Name: Antibioticum werkzaamheid testen in een Ex vivo model van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Biofilms in de Cystic Fibrosis Lung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer antibiotica gevoeligheidstesten voor cystic fibrose pathogenen met een ex vivo varkenslongmodel. Deze methode bootst de longomgeving beter na dan standaard laboratoriumtesten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken al onze co-auteurs voor de originele artikelen waaruit we voorbeeldige resultaten hebben geboekt. Het werk werd gefinancierd door een MRC New Investigator Research Grant (subsidienummer MR/R001898/1) toegekend aan FH; door phd-studenten van het BBSRC Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP) toegekend aan NEH en IA; en door de toekenning van de University of Warwick Undergraduate Research Support Scheme aan FA om een onderzoeksproject voor de zomervakantie uit te voeren. We danken Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) en John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) voor het leveren van longen. We willen ook de hulp erkennen van de Media Preparation Facility in de School of Life Sciences aan de Universiteit van Warwick, met speciale dank aan Cerith Harries en Caroline Stewart, en de hulp van Anita Catherwood van Warwick Antimicrobial Screening Facility.

Dit protocol maakt gebruik van varkenslongen afkomstig van een commercieel slachthuis dat vlees levert voor menselijke consumptie. Volgens de Britse wetgeving vereist het gebruik van overgebleven weefsel van vlees geslachte dieren geen ethische goedkeuring; we raden lezers aan om relevante lokale wetten en institutionele richtlijnen te controleren voordat ze aan het werk gaan.
1. Bereiding van synthetische CF Sputum Media (SCFM)
<ol><li>Om SCFM te maken voor gebruik met EVPL-weefsel, volgt u het recept dat door Palmer et al.24 wordt beschreven met de wijziging dat glucose uit het recept wordt verwijderd. OPMERKING: Het recept van Palmer et al. bevat vrije aminozuren, kationen, anionen en lactaat in concentraties die representatief zijn voor de gemiddelde concentraties die worden aangetroffen in een selectie van sputummonsters van CF-patiënten. Het is aangetoond dat het vergelijkbare koolstofgebruiksroutes en expressie van quorumdetectiesignalen door P. aeruginosa PA14 aangeeft aan groei in medium gemaakt van gevlietinaliseerd patiëntsputum24. Een recept voor 1 L gemodificeerde SCFM wordt geleverd in tabel S1.</li>
	<li>Filter steriliseer de SCFM onmiddellijk na bereiding en bewaar deze maximaal 1 maand bij 4 °C.</li>
</ol>2. Dissectie en infectie van ex vivo varkenslong (EVPL) weefsel
<ol><li>Bereid voorafgaand aan de dissectie een agarplaat(en) van de vereiste bacteriële stam(en) voor op infectie met behulp van wat agar standaard is in het laboratorium voor P. aeruginosa/S. aureus (bijv. lysogene bouillon + 1,2% agar).</li>
	<li>Bereken hoeveel varkensbronchiolaire weefselstukken nodig zijn voor het experiment, inclusief niet-geïnfecteerde controleweefselstukken. Vermenigvuldig dit getal met twee om het experiment in twee repliceerlongen te herhalen om de herhaalbaarheid van de resultaten te bevestigen.</li>
	<li>Vermenigvuldig het totale aantal weefselstukken dat nodig is met 0,5 om het volume SCFM-agarose (ml) te bepalen dat nodig is om agarosepads te maken om voldoende medium te maken voor 400 μL/weefselstuk plus reserve SCFM-agar om eventuele pipetfouten of verdamping tijdens de bereiding te verantwoorden.</li>
	<li>Voeg 0,12 g agarose toe aan elke 15 ml SCFM die nodig is om het gewenste totale volume SCFM met 0,8% gewicht/volume agarose te maken.</li>
	<li>Verwarm de SCFM-agaroseoplossing totdat de agarose volledig is opgelost. Een huishoudelijke magnetron met een laag vermogen wordt aanbevolen. De benodigde tijd is afhankelijk van het wattage van de magnetron. Laat de agarose afkoelen tot ongeveer 50 °C (warm aanvoelen maar comfortabel om vast te houden). Laat niet verder afkoelen.</li>
	<li>Voeg met behulp van een pipet 400 μL van de SCFM-agarose toe aan één put van een 24-putplaat per weefselstuk dat nodig is.</li>
	<li>Steriliseer de SCFM-agarose-bevattende 24-put plaat/s onder ultraviolet licht gedurende 10 min.</li>
	<li>Bereid drie replicerende wasbeurten voor elke intacte long die wordt ontleed met behulp van 20 ml steriel Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) plus 20 ml steriel Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 aangevuld met 50 μg/ml ampicilline.</li>
	<li>Maak een aliquot van 40 ml SCFM als laatste wasbeurt voor elke intacte long die wordt ontleed. Alle wasbeurten kunnen 's nachts bij 4 °C worden bewaard of onmiddellijk worden gebruikt.</li>
	<li>Verkrijg longen zo snel mogelijk na het slachten van de aangewezen bron en zorg ervoor dat ze koud worden gehouden door ze in een huishoudelijke koelbox naar het laboratorium te vervoeren. OPMERKING: Longen dichter bij de slachtdag vertonen minder kneuzingen door opslag, maar weefsel dat tot 4 dagen na het slachten in koude opslag wordt bewaard, kan ook worden gebruikt. Aangezien de koelbox in de slagerij of het slachthuis moet worden gebracht, moet deze na elk gebruik volgens de plaatselijke laboratoriumrichtlijnen worden ontsmet en buiten het microbiologisch laboratorium worden bewaard wanneer deze niet in gebruik is, om het risico op besmetting en een inbreuk op de insluiting te verminderen.</li>
	<li>Werk op een gesteriliseerd oppervlak en onder een vlam, plaats de longen op een schone plastic snijplank bedekt met autoclaaf aluminiumfolie. Controleer of de bronchiolen intact blijven. Als er schade is opgetreden in het slachthuis of tijdens het transport, zijn de longen niet geschikt voor gebruik.</li>
	<li>Verwarm een paletmes onder een vlam en raak het mes heel kort aan op het gebied van de long rond de bronchiol om het oppervlak van het weefsel te steriliseren.</li>
	<li>Snijd het oppervlakteweefsel rond de bronchiol weg met een steriel gemonteerd scheermesje. Maak incisies parallel aan de bronchiol om schade te voorkomen.</li>
	<li>Zodra de bronchiol is blootgesteld, maak je een dwarsdoorsnede door de bronchiol op het hoogste punt zichtbaar om de bronchiol vrij te maken.</li>
	<li>Houd met behulp van een steriele tang het vrije uiteinde van de bronchiol lichtjes vast en snijd het resterende ongewenste weefsel weg met behulp van een steriel gemonteerd scheermesje. Maak een laatste dwarsdoorsnede-incisie over de bronchiol voordat een vertakking zichtbaar is om de bronchiol uit de longen te verwijderen.</li>
	<li>Plaats de bronchiol in de eerste DMEM/RPMI 1640 wasbeurt. Laat de bronchiol in de was en herhaal stap 2.11-2.14 om extra secties bronchiol uit dezelfde long te oogsten als nodig is om voldoende weefselsecties voor het geplande experiment op te leveren.</li>
	<li>Plaats eventuele extra bronchiolaire secties uit dezelfde long in de was (stap 2.16). Laat minstens 2 minuten in de was staan.</li>
	<li>Verwijder de bronchiolen van de eerste DMEM/RPMI 1640 wasbeurt en plaats de monsters in een steriele Petrischaal.</li>
	<li>Houd elke bronchiol licht vast met een steriele tang en zorg ervoor dat het weefsel niet wordt beschadigd. Verwijder zoveel mogelijk overgebleven zacht weefsel en snijd het weefsel in ~5 mm brede stroken met behulp van een steriele dissectieschaar.</li>
	<li>Plaats alle bronchiolaire weefselstrips in de tweede DMEM/RPMI 1640 wasbeurt. Laat minstens 2 minuten in de was staan.</li>
	<li>Verwijder de tissuestrips uit de tweede wasbeurt met een steriele tang en zorg ervoor dat het weefsel niet wordt beschadigd. Leg het weefsel in een schone, steriele petrischaal.</li>
	<li>Verwijder het resterende zachte weefsel dat aan de bronchiol is bevestigd en snijd de stroken in vierkanten (~ 5 mm x 5 mm) met behulp van een steriele dissectieschaar.</li>
	<li>Voeg de derde DMEM/RPMI 1640 wasbeurt toe aan de Petrischaal. Meng de tissuestukken lichtjes in de was door de schaal te wervelen.</li>
	<li>Giet de derde was uit de Petrischaal zonder de weefselstukken te verwijderen.</li>
	<li>Voeg de laatste SCFM-was toe aan de weefselbevattende Petrischaal, zodat alle weefselstukken bedekt zijn.</li>
	<li>Steriliseer de weefselstukken in SCFM onder UV-licht gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Gebruik steriele tangen om elk gesteriliseerd bronchiolaire weefselstuk over te brengen in individuele putten van een 24-put plaat/s met SCFM-agarose pads.</li>
	<li>Om elk weefselstuk te infecteren met de gewenste bacteriële stam, raakt u een kolonie aan die op een agarplaat is gegroeid met de punt van een 29 G-naald die is bevestigd aan een steriele insulinespuit van 0,5 ml. Raak vervolgens de kolonie aan op het weefselstuk en prik zachtjes in het weefseloppervlak. OPMERKING: Met behulp van een insulinespuit met een 29 G-naald kan de naald nauwkeurig en comfortabel worden vastgehouden terwijl de vingers op veilige afstand van het naald- en longweefsel blijven. Het is mogelijk om deze stap uit te voeren met 29 G naalden die niet aan een spuit zijn bevestigd, maar dit vereist meer behendigheid en verhoogt het risico op een naaldprikletsel. Insulinespuiten zijn direct beschikbaar.</li>
	<li>Prik voor de niet-geïnfecteerde controles voorzichtig het oppervlak van elk van het weefselstuk met de punt van een 29 G-naald bevestigd aan een steriele insulinespuit van 0,5 ml.</li>
	<li>Gebruik een pipet om 500 μL SCFM aan elke put toe te voegen.</li>
	<li>Steriliseer een ademend afdichtingsmembraan voor elke 24-put plaat onder ultraviolet licht gedurende 10 minuten(tabel met materialen).</li>
	<li>Verwijder het deksel/de 24-putplaat(en) en vervang het door het ademende membraan.</li>
	<li>Incubeer de platen op 37 °C gedurende de gewenste incubatietijd (infectie) zonder te schudden. Controleer of er geen zichtbare groei van de ingeënte ziekteverwekker op de niet-geïnfecteerde controlestukken is (besmettingscontrole). OPMERKING: Indien gewenst kan ampicilline worden toegevoegd aan de SCFM-agarose pads in stap 2.5 en SCFM behandelen in stap 2.30 tot een eindconcentratie van 20 μg/ml. Dit zal de groei van de meeste endogene bacteriën op de longen onderdrukken zonder de groei van P. aeruginosa of S. aureus aan te tasten, maar omdat de aanwezigheid van ampicilline de gevoeligheid voor andere antibiotica kan beïnvloeden, wordt de lezer overgelaten om deze keuze te maken, afhankelijk van de stammen en antibiotica die ze willen testen.</li>
</ol>3. Bepaling van de werkzaamheid van antibiotica
OPMERKING: Figuur S1bevat een schema met de stappen van deze test.
<ol><li>Om de antibioticatolerantie van biofilms gevormd op EVPL te meten, moeten tijdens de dissectie en infectie sets longstukken uit ten minste twee onafhankelijke longen worden gerepliceerd. Eén set stukken is vereist voor een negatieve controle (geen antibioticabehandeling) en één set is vereist om elke concentratie antibiotica te testen.</li>
	<li>Inspecteer na 48 uur incubatie de niet-geïnfecteerde weefselstukken visueel. Sommige groei van bacteriën endogene aan de varkenslong kan hebben plaatsgevonden, waardoor de SCFM rond deze secties troebel. Als de groei die kenmerkend is voor de geselecteerde studiesoorten wordt waargenomen (bijv. blauwgroene pigmentatiediagnose van P. aeruginosa),start u het experiment opnieuw met verse longen.</li>
	<li>Als de niet-geïnfecteerde weefselsecties geen of slechts minimale bacteriegroei vertonen, bereid dan één 24-wells wasplaat en één 24-well behandelingsplaat voor, die elk 500 μL verse SCFM bevatten zonder antibiotica of met het antibioticum van belang per put per longweefselstuk.</li>
	<li>Verwijder elk geïnfecteerd weefselstuk van de incubatieplaat met vlamgesteriliseerde tang, wervel kort in een verse put van de wasplaat om niet-biofilm geassocieerde bacteriële cellen te verwijderen en breng over naar de juiste put van de behandelingsplaat.</li>
	<li>Sluit de behandelplaten af met een vers ademend membraan.</li>
	<li>Incubeer de behandelingsplaat(en) bij 37 °C zonder 18-24 uur te schudden.</li>
	<li>Verwijder met behulp van vlamgesteriliseerde tang elk longstuk van de 24-putplaat en doe het in een steriele homogenisatiebuis van 2 ml met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 1 g metalen kralen (Tafel van materialen).</li>
	<li>Kraal 40 seconden kloppen op 4 m/s. OPMERKING: Kraalslagen met de specifieke kralen en homogenisator die in de tabel met materialen worden voorgesteld, veroorzaken geen significante lysis van bacteriën, maar elk laboratorium dat het protocol gebruikt, moet de effecten van hun gekozen kralen en homogenisator controleren voordat met AST-assays wordt beginnen.</li>
	<li>Verdun het longhomogenaat serieel met PBS en plaat op Lysogeny Broth (LB) agar om de kolonievormende eenheden (CFU) te bepalen in individuele onbehandelde en met antibiotica behandelde weefselstukken volgens standaardplatingmethoden. OPMERKING: Optioneel: Bereid dubbele platen op selectieve media voor om kolonie-identiteiten te bevestigen; b.v., het gebruik van mannitol zout agar voor S. aureus.</li>
</ol>

<ol><li>Elborn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis.</a> The Lancet. 388 (10059), 2519-2531 (2016).</li>
<li>Høiby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+biofilm+infections+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients.</a> APMIS. 125, 339-343 (2017).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatric Pulmonology. 44 (6), 547-558 (2009).</li>
<li>Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Penesyan, A., Gillings, M., Paulsen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+discovery%3A+Combatting+bacterial+resistance+in+cells+and+in+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities.</a> Molecules. 20 (4), 5286(2015).</li>
<li>Son, M. S., Matthews, W. J., Kang, Y., Nguyen, D. T., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+of+Pseudomonas+aeruginosa+nutrient+Acquisition+and+pathogenesis+in+the+lungs+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence of Pseudomonas aeruginosa nutrient Acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients.</a> Infection and Immunity. 75 (11), 5313-5324 (2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846(2016).</li>
<li>Stites, S. W., Plautz, M. W., Bailey, K., O'Brien-Ladner, A. R., Wesselius, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+concentrations+of+iron+and+isoferritins+in+the+lower+respiratory+tract+of+patients+with+stable+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased concentrations of iron and isoferritins in the lower respiratory tract of patients with stable cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (3), 796-801 (1999).</li>
<li>Cornforth, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+transcriptome+during+human+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5125-5134 (2018).</li>
<li>Drevinek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+linked+to+antimicrobial+resistance%2C+oxidative+stress%2C+iron+depletion+and+retained+motility+are+observed+when+Burkholderia+cenocepacia+grows+in+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum.</a> BMC Infectious Diseases. 8, 121(2008).</li>
<li>Goerke, C., Wolz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+and+genomic+plasticity+of+Staphylococcus+aureus+during+persistent+colonization+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory and genomic plasticity of Staphylococcus aureus during persistent colonization and infection.</a> International Journal of Medical Microbiology. 294 (2-3), 195-202 (2004).</li>
<li>Wolter, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small-colony+variants+are+independently+associated+with+worse+lung+disease+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis.</a> Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).</li>
<li>Roberts, A. E. L., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 3646-3661 (2015).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+biofilm+device%3A+New+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37 (6), 1771-1776 (1999).</li>
<li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+feasible+biofilm+susceptibility+assay+for+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1915-1922 (2004).</li>
<li>Smith, S., Waters, V., Jahnke, N., Ratjen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+versus+biofilm+antimicrobial+susceptibility+testing+to+guide+antibiotic+therapy+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), (2020).</li>
<li>Trust, C. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrust%2C+CF+%22Annual+Data+Report+2019%22">Annual Data Report 2019</a>. , (2019).</li>
<li>Angelis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+and+economic+costs+and+health-related+quality+of+life+in+non-institutionalised+patients+with+cystic+fibrosis+in+the+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Health+Services+Research%22%5BJournal%5D)">Social and economic costs and health-related quality of life in non-institutionalised patients with cystic fibrosis in the United Kingdom.</a> BMC Health Services Research. 15 (1), 428(2015).</li>
<li>Eidt-Koch, D., Wagner, T. O. F., Mittendorf, T., von der Schulenburg, J. M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outpatient+medication+costs+of+patients+with+cystic+fibrosis+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Health+Economics+and+Health+Policy%22%5BJournal%5D)">Outpatient medication costs of patients with cystic fibrosis in Germany.</a> Applied Health Economics and Health Policy. 8 (2), 111-118 (2010).</li>
<li>Longitude Prize. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://longitudeprize.org">http://longitudeprize.org</a> (2020).</li>
<li>Harrington, N. E., Sweeney, E., Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+better+biofilm+-+Formation+of+in+vivo-like+biofilm+structures+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+porcine+model+of+cystic+fibrosis+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biofilm%22%5BJournal%5D)">Building a better biofilm - Formation of in vivo-like biofilm structures by Pseudomonas aeruginosa in a porcine model of cystic fibrosis lung infection.</a> Biofilm. 2, 100024(2020).</li>
<li>Harrison, F., Diggle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+lung+model+to+study+bronchioles+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo lung model to study bronchioles infected with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbiology. 162, 1755-1760 (2016).</li>
<li>Sweeney, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+cystic+fibrosis+model+recapitulates+key+clinical+aspects+of+chronic+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo cystic fibrosis model recapitulates key clinical aspects of chronic Staphylococcus aureus infection.</a> Microbiology. , DOI: 10.1099/mic.0.000987 (2020).</li>
<li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+A+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: A practical guide for biologists.</a> Biological Reviews. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
<li>Sweeney, E., Sabnis, A., Edwards, A. M., Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+host-mimicking+medium+and+biofilm+growth+on+the+ability+of+colistin+to+kill+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of host-mimicking medium and biofilm growth on the ability of colistin to kill Pseudomonas aeruginosa.</a> Microbiology. 166 (12), 1171-1180 (2020).</li>
<li>Stalker, D. J., Jungbluth, G. L., Hopkins, N. K., Batts, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+tolerance+of+single-+and+multiple-dose+oral+or+intravenous+linezolid%2C+an+oxazolidinone+antibiotic%2C+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and tolerance of single- and multiple-dose oral or intravenous linezolid, an oxazolidinone antibiotic, in healthy volunteers.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (5), 1239-1246 (2003).</li>
<li>Ager, S., Gould, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+update+on+linezolid+in+the+treatment+of+Gram-positive+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Clinical update on linezolid in the treatment of Gram-positive bacterial infections.</a> Infection and Drug Resistance. 5, 87-102 (2012).</li>
<li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Artificial+Sputum+Medium+to+Test+Antibiotic+Efficacy+Against+Pseudomonas+aeruginosa+in+Conditions+More+Relevant+to+the+Cystic+Fibrosis+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857(2012).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing - Version 8.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.eucast.org">www.eucast.org</a> (2020).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 10.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.eucast.org">http://www.eucast.org</a> (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het ex vivo longmodel is met hoge doorvoer en goedkoop en omdat het postconsumentenafval uit de vleesindustrie gebruikt, geeft het geen ethische zorgen. Het is ontworpen om chronisch geïnfecteerde menselijke CF-luchtwegen beter na te bootsen dan momenteel beschikbaar is, in vitro AST-platforms. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat het onder deze omstandigheden de gevoeligheid voor antibiotica nauwkeuriger kan voorspellen.
Kritieke stappen in het protocol, die ervoor zorgen dat betrouwbare en reproduceerbare resultaten het volgende omvatten:
<ol><li>Gebruik consistente tijd- en opslagmethoden tussen het slachten, verzamelen en verwerken van longmonsters. Het is belangrijk om longen zo snel mogelijk na het slachten te gebruiken en de kans op besmetting tot een minimum te beperken. Er zijn verschillen waargenomen in het vermogen van experimentele culturen om in longen te groeien als ze niet zo vers mogelijk zijn.</li>
	<li>Het handhaven van steriliteit bij de productie van SCFM en dissectie van longstukken is essentieel. Gezonde longen zijn niet steriel en dus kan de aanwezigheid van commensale bacteriën een 'natuurlijke' omgeving voor chronische infectie weerspiegelen. Niettemin kunnen, zoals eerder opgemerkt, bacteriële interacties binnen populaties met meerdere spanningen de resultaten en gevoeligheid voor antibiotica veranderen, dus besmetting moet worden vermeden en longen moeten vóór gebruik worden gesteriliseerd. Wij pleiten voor het gebruik van UV-sterilisatie, omdat het geen veranderingen in de integriteit van tinweefsel en, indien nodig, extra antibioticawassingen lijkt te veroorzaken. Antibiotica moeten echter met voorzichtigheid worden gebruikt, omdat ze de resultaten kunnen beïnvloeden door selectieve druk in te voeren en de genexpressie in testbacteriële populaties kunnen veranderen.</li>
	<li>Gebruik met mock geïnfecteerde, negatieve controleweefselmonsters en celtellingsplaten die zijn gekweekt op een niet-selectief, rijk medium om de groei van verontreinigingen of commensale bacteriën te benadrukken die niet zijn verwijderd tijdens sterilisatie. Dit is essentieel om eventuele impact van deze bacteriën op AST te beperken. Het is ook nuttig om dubbele, selectieve agar, celtellingsplaten te produceren die specifiek zijn voor het organisme van belang, omdat dubbele platen kolonie-identificatie en celinumering versnellen.</li>
	<li>Voer proefexperimenten uit wanneer u het model voor het eerst gebruikt en wanneer u het gebruikt met nieuwe stammen of genotype bacteriën om biofilm-CFU-variaties tussen weefselsecties te beoordelen, waardoor de selectie van optimale experimentele monstergroottes (bijv. hoeveel repliceerweefselsecties kunnen worden verkregen uit hoeveel repliceren longen) door het gebruik van vermogensberekeningen.</li>
	<li>De test maakt gebruik van een niet-gestandaardiseerd entmateriaal, omdat dit een snelle inenting mogelijk maakt na 48 uur incubatie en de vorming van relatief consistente biofilmsbelastingen (vooral voor P. aeruginosa). Om de antibacteriële werkzaamheid in vroege biofilmgroeistadia te bepalen, kunt u overwegen om te enten met een gestandaardiseerde KVE van koloniegekweekte bacteriën die in ASM zijn opgehangen. We raden niet aan om te enten met planktonische bacteriën: vroege pilot-experimenten toonden aan dat dit leidt tot acute, invasieve groei en niet tot betrouwbare biofilmvorming.</li>
</ol>Dit protocol produceert een robuust prototypemodel voor gebruik met P. aeruginosa, met een groot ontwikkelingspotentieel voor gebruik met S. aureus, maar het heeft wel enkele beperkingen die in de toekomst voor bepaalde toepassingen moeten worden aangepakt. Weefsel werd ingeënt uit enkele kolonies om de ontwikkeling van klonale populaties mogelijk te maken. De resultaten laten zien dat dit voor P. aeruginosaom 48 uur weinig invloed heeft op celnummers. Er werd echter een grotere variabiliteit in bacteriële belasting waargenomen voor S. aureus en aangezien verschillende bacteriën binnen het model anders kunnen groeien, kunnen een gestandaardiseerd beginnend entmateriaal en een rigoureuze productie van weefselmonsters van identieke grootte en gewicht afhankelijk zijn van het organisme van studie. Er kunnen ook verschillen zijn tussen laboratoria als gevolg van verschillen in precieze dissectie-/infectietechnieken of lokaal varkensras/landras. Om de reproduceerbaarheid van bacteriële populaties voor individuele implementaties van het model te beoordelen, stellen we het gebruik van herhaalbaarheidsberekeningen voor als onderdeel van de statistische analyse van resultaten25 en het gebruik van herhaalbaarheids-/vermogensberekeningen op basis van proefexperimenten om de optimale steekproefgrootte te berekenen voor het gebruik ervan in eindexperimenten.
Een van de belangrijkste voordelen van EVPL ten opzichte van traditionele plaattesten is dat het, in plaats van te testen op bacteriën die planktonisch of op abiotische oppervlakken groeien, de ruimtelijke structurering van bacteriële biofilms binnen een gastheeromgeving en met celdifferentiatie mogelijk maakt. Dit heeft belangrijke implicaties voor het overwegen van de impact van fysiochemische en nutriëntengradiënten op de activiteit van antimicrobiële middelen, evenals de levering en beschikbaarheid van actieve therapieën in verschillende micromilieus binnen een chronische infectie en celcelinteractie tussen bacteriën. Dit laatste punt is bijzonder belangrijk, omdat multispecies-infecties routinematig worden waargenomen in CF en steeds belangrijker worden voor infecties die verband houden met andere aandoeningen van de luchtwegen, zoals astma en chronische obstructieve longziekte. Er is potentieel om dit model voor de AST te ontwikkelen voor geïndividualiseerde sputumbemonstering bij patiënten in de klinische diagnostiek. Een analoog onderzoek is al aan de gang met behulp van een wond-nabootsende in vitro model voor groei en AST van gedebrideerde biofilm van chronische wonden (Southwest Regional Wound Care Center in Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).
Bovendien maakt het model gebruik van postmortemweefsel, dus de invloed van de immuunrespons van de gastheer op de gevoeligheid van antibiotica is beperkt. Huidige in vitro modellen houden ook geen rekening met immuunresponsen van de gastheer, dus we zien dit niet als een barrière voor het toekomstige gebruik van het model in AST-toepassingen. Er wordt echter rekening gehouden met de immuunrespons wanneer farmacokinetische en farmacodynamische parameters en richtlijnen voor antibioticadosering worden bepaald. Hoewel onze studies bewijs hebben aangetoond van resterende immuuncellen en reacties in het weefsel23 (en S. Azimi, persoonlijke communicatie), is dit een uitstekend gebied voor verdere optimalisatie en ontwikkeling van het model als een grotere match met in vivo omstandigheden gewenst is.
Het verstrekken van meer klinisch geldige AST voor CF zal helpen voldoen aan een belangrijke aanbeveling van de UK Health, Social Care Act 2008 dat "procedures moeten worden ingevoerd om voorzichtig voorschrijven en antimicrobieel rentmeesterschap te garanderen." Wij geloven dat de EVPL een ideaal kandidaatmodel is om aan deze behoefte te voldoen.

Chronische biofilminfecties treffen personen van wie de normale immuunafweer wordt aangetast. Risicogroepen zijn onder meer mensen met de genetische aandoening cystic fibrosis (CF)1. Kolonisatie van het abnormaal dikke, zelfklevende slijm in de luchtwegen in de vroege kindertijd leidt tot hardnekkige biofilminfecties van de bronchiolen2,3. De groei van bacteriën als uitgebreide matrixgekapte biofilms is een factor die chronische infecties van immuungecompromitteerde mensen onderscheidt van acute infecties van gezonde gastheren en de biofilmtoestand beschermt bacteriën zowel tegen blootstelling aan antibiotica (als gevolg van verminderde diffusie door de matrix) en vermindert hun gevoeligheid voor antibiotica (bijv. door inductie van quiescence of upregulatie van effluxpompen)4,5. Ziektespecifieke veranderingen in de fysiologie en chemie van gastheerweefsel veranderen echter de bacteriële fysiologie verder van die waargenomen bij acute infecties of in standaard laboratoriumgroeiomstandigheden. Belangrijke voorbeelden in CF zijn het gebruik van ongebruikelijke koolstofbronnen, zoals vetzuren en aminozuren die vrijkomen uit longsurfactant en geproduceerd door microbiële afbraak van mucine, het vrijkomen van micronutriënten, zoals ijzer uit beschadigde weefsels, en microaerobiose6,7,8.
De specifieke fysisch-chemische omstandigheden in een bepaalde context van biofilminfectie kunnen daarom de reacties op antibiotica beïnvloeden. Ten eerste hangt de structuur en diepte van de extracellulaire matrix af van lokale omgevingsomstandigheden, zoals voedingsstoffen of afschuifkrachten. Ten tweede kunnen omgevingssignalen de expressie van specifieke antibioticaresistentiegenen activeren. De CF-pathogene Pseudomonas aeruginosa vertoont bijvoorbeeld een verhoogde expressie van een bèta-lactamase en verminderde expressie van porines in CF-sputum versus in vitro9, terwijl een andere CF-pathogene, Burkholderia cenocepacia, bèta-lactamasen en effluxpompen upreguleert wanneer deze in CF-sputum10worden gekweekt . Ten derde kunnen in-host condities een fysiologische of genetische omschakeling naar antibioticatolerante fenotypes signaleren, die moeilijk in vitro te heroveren zijn. Deze omvatten kleine kolonievarianten van de CF-ziekteverwekker Staphylococcus aureus11,12.
Al deze gegevens geven aan dat wanneer diagnostische laboratoria individuele klonen isoleren van pathogene biofilm en AST uitvoeren op planktonische of agar-plate gekweekte culturen in standaard laboratoriummedia (bouillonmicrodilutie, schijfdiffusie of Etest), de resultaten vaak niet voorspellen welke antibiotica daadwerkelijk in vivo zullen werken. Zelfs als in vitro biofilmtesten worden gebruikt, kunnen ze geen in vivo-achtig biofilmfenotype signaleren vanwege verschillen in het gebruikte medium en bevestigingsoppervlak, dus assays met behulp van stroomcellen of microplaatplatforms met hoge doorvoer kunnen de gevoeligheid van antibiotica overschatten13. Hetzelfde probleem geldt voor onderzoekers in de academische wereld en de industrie die nieuwe antibiofilmmiddelen willen ontwikkelen: het testen van het potentieel van geneesmiddelen met behulp van in vitro platforms zoals stroomcellen, microtiterplaten of biofilmreactoren van het Center for Disease Control kan de biofilmeffectiviteitsbalk te laag leggen en valse positieven produceren in de onderzoeks-, ontwikkelingspijplijn.
De slechte correlatie tussen AST-resultaten en klinische uitkomst na antibioticabehandeling in CF is bekend. Veel clinici negeren gewoon diagnostisch lab AST omdat er geen uniforme, CF-specifieke richtlijnen zijn voor het interpreteren van deze resultaten en nemen in plaats daarvan van geval tot geval beslissingen voor het voorschrijven. Er zijn pogingen ondernomen om CF AST te verbeteren met behulp van het Calgary biofilmapparaat, dat biofilms gebruikt die zijn gekweekt op het oppervlak van plastic pinnen in de putten van een microplaat met standaard AST-medium (bijv. kation-aangepaste Muller-Hinton bouillon)14,15. Deze test doet niet beter in het voorspellen welke antibiotica in vivo zullen werken dan standaard planktonische AST16. De impact op patiënten met CF is groot. Ondanks herhaalde toediening van antibiotica (regelmatige ingeademde antibiotica en een mediaan van 27 dagen/jaar die intraveneuze antibiotica krijgt voor personen met CF in het Verenigd Koninkrijk)17, leiden frequente en onvoorspelbare episodes van acute long exacerbatie tot progressieve longschade en, in ongeveer 90% van de gevallen, de dood door ademhalingsfalen. In een recente analyse was bacteriële longinfectie de sterkste voorspeller van medicatiekosten in CF, met een gemiddelde van € 3,6K / patiënt / jaar om de zorgkosten te sturen18,19.
Voor acute infecties van anders gezonde individuen is huidig onderzoek en beleid gericht op snelle AST op basis van bijvoorbeeld point-of-care genomische voorspelling ideaal20. Maar in het geval van chronische CF-infecties is het duidelijk dat een andere aanpak nodig is: de implementatie van AST in host-nabootsende modellen die de in vivo omgeving en pathogene metabolische toestand beter samenvatten en de vorming van realistische biofilmstructuur mogelijk maken.
We hebben eerder een CF-biofilmmodel ontwikkeld dat secties van varkensbronchiole omvat die zijn geïncubeerd in synthetisch CF-sputum en geïnfecteerd met P. aeruginosa of S. aureus. Niet-geïnfecteerde EVPL behoudt een normale histopathologie gedurende 7 dagen, maar laboratorium- of klinische isolaten van P. aeruginosa en S. aureus vormen reproduceerbaar in vivo-achtige aggregaten rond het weefsel, die de etiologie van CF-infectie21,22,23nabootsen . We presenteren een protocol voor het gebruik van dit hoogvalide, high-throughput model als een op maat gemaakt biofilm AST-platform voor CF en presenteren voorbeeldige resultaten die de hoge tolerantie van pathogene biofilms voor klinisch gebruikte antibiotica laten zien wanneer ze in het model worden gekweekt. Het model zou gemakkelijk kunnen worden opgenomen in onderzoeks-, ontwikkelingspijplijnen voor het beheer of de preventie van biofilmvorming en mogelijk in diagnostische AST. De meeste gebruikte apparatuur (zie tabel met materialen) kan gemakkelijk worden gevonden in een typisch microbiologisch laboratorium, hoewel een kraalklopper essentieel is, en we hebben uit werk met medewerkers ontdekt dat een geschikte ultraviolette kiemdodende kast mogelijk ook moet worden aangeschaft. Aangezien de longen afkomstig zijn van commerciële slagers of slachthuizen, geeft het model geen ethische zorgen.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL insulinspuiten met 29G naald</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well cultuurplaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol of iets dergelijks voor oppervlakte sterilisatie en vlam-behandeling van het dissectie-uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar platen om strepen van P. aeruginosa/S. aureus te bereiden (elk geschikt medium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie - voorgesteriliseerde door autoclaving - om het snijbord te bedekken waarop je de longen zal dissecteren.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead beater ontworpen voor 2 mL buizen</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>FastPrep-24 Classic bead beating grinder en lysis systeem</td></tr><tr><td>Breathe-easy of Breathe-easier afdichtmembraan voor multiwell platen</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1 of BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrander&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Snijbord - wij raden een plastic bord aan om eenvoudige decontaminatie met alcohol mogelijk te maken.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolbox om longen naar lab te vervoeren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar in verschillende maten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 2 mL versterkte buizen&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15545809</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 2,38 mm metalen kralen</td><td>Thermo Fisher</td><td>15505809</td><td></td></tr><tr><td>Germicide UV-kabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulinspuiten -&nbsp; 0,5 mL met 29G naald.</td><td>VWR</td><td>BDAM324892</td><td></td></tr><tr><td>Grote palletmes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar platen om CFU in longbiofilm homogenaat te beoordelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gemonteerde scheermesjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0,1 &micro;m x 500 ml steriele filterunit</td><td>Thermo Fisher</td><td>10474415</td><td>Voor het filter-steriliseren van SCFM</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zoutoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststof snijbord en aluminiumfolie om een steriele en schoon te maken dissectieoppervlak te creëren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCFM ingrediënten zoals vermeld in Tabel S1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selectie van pincetten (botte uiteinden aanbevolen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selectieve agar platen om specifiek P. aeruginosa / S. aureus CFU in longbiofilm homogenaat te beoordelen, indien nodig.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geschikte containers voor het weggooien van besmette scherpe voorwerpen en varkenslongweefsel, volgens de gezondheids- & veiligheidsbeleid van uw instelling.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

antibioticum werkzaamheid testen in een ex vivo model van pseudomonas aeruginosa en staphylococcus aureus biofilms in de cystic fibrosis lung

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

Het effectieve voorschrijven van antibiotica voor de bacteriële biofilms die aanwezig zijn in de longen van personen met cystische fibrose (CF) wordt beperkt door een slechte correlatie tussen resultaten van antibioticagevoeligheidstests (AST) met behulp van standaard diagnostische methoden (bijv. bouillonmicrodilutie, schijfdiffusie of Etest) en klinische resultaten na antibioticabehandeling. Pogingen om AST te verbeteren door het gebruik van kant-en-klare biofilmgroeiplatforms laten weinig verbetering van de resultaten zien. Het beperkte vermogen van in vitro biofilmsystemen om de fysisch-chemische omgeving van de CF-long na te bootsen en daarom bacteriële fysiologie en biofilmarchitectuur, werkt ook als rem op de ontdekking van nieuwe therapieën voor CF-infectie. Hier presenteren we een protocol om AST van CF-pathogenen uit te voeren die als volwassen, in vivo-achtige biofilms worden gekweekt in een ex vivo CF-longmodel bestaande uit varkensbronchiolaire weefsel en synthetisch CF-sputum (ex vivo varkenslong, EVPL).
Er bestaan verschillende in vitro tests voor biofilmgevoeligheidstests, met behulp van standaard laboratoriummedium of verschillende formuleringen van synthetisch CF-sputum in microtiterplaten. Zowel groeimedium als biofilmsubstraat (polystyreenplaat versus bronchiolaire weefsel) hebben waarschijnlijk invloed op de tolerantie van biofilmbiobiotica. We tonen een verbeterde tolerantie van klinische Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus isolaten in het ex vivo model; de effecten van antibioticabehandeling van biofilms zijn niet gecorreleerd met de minimale remmende concentratie (MIC) in standaard microdilutietesten of een gevoelige/resistente classificatie in schijfdiffusietesten.
Het ex vivo-platform kan worden gebruikt voor op maat gemaakte biofilm AST van patiëntmonsters en als een verbeterd testplatform voor potentiële antibiofilmmiddelen tijdens farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling. Het verbeteren van het voorschrijven of versnellen van de ontdekking van antibiofilmgeneesmiddelen door het gebruik van meer in vivo-achtige testplatforms kan de gezondheidsresultaten voor personen met CF drastisch verbeteren en de kosten van klinische behandeling en ontdekkingsonderzoek verlagen.

Het EVPL-model biedt een testplatform met hoge doorvoer, waardoor het mogelijk is om een groot aantal bacteriële isolaten in één keer te screenen op gevoeligheid voor antibiotica (figuren 1 en 2) of om stammen in één experiment te screenen op een reeks antibioticaconcentraties (figuur 3). Met de praktijk hebben we ontdekt dat ongeveer 200 bronchiolaire weefselsecties in 2 uur uit longen kunnen worden bereid. Het hele experiment voor AST kan binnen de normale werkuren worden afgerond. De groei van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus isolaten en de vaststelling van 48 uur biofilm in het model is betrouwbaar en produceert, wanneer gecontroleerd door levensvatbare celtellingen, consistente bacteriële belastingen (figuren 1 en 2). Afbeeldingen van weefselgerelateerde biofilms van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus gekweekt in EVPL kunnen worden gevonden, samen met protocollen voor de voorbereiding op lichtmicroscopie en histologische kleuring, in onze publicaties21,23. De reproduceerbaarheid van CFU-tellingen varieert echter voor verschillende bacteriesoorten. Dit kan worden gekwantificeerd met behulp van standaard herhaalbaarheidsberekeningen na ANOVA25; we hebben vastgesteld dat er doorgaans een grotere variatie is tussen CFU in repliceerde longmonsters voor S. aureus dan voor P. aeruginosa. Wij bevelen aan dat bij de goedkeuring van het model door een laboratorium herhaalde berekeningen worden uitgevoerd op proefexperimenten om experimentele technieken te optimaliseren en de grootte van de monsters te bepalen die in eindexperimenten moeten worden gebruikt (een voorbeeld hiervan is te vinden in het gegevenssupplement voor Sweeney et al26).
Wanneer gekweekt in de EVPL, tonen biofilms van P. aeruginosa en S. aureus een verhoogde tolerantie voor antibiotica aan in vergelijking met gevoeligheid in standaard, door de industrie goedgekeurde bouillon MIC (Figuur 1) en schijftesten met behulp van standaardmedia (Figuur 2). De verschillende effecten van verschillende antibiotica op EVPL-gevestigde biofilm zijn te onderscheiden, bijvoorbeeld P. aeruginosa-doden wordt bereikt in EVPL met 4-16X MIC ciprofloxacine, maar niet met 4-8X MIC chlooramfenicol (Figuur 1). Een tweemaal daagse dosis van 600 mg linezolid bereikt een serumconcentratie boven mic90 voor gevoelige pathogenen (4 μg/ml)27 en wordt beschouwd als voldoende blootstelling zonder nadelige bijwerkingen28. Gegevens in figuur 2 tonen aan dat S. aureuspopulaties, gevoelig voor linezolid in de schijftest, in staat zijn om doelserumconcentraties te overleven, en hoger (12 μg/ml), in EVPL. Er is geen duidelijke correlatie tussen MIC- en antibioticumeffecten op evpl-gekweekte biofilms voor P. aeruginosa (figuur 1). Het verkrijgen van een nauwkeurigere meting van in vivo antibioticatolerantie is belangrijk omdat suboptimale dosering van antibiotica het risico op selectie voor resistentie bij chronische infectie kan verhogen.
Het is algemeen bekend dat de biofilmmodus van groei de bacteriële gevoeligheid voor antibiotica aanzienlijk kan verminderen. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van vele in vitro biofilmtesten en het gebruik van minimale biofilm uitroeiingsconcentratie (MBEC)14,15 in plaats van MIC als een nauwkeurigere voorspeller van gevoeligheid bij chronische infectie. Het gebruik van SCFM (in verschillende formuleringen) is ook aanbevolen voor gebruik in MIC- of MBEC-tests29. Hier laten we zien dat zelfs een geoptimaliseerde in vitro assay de gevoeligheid voor colistine in de EVPL niet nauwkeurig kan voorspellen. De hoeveelheid antibioticum die nodig is om 3 log10-doden van EVPL-gekweekte bacteriën te bereiken, is vaak aanzienlijk hoger dan de MIC of de MBEC berekend op basis van standaard in vitro assays, zelfs wanneer SCFM voor deze test wordt gebruikt (Figuur 3). Dit is in overeenstemming met een Cochrane-beoordeling die meldde dat de huidige implementaties van in vitro biofilm gevoeligheidstests geen verhoogd voorspellend vermogen bieden voor het voorschrijven van antibiotica in CF in vergelijking met standaard gevoeligheidstests16.
Het is ook eenvoudig om het model te gebruiken om de impact van antibiotica op biofilmbacteriën in de loop van de tijd te beoordelen, omdat voldoende replicastukken van de long kunnen worden ingeënt om destructieve bemonstering mogelijk te maken. Naast het onderscheiden van verschillen tussen antimicrobiële middelen, kan het model veranderingen in gevoeligheid benadrukken in verschillende bacteriële groeistadia of leeftijd van biofilm en voor verschillende antibioticadoseringsintervallen. Figuur 4 illustreert de toenemende tolerantie van P. aeruginosa biofilms voor meropenem naarmate ze ouder worden. Dit kan nuttig zijn om de werkzaamheid van nieuwe middelen te bepalen, bijvoorbeeld of ze effectiever zijn tijdens snelle celdeling. Het kan ook een belangrijke overweging zijn bij het vaststellen van de beperkingen van een experiment, omdat het nodig kan zijn om de leeftijd van biofilm te standaardiseren en te valideren om te voorkomen dat de leeftijd invloed heeft op de resultaten.
In figuur 5werd de overleving van S. aureus gemeten bij 4 uur en 24 uur na blootstelling aan flucloxacilline en was het mogelijk om verschillen in de vermindering van het aantal bacteriële cellen in de tijd en tussen isolaten waar te nemen. Dit kan nuttig zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, bijvoorbeeld bij het definiëren van farmacokinetische en farmacodynamische parameters of bij het verduidelijken van de werkingswijze van een nieuw middel.
Variaties in bacteriële belasting nemen vaak toe met langere kweektijden. Dit is te zien in de onbehandelde controle in figuur 5 na de ontwikkeling van 48 uur biofilm en nog eens 24 uur blootstelling aan het doseringsinterval van antibiotica. Variatie is inherent aan het model; elk longmonster is onafhankelijk van anderen en weerspiegelt de natuurlijke variatie van longen. Het is daarom belangrijk ervoor te zorgen dat er voldoende repliceergegevens worden opgenomen om validatie en een nauwkeurige interpretatie van de resultaten mogelijk te maken. We verwijzen de lezer terug naar onze aanbeveling om herhaalde berekeningen uit te voeren op de gegevens om de selectie van robuuste steekproefgrootten mogelijk te maken.
Voor de eenvoud hebben we representatieve gegevens gepresenteerd van gerepliceerde weefselsecties die in elk experiment uit één enkel paar longen zijn verkregen, maar in de praktijk is het noodzakelijk om herhaalde experimenten uit te voeren op weefselsecties van repliceerde dieren. Dit moet worden gedaan om rekening te houden met eventuele biologische variatie tussen individuele varkens, en we verwijzen de lezer naar ons gepubliceerde werk voor voorbeelden van hoe consistent de resultaten kunnen zijn tussen weefsels van repliceerde varkens en hoe deze variatie wordt verantwoord in statistische analyse van gegevens met behulp van analyse van variantie (ANOVA)/algemene lineaire modellen (GLM)21,26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig01.jpg"> Figuur 1. Totale CFU van 11 CF Pseudomonas aeruginosa klinische isolaten teruggevonden uit het EVPL-model na behandeling met antibiotica. Representatieve resultaten van antibioticabehandeling van P. aeruginosa in het EVPL-model. Elke stam werd gedurende 48 uur gekweekt op EVPL-weefsel en vervolgens overgedragen op antibioticum (driehoeken) of PBS als een controle (cirkels) gedurende 18 uur en de CFU / long bepaald. De MIC voor het geschikte antibioticum bepaald in standaard kation-aangepaste MHB wordt weergegeven tussen haakjes naast elke stam (x-as). De soorten worden geordend door de MIC-waarden te verhogen. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van t-tests indien van toepassing en Mann-Whitney U-tests voor niet-parametrische datasets. Significante verschillen tussen met antibiotica behandelde en onbehandelde weefsels worden aangeduid met sterretjes(P < 0,05). A. Teruggewonnen levensvatbare tellingen van P. aeruginosa biofilms gekweekt in het EVPL-model en behandeld met 64 μg/ml chlooramfenicol (hoogste MIC-waarde geregistreerd). Voor elk isolaat werd het gestandaardiseerde gemiddelde verschil in KVE tussen met chlooramfenicol behandelde en onbehandelde weefselsecties berekend met behulp van Cohen's d. Er was geen correlatie tussen mic-waarde in de standaardtest en de afname van levensvatbare celnummers in het EVPL-model, gemeten door Cohen's d (Spearman's rank correlation, rs = 0,45, p = 0,16) B. Resultaten van P. aeruginosa biofilms gekweekt in het EVPL-model en behandeld met 64 μg/ml ciprofloxacine (hoogste MIC-waarde geregistreerd). Waarden onder de stippellijn lagen onder de detectielimiet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig02.jpg"> Figuur 2. Totale CFU van 8 Staphylococcus aureus CF klinische isolaten teruggevonden uit het EVPL-model na behandeling met linezolid. Elke stam werd gedurende 48 uur gekweekt op EVPL-weefsel en vervolgens gedurende 24 uur overgebracht naar linezolid (driehoeken) of onbehandeld als een controle (cirkels). Alle stammen bleken gevoelig te zijn voor linezolid met behulp van de standaard schijfdiffusietest volgens EUCAST-richtlijnen30 (remmingszone > 21 mm). Gegevens werden geanalyseerd met behulp van t-tests indien van toepassing en Mann-Whitney U-tests voor niet-parametrische datasets(P < 0,05). Er werden geen significante verschillen gevonden tussen behandeld en onbehandeld antibiotica voor een van de stammen. Waarden onder de stippellijn lagen onder de detectielimiet. A. Resultaten van S. aureus biofilms in het EVPL-model behandeld met 4 μg/ml linezolid (klinisch breekpunt voor gevoelig/resistent volgens EUCAST-classificatie31). B. Resultaten van S. aureus biofilms in het EVPL-model behandeld met 12 μg/ml linezolid (gegevens gereproduceerd uit Sweeney et al23). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig03.jpg"> Figuur 3. Levensvatbare Pseudomonas aeruginosa celtellingen van de laboratoriumstam PA14 en 4 CF klinische isolaten teruggevonden uit het EVPL-model na behandeling met toenemende concentraties colistine. Elke stam werd gedurende 48 uur gekweekt op EVPL-weefsel en vervolgens gedurende 18 uur blootgesteld aan colistine. De MIC die wordt bepaald in het standaard kationengecorrigeerde MHB-medium wordt tussen haakjes naast elke stamnaam weergegeven. De verticale lijnen tonen de MBEC-waarde bepaald in MHB (volume) en SCFM (onderbroken), met uitzondering van SED6, waarbij de waarde in beide media hetzelfde was. De niet-ingevulde gegevenspunten vertegenwoordigen de laagste concentratie geteste colistine die resulteerde in ≥ 3-log10 reductie van CFU/longvergelijkend met de onbehandelde monsters (0 μg/ml colistine) (gegevens gereproduceerd uit Sweeney et al26). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig04.jpg"> Figuur 4. Representatieve levensvatbare Pseudomonas aeruginosa celtellingen van een groeiverloop op het EVPL-model gedurende 24 uur, en daaropvolgende behandeling met 64 μg/ml meropenem. De laboratoriumstam P. aeruginosa PA14 en 3 CF klinische isolaten werden gekweekt op EVPL-weefsel gedurende de tijd die op de x-as werd weergegeven, vervolgens gedurende 24 uur overgebracht naar meropenem (driehoeken) of onbehandeld als een controle (cirkels). Vervolgens werd de CFU/long bepaald. De MIC bepaald in kation-aangepast MHB-medium wordt tussen haakjes naast elke stamnaam weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig05.jpg"> Figuur 5. Representatieve levensvatbare Staphylococcus aureus celtellingen na groei op het EVPL-model en vervolgens behandeld met 5 μg/ml flucloxacilline gedurende een tijdsverloop van 24 uur. De controlestam ATCC29213 en twee klinische CF-isolaten werden gedurende 48 uur gekweekt op EVPL-weefsel en vervolgens overgebracht naar flucloxacilline (driehoeken) of onbehandeld gelaten als een controle (cirkels) gedurende 4 uur en 24 uur, voordat CFU/long werd bepaald (gegevens gereproduceerd uit Sweeney et al23). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Figuur S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/FigureS1_updated.pdf" target="_blank">Klik hier om deze afbeelding te downloaden.</a>  
Tabel S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/TABLE%20S1.docx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Deze workflow kan worden gebruikt om antibiotica gevoeligheidstests uit te voeren met behulp van een vastgesteld ex vivo model van bacteriële biofilm in de longen van personen met cystische fibrose. Het gebruik van dit model kan de klinische validiteit van MBEC-test (minimale biofilmuitroeiingsconcentratie) verbeteren.

Antibioticum werkzaamheid testen in een Ex vivo model van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Biofilms in de Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Met deze methode kunt u bacteriën kweken in een omgeving die vergelijkbare celfysiologie en biofilmmorfologie activeert als die welke u ziet bij cystische fibrose longinfecties. De longen zijn een afvalproduct in de vleesindustrie, dus er zijn geen ethische zorgen. Het model biedt een platform om menselijke infectie na te bootsen zonder dat er een levend diermodel nodig is.Deze techniek geeft onderzoekers een nieuwe manier om kandidaat-geneesmiddelen te screenen op het potentieel om de biofilms die zich vormen in cystische fibroselongen binnen te dringen en te vernietigen. Met verdere ontwikkeling en validatie zijn we van mening dat het EVPR-model potentieel gebruik kan hebben voor gespecialiseerde en geïndividualiseerde antibioticagevoeligheidstests. Verkrijg longen onmiddellijk na het slachten en transporteer ze naar het laboratorium in een huishoudelijke koelbox.Werk op een gesteriliseerd oppervlak en onder een vlam. Leg de longen op een schone plastic snijplank bedekt met autoclaaf aluminiumfolie en controleer of de bronchiolen intact blijven. De longen zijn niet geschikt voor gebruik als er schade is opgetreden in het slachthuis of tijdens het transport.Verwarm een palletmes onder een vlam en raak het mes heel kort aan op het gebied van de long rond de bronchiol om het oppervlak van het weefsel te steriliseren. Snijd het oppervlakteweefsel rond de bronchiol weg met behulp van een steriel gemonteerd scheermesje, waardoor incisies parallel aan de bronchiol worden gemaakt om schade te voorkomen. Zodra de bronchiol is blootgesteld, maak je een dwarsdoorsnede door de bronchiol op het hoogste punt zichtbaar.Houd met een steriele tang het vrije uiteinde van de bronchiol lichtjes vast en snijd het resterende ongewenste weefsel weg met behulp van een steriel gemonteerd scheermesje. Maak een laatste dwarsdoorsnede-incisie over de bronchiol voordat een vertakking zichtbaar is om de bronchiol uit de longen te verwijderen. Plaats de bronchiol in de eerste DMEM RPMI 1640 wasbeurt.Laat het in de was en oogst extra secties van bronchiole uit dezelfde long om voldoende weefselsecties op te leveren voor het geplande experiment. Plaats eventuele extra bronchiolaire secties uit dezelfde long in de was en laat ze minstens twee minuten in de was staan. Verwijder de bronchiolen uit de eerste wasbeurt en plaats de monsters in een steriele petrischaal.Houd elke bronchiole lichtjes vast met een steriele tang en zorg ervoor dat het weefsel niet wordt beschadigd. Verwijder zoveel mogelijk overgebleven zacht weefsel en snijd het weefsel in stroken van vijf millimeter breed met een steriele dissectieschaar. Plaats alle bronchiolaire weefselstrips in de tweede DMEM RPMI 1640 wasbeurt.Laat ze minstens twee minuten in de was, verwijder vervolgens de tissuestrips uit de tweede wasbeurt met een steriele tang en plaats ze in een schone, steriele petrischaal. Verwijder het resterende zachte weefsel dat aan de bronchiol is bevestigd en snijd de stroken in vierkanten met een steriele dissectieschaar. Voeg de derde DMEM RPMI 1640 wasbeurt toe aan de Petrischaal en meng de tissuestukken in de was lichtjes door de schaal te wervelen.Giet de derde was uit de Petrischaal zonder de weefselstukken te verwijderen. Voeg vervolgens de laatste SCFM-was toe, zodat alle weefselstukken bedekt zijn. Steriliseer het weefsel in SCFM onder UV-licht gedurende vijf minuten.Gebruik steriele tangen om elk gesteriliseerd bronchiolaire weefselstuk over te brengen in individuele putten van een 24-putplaat met SCFM-agarose pads. Om elk weefselstuk te infecteren met de gewenste bacteriële stam, raak je een kolonie aan die op een agarplaat is gegroeid met de punt van een 29-gauge naald bevestigd aan een steriele insulinespuit van 0,5 milliliter en raak je de kolonie vervolgens aan op het weefselstuk en prikt u voorzichtig het oppervlak. Prik voor de niet-geïnfecteerde regelaars voorzichtig het oppervlak van het weefselstuk met de punt van de naald en gebruik vervolgens een pipet om 500 microliters SCFM aan elke put toe te voegen.Steriliseer een ademend afdichtingsmembraan voor elke 24-put plaat onder ultraviolet licht gedurende 10 minuten. Verwijder het deksel van de 24-put plaat en vervang het door het ademende membraan en incubeer de platen vervolgens op 37 graden Celsius zonder te schudden. Stel repliceersets van longstukken op uit ten minste twee onafhankelijke longen, met behulp van één set voor een negatieve controle en één set per elke te testen concentratie antibioticum.Inspecteer na 48 uur incubatie de niet-geïnfecteerde weefselstukken visueel op groei van endogene bacteriën, waardoor het medium rond deze secties troebel zou zijn. Als de groei die typisch is voor de geselecteerde studiesoort wordt waargenomen, start u het experiment opnieuw met verse longen. Als de niet-geïnfecteerde weefselsecties geen of minimale bacteriële groei vertonen, bereid dan één 24-wells wasplaat en één 24-well behandelingsplaat voor.Elke put van de behandelingsplaat moet 500 microliter verse SCFM bevatten zonder antibiotica of met het antibioticum van belang. Verwijder elk geïnfecteerd weefselstuk van de incubatieplaat met een vlamgesteriliseerde tang. Wervel het kort in een verse put van de wasplaat om niet-biofilm-geassocieerde bacteriële cellen te verwijderen en breng het over naar de juiste put van de behandelingsplaat.Sluit de behandelingsplaat af met een vers ademend membraan en incubeer het vervolgens op 37 graden Celsius zonder 18 tot 24 uur te schudden. Gebruik een vlamgesteriliseerde tang om elk longstuk van de 24-putplaat te verwijderen en doe het in een steriele homogenisatiebuis van twee milliliter met een milliliter PBS en een gram metalen kralen. Kraal sloeg 40 seconden met vier meter per seconde.Verdun het longhomogenaat serieel met PBS en leg het op LB-agar om de kolonievormende eenheden te bepalen in individuele, onbehandelde en met antibiotica behandelde weefselstukken. Wanneer gekweekt in de ex-vivo varkenslong of EVPL, tonen biofilms van P.aeruginosa en S.aureus een verhoogde tolerantie voor antibiotica in vergelijking met gevoeligheid in standaard, door de industrie goedgekeurde bouillon MIC- en schijftesten met behulp van standaardmedia. De verschillende effecten van verschillende antibiotica op een EVPL-gevestigde biofilm zijn te onderscheiden.Bijvoorbeeld, P.aeruginosa doden wordt bereikt in EVPL met 4 tot 16X MIC ciprofloxacine, maar niet met 4 tot 8X MIC chlooramfenicol. S.aureus populaties die gevoelig zijn voor linezolid in de schijftest zijn in staat om doel-serum concentraties te overleven en hoger in EVPL. Zelfs een geoptimaliseerde in-vitrotest kan de gevoeligheid van P.aeruginosa voor colistine in de EVPL niet nauwkeurig voorspellen.De hoeveelheid antibioticum die nodig is om drie log 10-doden van EVPL-gekweekte bacteriën te bereiken, is vaak aanzienlijk hoger dan de MIC of de MBEC berekend op basis van standaard in-vitrotesten. Naast het onderscheiden van verschillen tussen antimicrobiële middelen, kan dit model veranderingen in gevoeligheid in verschillende bacteriële groeistadia en voor verschillende antibioticadoseringsintervallen benadrukken. De toenemende tolerantie van P.aeruginosa biofilms voor meropenem naarmate ze ouder worden, wordt hier getoond.S.aureus overleving werd gemeten na 4 en 24 uur na blootstelling aan flucloxacilline, waardoor het mogelijk was om verschillen in de vermindering van het aantal bacteriële cellen in de tijd en tussen isolaten waar te nemen. Variaties in bacteriële belasting nemen vaak toe met langere kweektijden. Dit is te zien in de onbehandelde controle na 48-uurs biofilmontwikkeling en een verdere blootstelling van 24 uur om rekening te houden met het doseringsinterval van antibiotica.Het is cruciaal om een uitstekende steriele techniek te behouden tijdens de dissectie, dus we raden aan om de dissectie in een lab of in een deel van uw laboratorium te doen dat u nooit gebruikt voor microbiologisch werk. We hebben het model onlangs gebruikt om de invoer van colistine in biofilm te onderzoeken, en het model heeft een goed potentieel voor gebruik in onderzoek om de levering van geneesmiddelen in biofilms te verbeteren.

antibiotic-efficacy-testing-an-ex-vivo-model-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o- cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.

P. aeruginosa Geïnfecteerde 3D Co-Cultuur van Bronchiale epitheelcellen en macrofagen bij Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van Pseudomonas aeruginosa verschillen tussen klinische isolaten die zijn gekweekt van patiënten met cystische fibrose en chronische longinfectie. Na confocale microscopie kan COMSTAT-software worden gebruikt om variaties in biofilmarchitectuur (bijv. oppervlakte, dikte, biomassa) voor individuele isolaten te kwantificeren om de werkzaamheid van anti-infectiemiddelen te beoordelen.

Kwantificering van de effecten van antimicrobiële stoffen op in vitro biofilmarchitectuur met behulp van COMSTAT-software

Dit protocol beschrijft een cystic fibrosis (CF) longrelevant vier-species polymicrobieel biofilmmodel dat kan worden gebruikt om de impact van bacteriële interacties tussen soorten te onderzoeken.

Het kweken van een cystische fibrose-relevante polymicrobiële biofilm om fenotypes van de gemeenschap te onderzoeken

Deze methodologie maakt het mogelijk om een polymicrobieel biofilmmodel in cystische fibrose op te zetten voor antimicrobiële gevoeligheidstesten in onderzoeks- en klinische laboratoria. Dit model biedt nauwkeurige en betrouwbare resultaten over een reeks outputs.

Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

Deze studie schetst een raamwerk voor het ontwikkelen van een geaggregeerde polymicrobiële biofilmmodel en het optimaliseren van een RNA-extractieprotocol om de Pseudomonas aeruginosa genexpressie te beoordelen die representatief is voor de longomgeving bij cystische fibrose. Toepassingen omvatten het evalueren van antimicrobiële effecten en het bestuderen van alternatieve antibiotica onder omstandigheden die relevant zijn voor cystische fibrose.

Aggregaatbiofilmmodel van cystische fibrose om infectie-relevante genexpressie te bestuderen

Dit artikel beschrijft verschillende methoden van...

Co-cultuur modellen van Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown op Live menselijke luchtwegen cellen

Experimentele rat endocarditis model veroorzaakt door...

Experimentele Endocarditis Model van Methicilline Resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) in Rat

We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

We hebben een muislongletselmodel ontwikkeld door intra-tracheale injectie van bacteriën Pseudomonas aeruginosa. Dit model bootst longletsel tijdens pneumonie na en is klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Leer antibiotica gevoeligheidstesten voor cystic fibrose pathogenen met een ex vivo varkenslongmodel. Deze methode bootst de longomgeving beter na dan standaard laboratoriumtesten.

Antibioticum werkzaamheid testen in een Ex vivo model van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Biofilms in de Cystic Fibrosis Lung (Video) | JoVE Journal

Antibioticum werkzaamheid testen in een Ex vivo model van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Biofilms in de Cystic Fibrosis Lung

Meer video's verkennen