Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Cryo Soft X-ray tomografie kan kwantitatief waardevolle informatie op cellulair niveau leveren die kan worden gebruikt als een stand-alone of combinatie met andere beeldvormingstechnieken. Sensorbeeld in een bevroren gehydrateerde toestand die nodig zijn voor kleuring of sectie. Bovendien is het een high-throughput techniek, omdat elk tomogram in slechts een paar minuten wordt verzameld.

Zachte röntgen cryotomografie biedt een perfect platform voor het volgen van het proces van celherstel in geïnfecteerde of defecte cellen op eencellig niveau. Deze techniek kan de werkzaamheid van nieuwe antivirale geneesmiddelen of gentherapie rapporteren om de infectie van geredigeerde fenotypen om te keren. Om monsters in de röntgenmicroscoop van de transmissie te laden, koelt u de transferkamer met vloeibare stikstof totdat deze minder dan 100 Kelvin bereikt.

Vul het werkstation met extra vloeibare stikstof en zet de verwarming van de rand van het werkstation aan. Wanneer de rand van het werkstation stopt met koken, plaatst u de cryobox met roosters op de juiste plaatsen in het werkstation onder cryoomstandigheden en laadt u de roosters op de eerder gekoelde monsterhouders. Laad de houders op de shuttle en bescherm ze met de hoezen.

Laad de shuttle in de overslagkamer met minder dan 100 Kelvin en pomp de kamer naar beneden tot een laag vacuüm. Bevestig de transferkamer aan de microscoop en volg de vacuümprocedure op het scherm om de transferkamershuttle in de microscoop te laden. Zodra de shuttle met de monsters in de microscoop ligt, gebruikt u de microscooprobotarm om één monsterhouder naar de monsterfase over te brengen.

Voor brightfield-beeldvorming van het raster met de online zichtbare lichtmicroscoop selecteert u de zichtbare lichtmicroscoopcamera en schakelt u de LED-bron van de zichtbare lichtmicroscoop in voor brightfield-beeldvorming. Klik op Bewegings-, besturings-, monster- en monstertheta om het monster tot min 60 graden te draaien zodat het naar het microscoopobjectief van zichtbaar licht kijkt, en selecteer Motion Control en Sample en verander monster X en monster Y om het monster naar de verwachte gecentreerde posities te verplaatsen. Selecteer Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Acquisitiemodi, Continu en Start en klik op Motion Control en Sample om monster Z te selecteren om de focus te verfijnen met kleinere stappen tot vijf micron totdat de cellen en/of de gaten van de koolstofondersteuningsfilm scherp zijn.

Selecteer vervolgens Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Acquisitiemodi, Mozaïek en Start om de verwerving van een volledige mozaïekkaart van het raster in brightfield-modus te starten met behulp van de standaardwaarden voor het mozaïek. Voor mozaïekbeeldvorming in fluorescentiemodus schakelt u de LED-bron voor de zichtbare lichtmicroscoop uit voor brightfield-beeldvorming en selecteert u de LED-lichtbron die overeenkomt met de gewenste excitatiegolflengte en het bijbehorende optische filter handmatig op de installatie. Selecteer Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Acquisitiemodi, Continu en Start en klik op Motion Control en Sample om monster Z te selecteren om de focus op het fluorescentiebeeld te verfijnen.

Klik vervolgens op Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Acquisitiemodi, Mozaïek en Start om een mozaïekkaart te verkrijgen met behoud van de positionele X- en Y-parameters van het brightfield-mozaïek. Schakel vervolgens de LED-lichtbron uit. Voor de verwerving van röntgenmozaïek wijzigt u de uitgangsspleet in vijf micron en gebruikt u een belichting van één seconde bij MISTRAL.

Selecteer Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Camera-instellingen en Binning om de focus aan te passen met behulp van de voorbeeld-Z-vertaling. Selecteer Motion Control en Sample om monster Z te selecteren.Begin in stappen van vijf micron en verfijn de focus tot stappen van 0,5 micron totdat de cel of de koolstoffoliegaten goed scherp zijn. Als u een mozaïekkaart van het gaasplein wilt verkrijgen, klikt u op Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Acquisitiemodus, Mozaïek en Start.

Wanneer de kaart is verkregen, klikt u op Motion Control en Sample en wijzigt u sample X en sample Y om het sample naar een vlakke veldpositie te verplaatsen. Stel de belichtingstijd in op één seconde bij MISTRAL. Normaliseer vervolgens het verkregen mozaïek door het platte veldbeeld om de overdracht te verkrijgen en het genormaliseerde mozaïek op te slaan.

Als u het monster op de rotatieas wilt uitlijnen met de rotatie op nul graden, selecteert u Motion Control en Sample en wijzigt u het monster X, monster Y en monster Z om zich te concentreren op de functie van de cel die op de rotatieas moet worden geplaatst. Als u het monster naar een positieve thèta-positie wilt roteren, selecteert u Motion Control en Sample en wijzigt u Sample theta in positieve theta. Gebruik het gereedschap Lijn om een lijn te tekenen op de functie van de cel die op de rotatieas moet worden geplaatst.

Als u het monster naar een negatieve thètapositie wilt roteren, selecteert u Motion Control en Sample en wijzigt u de Sample theta in negative theta. Gebruik het gereedschap Lijn om een lijn te tekenen op de functie van de cel die op de rotatieas moet worden geplaatst. Gebruik in de positieve of negatieve theta-positie de Z-translatie van het monster om het geselecteerde kenmerk naar de middelste positie tussen beide lijnen te verplaatsen en herhaal de monsterrotatie totdat een minimale regel-tot-lijnafstand is verkregen.

Wanneer de monsterthèta gelijk is aan nul, verplaatst u de monster X tweemaal de afstand die nodig is om de geselecteerde functie in het midden van het gezichtsveld te plaatsen en verplaatst u de zoneplaat X om de functie terug te brengen naar het midden van het gezichtsveld. Als u de positie van zoneplaat Z ten opzichte van de nieuwe rotatieas opnieuw wilt optimaliseren, selecteert u Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Acquisitiemodi en Focal Series en klikt u op Start om een zoneplaat Z-focale serie op te nemen. Klik vervolgens op Motion Control en Zone Plate en selecteer zoneplaat Z om de zoneplaat Z naar de positie te verplaatsen waarop het monster scherp is.

Als u een tomogram wilt verkrijgen, klikt u op Bewegingsbesturing en Monster en selecteert u Monstertheta om de negatieve maximale hoek naar plus 0,1 te verplaatsen. Klik op Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Acquisitiemodi en Tomografie om het aantal afbeeldingen in te stellen als het totale aantal hoeken, rekening houdend met het beeld onder hoek nul en het hoekbereik, en stel het aantal afbeeldingen in. Selecteer Hoekstart en hoekeinde, klik op Microscoop, Acquisitie, Acquisitie-instellingen, Camera-instellingen en stel de belichtingstijd in.

Klik op Start om de acquisitie van de tomografie-tilt-serie te starten. Het ideale monster moet enkele cellen in het midden van een vierkant gaas hebben ingebed in een dunne laag ijs en omgeven door goed verspreide gouden fiduciale markers. Veel verschillende organellen, zoals mitochondriën, endoplasmatische reticula, vacuolen en de kern moeten kunnen worden onderscheiden in het uiteindelijke gereconstrueerde tomogram, dankzij de kwantitatieve reconstructie van de lineaire absorptiecoëfficiënten.

In deze afbeelding kan een vierkant met een hogere celdichtheid worden waargenomen. In dit voorbeeld was het vlekken minder efficiënt, wat leidde tot een dikkere ijslaag met scheuren. Hoewel sommige grotere structuren in dit preparaat kunnen worden herkend, gingen fijne details verloren in het lawaai en de korrelige textuur als gevolg van de slechte vitrificatiekwaliteit van het dikke ijs.

Het cryo-geconserveerde monster moet minimaal worden behandeld, omdat de meeste artefacten worden geïnduceerd wanneer de monsters zich in deze fase bevinden. Meestal, correlatieve cryo-zichtbaar licht fotomicroscopie, gebruik je een voorafgaand aan cryo substraat tomografie. Daarnaast kan spectrale microscopie worden uitgevoerd op relevante chemische elementen.

Dit protocol vult een niche door te werken in een monster- en resolutieregime, die niet gemakkelijk toegankelijk zijn voor een andere directe beeldvormingstechniek, waardoor weinig micron en een halve toonhoogteresolutie van 30 nanometer mogelijk zijn.