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter en incubeer deze gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met periodieke vortexing gedurende vijf seconden om de vijf minuten.Voeg na incubatie twee milliliter soja trypsineremmer toe en meng deze door pipetten om de trypsine te neutraliseren en centrifugeer vervolgens de celsuspensie. Resuspend de pellet in 12 milliliter compleet KSFM-SCM medium en bord de cellen in een schaal van 10 centimeter om 's nachts te incuberen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Verwijder het medium de volgende dag met een aspirerende pipet en vervang het door 12 milliliter complete KSFM-SCM.Herhaal dit op dag vier en zeven. Bereid 5% agarosemengsel door 2,5 gram agarose toe te voegen aan 50 milliliter PBS in een glazen fles van 100 milliliter. Autoclaaf de fles op de vloeistofcyclus en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.Om platen te bereiden, plaatst u het gekoelde glas met agarose-oplossing in een bekerglas van één liter gevuld met 200 milliliter gedeïoniseerd water. Smelt het agarosemengsel gedurende maximaal twee minuten in een magnetron van onderzoekskwaliteit en meng de agarose elke 60 seconden door de fles voorzichtig van links naar rechts te kantelen. Voeg drie milliliter gesmolten 5%agarose toe aan 12 milliliter voorverwarmde KSFM-SCM bij 42 graden Celsius voor een eindconcentratie van 1%agarose.Voeg 200 microliters van de 1%agar mix toe aan elke put van een 96-put plaat met behulp van een meerkanaals pipetter. Laat de plaat vervolgens vier uur in een steriele omgeving bij 25 graden Celsius staan. Passage sferoïde-vormende normale menselijke keratinocyten door het aspireren van media en het wassen van cellen in twee milliliter PBS.Aspireer PBS en voeg twee milliliter 0,25% Trypsine-EDTA toe aan de gewassen cellen. Incubeer vervolgens vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie twee milliliter soja trypsineremmer toe aan de plaat en was de cellen van de plaat in een buis van 15 milliliter.Centrifugeer gedurende vijf minuten op 250 maal G. Resuspendeer de celkorrel in één milliliter PBS en kwantificeer de cellen met trypanblauwe kleuring. Aliquot 20, 000 normale menselijke keratinocyten in 100 microliters KSFM-SCM en zaai de cellen in elke put van de eerder bereide 96-well plaat.Incubeer de plaat dan 's nachts. Analyseer met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop de gezaaide putten voor epidermisbolvorming. Voeg 24 tot 48 uur na 3D epidermis bolvorming vier milliliter voorverwarmde KSFM-SCM bij 37 graden Celsius toe aan een schaal van zes centimeter.Breng met behulp van een brede boring een milliliter pipetpunt over, breng een enkele bolide over op de plaat en incubeer de plaat 's nachts. Analyseer de gezaaide sferoïde voor het bevestigen of vermeerderen van cellen met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop. Voer cellen elke 96 uur door de media te verwijderen en twee milliliter verse KSFM-SCM-media aan de plaat toe te voegen.Passage 70 tot 80% confluente sferoïde-afgeleide normale menselijke keratinocyten en 2D monolayer culturen zoals eerder aangetoond. Kwantificeer vervolgens de levensvatbaarheid van cellen met Trypan Blue en een geautomatiseerde celteller. Aliquot 100 microliter met 100.000 tot 4 miljoen normale menselijke keratinocyten in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.Plaats de buizen op ijs in een donkere omgeving door de felle lichten in de laminaire kap uit te schakelen. Voeg twee microliters FITC-geconjugeerde anti-integrin alfa zes en twee microliters PE-geconjugeerde anti-EGFR toe aan de buizen om een verdunning van één tot 50 te bereiken. Bereid een buis voor zonder toegevoegde antilichamen om te dienen als de niet-aangetaste controle.Incubeer de buizen in het donker gedurende 30 minuten op ijs. Voer flowcytometrie-analyse uit met de juiste lasers. Gebruik de negatieve en positieve bedieningselementen om poorten te maken.Sorteer de subpopulatie van epidermale stamcelfractie, de proliferatieve voorlopercelfractie en de toegezegde voorlopercelfractie. Test op proliferatieve capaciteit van gesorteerde celsubpopulaties door de inhoud van elke respectieve sorteerbuis over te brengen in een conische buis van 15 milliliter die 10 keer het volume gesorteerde cellen in PBS bevat. Centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten op 250 maal G.Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in vier milliliter KSFM-SCM. Breng de geresuspendeerde cellen over op een plaat van zes centimeter en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius in een incubator van 5% kooldioxide met een luchtvochtigheid van 95%. Verwijder de volgende dag media van de platen en voeg elke drie dagen vier milliliter voorverwarmde KSFM-SCM toe bij 37 graden Celsius totdat 70 tot 80% samenvloeiing is bereikt.Autonome epidermale sferoïde-vormende vermogen van normale menselijke keratinocyten in 3D-cultuur werd beoordeeld met behulp van de huid epidermis bol test. Niet-bolvormige celaggregatie werd niet beschouwd als adequate epidermisbolvorming. Dichte bolvormige aggregatie werd beschouwd als een kenmerk van spontane bolvormige vorming.Het was noodzakelijk om meer dan twee keer 10 te gebruiken voor de vier cellen om een goede spontane aggregatie te garanderen. Het planten van epidermisbollen in 2D-cultuur resulteerde in de proliferatie van een kleine levensvatbare normale menselijke keratinocyten. Het is belangrijk om deze culturen onder 100% samenvloeiing te houden, omdat dit hun groei en stamceltoestand in cultuur aanzienlijk kan aantasten.Het proces van epidermale sferoïde vorming werd functioneel gevolgd op het niveau van één cel door getransfecteerde cellen met een fluorescerende verslaggever. Sferoïde-afgeleide normale menselijke keratinocyten subpopulatie zijn integrin alfa zes hoog en EFG zijn lage cellen. De cellen vormen over het algemeen ongeveer 25% van de culturen.Karakterisering van deze stamachtige keratinocytsubpopulatie werd bereikt door immunostaining analyse van basaal cytokeratine 14 en tumoreiwit 63. De sferoïde replating assay is een effectieve strategie voor epidermale stamcelverrijking van de neonatale menselijke huid. Dit systeem kan worden gebruikt als een high-throughput cel-gebaseerd model om cutane ziekten zoals wondgenezing en kanker te onderzoeken.

establishing-high-throughput-epidermal-spheroid-culture-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een snelle, robuuste manier van isoleren levensvatbare volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid is beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische afbraak van de huid collageen matrix, gevolgd door het plukken van de haarfollikels en isolatie van single cell suspensies of weefsel fragmenten voor celkweek.

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Het doel van dit artikel is om een uitgebreid en gedetailleerd protocol te geven over hoe genetisch gemodificeerde humane organotypische huid te genereren uit epidermale keratinocyten en gedevitaliseerde humane dermis.

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

De menselijke huid fungeert als een eerste lijn van verdediging tegen de externe omgeving. Presenteren we een methode voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Deze geïsoleerde keratinocyten zijn nuttig in talrijke experimentele opstellingen en een zeer geschikt model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een sferoïde huidmodel voor 3D organotypic melanoom die zowel de architectuur recapituleert en meercellige complexiteit van een orgel/tumor in vivo maar tegelijkertijd herbergt systematische experimentele interventie.

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Het doel van dit protocol is het isoleren van epidermale keratinocyten uit de rughuid van volwassen muizen voor een verscheidenheid aan downstreamtoepassingen zoals moleculaire biologie, biochemie, fluorescentie geactiveerde celsortering en primair in vitro gebruik (bijv. clonogene keratinocyten).

Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om driedimensionale gereconstitueerde menselijke epidermis op een reproduceerbare en robuuste manier te cultiveren. Bovendien kenmerkt het de structuur-functierelatie van het epidermale barrièremodel. De biologische reacties van de gereconstitueerde menselijke epidermis op pro-inflammatoire stimuli worden ook gepresenteerd.

Het cultiveren van een driedimensionale gereconstrueerde menselijke epidermis op grote schaal

Dit protocol schetst de kweek van vers verkregen (passage 0) keratinocyten voor gebruik in beeldvorming van levende cellen.

Genereren van primaire culturen voor beeldvorming van levende cellen van keratinocyten

Hier bieden we een methode voor live celbeeldvormingsanalyse die kan worden gebruikt om de afstamming van passage 0 keratinocyten handmatig te volgen en die het mogelijk maakt om proliferatiemetrieken te verzamelen, waaronder het lot van de celdeling en de duur van de celcyclus.

Live celbeeldvorming met time-lapse-fotografie om de epidermale keratinocytenproliferatiekinetiek te bestuderen

Dit protocol schetst een methode voor het produceren van huidorganoïden die haarzakjes bevatten van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een vlak, fysiologisch relevant lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem om de huidarchitectuur en -functie na te bootsen.

Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vlakke haardragende huidorganoïden met behulp van een lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem

Leer een 3D epidermale sferoïde cultuurmethode met hoge doorvoer voor het modelleren van keratinocytstamcelplasticiteit. Dit protocol maakt gedetailleerd onderzoek naar epitheliale celgedrag en ziekteprocessen mogelijk.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Meer video's verkennen