Het creëren van aviaire voorhersenen chimaera's om de gezichtsontwikkeling te beoordelen
18 februari 2021
Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek die is ontworpen om de signalerings- en patrooneigenschappen van basale voorhersenen tijdens craniofaciale ontwikkeling te testen.
Met deze methode kunnen onderzoekers weefselinteracties tussen de basale voorhersenen en het gezicht beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de basale voorhersenen isoleert voor beoordeling en besmetting met neurale topcellen voorkomt, wat de analyse zou verstoren. Het moeilijke deel van deze techniek is het verwijderen van de voorhersenen van de gastheer en vervanging door het donorweefsel.
Diane Hu, een onderzoekswetenschapper uit het laboratorium van Dr. Ralph Marcucio, zal de procedure demonstreren. Bereid om te beginnen DMEM-media voor met neutraal rood, een glazen transferpipet en geslepen wolfraam. Verwijder met behulp van een spuit van 10 milliliter en een naald van 18 gauge 0,5 milliliter albumine uit het puntige uiteinde van de eierschaal.
Maak een klein gaatje bovenop de schaal met behulp van de punt van een schaar. Plaats vervolgens een stuk tape over het gat en knip een cirkelvormige opening om het embryo bloot te leggen. Bevlek het embryo met neutraal rood.
Oogst weefseltransplantaten van de linkerkant van de basale voorhersenen van stadium zeven of acht embryo's. Gebruik gebogen geslepen wolfraamnaalden om voorzichtig een stuk van de voorhersenen in te snijden. Om het onderliggende endoderm niet op te nemen, schuift u de naald onder de voorhersenen en parallel aan de as van de neurale buis.
Pak het transplantaat op van het donorembryo met behulp van de glazen transferpipet en breng het gedurende twee minuten over in DMEM met neutraal rood om het te kleuren. Plaats vervolgens de gekleurde ent in DMEM die geen neutraal rood bevat totdat deze klaar is voor transplantatie. Incubeer bevruchte eieren van witte Leghorn-kip bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer tot Hamburger-Hamilton fase zeven tot acht.
Stel embryo's bloot zoals eerder aangetoond. Bereid met behulp van geslepen wolfraamnaalden de transplantaatplaats voor door een stuk basale voorhersenen van 0,3 bij 0,2 millimeter te snijden en vervolgens te verwijderen om het transplantaat te accommoderen. Vermijd overmatige verstoring van het onderliggende endoderm, wat duidelijk zal zijn als dooierkorrels beginnen te lekken door elke scheur die wordt gemaakt.
Na het overbrengen van het transplantaat naar de gastheer, plaatst u het transplantaat om de uitgeroeide basale voorhersenen van de gastheer te vervangen. Plaats tape strak over het gat en breng de embryo's terug naar de 37 graden Celsius-couveuse totdat ze klaar zijn voor analyse. Aanvankelijk werden chimaera's gecreëerd door kwartelweefsels in kuikenembryo's te transplanteren.
Met behulp van het QCPN-antilichaam werden kwartelcellen gevisualiseerd en onderscheiden van de gastheerweefsels. Het kwartel-kuikensysteem bevestigde dat al het transplantaat alleen uit neuraal weefsel bestond en niet besmet was met andere celtypen. Transplantatie van kwartelweefsel in eendenembryo's leidde tot ernstig misvormde hersenschimmen als gevolg van een zich sneller ontwikkelend kwartelbrein.
Daarom werd transplantatie van eendenweefsels in kippenembryo's uitgevoerd. De resulterende eenden-kuiken chimaera's suggereren dat de hersenen deelnemen aan het reguleren van de morfologie. Whole mountain C2-hybridisatie werd gebruikt om Sonic-egelexpressie in chimaera's te beoordelen.
Net als bij morfologie leek de sonische egelexpressie aan de eendenzijde van de chimaera meer eendachtig. Het voorbereiden van de hostsite vergt oefening. Een groot aantal embryo's overleeft niet, dus het creëren van een groot aantal chimaera's kan helpen zorgen voor de juiste monsters voor analyse.
Deze methode maakte het mogelijk om te beoordelen hoe signalen uit de hersenen het Sonic hedgehog-expressiedomein in de frontonasale ectodermale zone vormen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek waarmee onderzoekers weefselinteracties tussen het basale voorbrein en het gezicht tijdens de craniofaciale ontwikkeling kunnen beoordelen. De methode isoleert het basale voorbrein voor analyse, waardoor contaminatie met neurale kamcellen wordt voorkomen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Craniofaciale Ontwikkeling
- Weefseltransplantatietechnieken
Achtergrond
- Het basale voorbrein speelt een cruciale rol bij de craniofaciale ontwikkeling.
- Het begrijpen van weefselinteracties is essentieel voor de ontwikkelingsbiologie.
- Contaminatie door neurale kamcellen kan de analyse beïnvloeden.
- Het isoleren van het basale voorbrein maakt een duidelijkere beoordeling van de signaaleigenschappen ervan mogelijk.
Doel van de studie
- Om de signalerings- en patroonvormingseigenschappen van de basale voorhersenen te testen.
- Om een betrouwbare methode voor weefseltransplantatie te ontwikkelen.
- Om het begrip van de mechanismen van craniofaciale ontwikkeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van DMEM-medium met neutraal rood.
- Gebruik van een glazen transferpipet en geslepen wolfraam.
- Verwijdering van albumine uit het gepunte uiteinde van de eischaal met behulp van een spuit.
- Vervanging van de voorhersenen van de gastheer door donorgeweefsel.
Belangrijkste resultaten
- De techniek isoleert effectief het basale voorbrein voor analyse.
- Demonstratie van de procedure door een onderzoeker.
- Succesvolle beoordeling van weefselinteracties zonder contaminatie.
- Inzichten in de rol van het basale voorbrein bij de craniofaciale ontwikkeling.
Conclusies
- De transplantatietechniek is een waardevol instrument voor het bestuderen van de craniofaciale ontwikkeling.
- Het isoleren van het basale voorbrein verhoogt de nauwkeurigheid van ontwikkelingsbeoordelingen.
- Deze methode kan worden toegepast voor verder onderzoek in de ontwikkelingsneurobiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt een nauwkeurige beoordeling van weefselsignalering tijdens de craniofaciale ontwikkeling mogelijk door de basale voorhersenen te isoleren van storende bijdragen uit de neurale lijst. Het ondersteunt mechanistische risicoreductie bij doelwitvalidatie door te verduidelijken hoe signalen uit de hersenen morfogenetische paden reguleren, zoals Sonic hedgehog in de frontonasale ectodermale zone. De aanpak biedt een ziekterellevant systeem voor het evalueren van ontwikkelingspaden met voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over interacties tussen hersen- en gezichtsweefsel tijdens de ontwikkeling van gewervelden.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van targets mogelijk door signaleringseigenschappen van de basale voorhersenen te isoleren.
- Predictieve waarde: Ondersteunt het voorspellend vertrouwen door manipulatie van de basale voorhersenen te koppelen aan veranderingen in het expressiedomein van SHH.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde chimerische systemen voor voor de kwantitatieve beoordeling van morfogeenexpressie.
- Operationele waarde: Standaardiseert weefseltransplantatie voor reproduceerbare assay-resultaten over verschillende experimentele condities.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de generatie van meerdere chimera's om lage overlevingspercentages te compenseren en analytische robuustheid te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt mechanistische inzichten uit de ontdekkingsfase met preklinische modellen van craniofaciale patroonvorming.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt upstream-regulatoren van SHH, een cruciale route bij het modelleren van aangeborene afwijkingen.
- Ziekte-relevant systeem: Maakt gebruik van aviaire chimeren om geconserveerde mechanismen van gezichtsontwikkeling bij gewervelden te bestuderen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen workflows voor vroege ontdekking, waarbij assays voor weefselinteractie bijdragen aan de zekerheid over het target vóór de inspanningen voor lead-identificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van signaleringscentra bij craniofaciale morfogenese.
- Assay-gereedheid: Genereert gestandaardiseerde biologische systemen voor kwantitatieve analyse van SHH-expressie.
- Analytics: Maakt whole-mount in situ hybridisatie mogelijk om ruimtelijke veranderingen in genexpressie als belangrijkste readout te meten.
- Translationeel Onderzoek: Biedt mechanistische continuïteit van neurale weefseltransplantaties naar resultaten van het faciale fenotype.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van weefselspecifieke bijdragen aan ontwikkelingspaden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door signalen van de basale voorhersenen bij de gezichtsontwikkeling te isoleren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde transplantatie- en gastvoorbereidingstechnieken.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door upstream-regulatoren van drugbare pathways zoals SHH te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde weefselinteractiegegevens.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische weefselbehandeling en manipulatie van aviaire embryo's.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumenten, waaronder geslepen wolfraamnaalden en glazen transferpipetten.
- Vereist gestandaardiseerde incubatie- en stadiëringprotocollen voor zowel gastheer- als donorembryo's.
- Omvat de optimalisatie van de voorbereiding van de graftplaats om lekkage van het eigeel te voorkomen en de levensvatbaarheid van de gastheer te waarborgen.
- Beperkt door lage overlevingstarieven van embryo's, waardoor een groot aantal monsters nodig is voor een betrouwbare analyse.
