Schatting van urinenanokristallen bij mensen met behulp van calciumfluorofooretikettering en nanodeeltjestrackinganalyse

Dit protocol kan specifiek calciumhoudende nanokristallen in menselijke urine detecteren. Deze techniek kan mogelijk nuttig zijn om vroege stadia van niersteenvorming en andere ziekten geassocieerd met kristal ureum te voorspellen. Dr.Parveen Kumar, onderzoeker IV in mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Laat deelnemers drie dagen lang een laag-oxalaatdieet consumeren en 's nachts vasten. Verzamel vervolgens een 24-uurs urinemonster van de deelnemers voordat ze een oxalaatbelasting consumeren. Voed de deelnemers met een smoothie met groenten en fruit met een oxalaatlading van ongeveer acht millimol.

Laat deelnemers hun urine 24 uur na oxalaatconsumptie verzamelen en de volgende dag terugbrengen. Houd alle urinemonsters op kamertemperatuur voordat u ze verwerkt. Meet en registreer de pH van de urine en het volume van de urinemonsters.

Meng grondig en voeg 50 milliliter urine toe aan een steriele 50 milliliter conische buis. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op 10 minuten op 10 g met behulp van een bench-top centrifuge. Gooi het supernatant weg en was en resuspend de pellet opnieuw met vijf milliliter 100% ethanol.

Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op 10 minuten op 10 g met behulp van een bench-top centrifuge. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in één milliliter 100%ethanol. Bewaar het monster op min 20 graden Celsius voor latere verwerking of ga onmiddellijk verder met het kleuren van de monsters.

Verdun gouden nanodeeltjes ter grootte van 100 nanometer in ultrapure water in een verhouding van 1:1,000 en gebruik ze voor het optimaliseren van de instellingen op het instrument. Verdun de urinemonsters 20 keer in water voorafgaand aan de kleuring met vijf millimolar Fluo-4 AM gedurende 30 minuten in het donker en analyseer de monsters met behulp van NTA. Bereid calciumoxalaat- en calciumfosfaatkristallen voor zoals beschreven in het teksthandschrift voorafgaand aan de NTA-analyse.

Schakel de computer en het instrument in, open vervolgens de software en schakel de camera in. Klik op het opnamepictogram in de linkerbovenhoek van het venster om de opnamemodus te starten. Reinig het platform door er eerst lucht in te pompen met een spuit van één milliliter totdat het platform schoon lijkt.

Voeg voorzichtig twee tot drie keer water toe aan het apparaat en gebruik nog een spuit van één milliliter om eventuele luchtbellen te verwijderen. Zodra het platform schoon is, voegt u water toe en controleert u op eventuele verontreiniging op het oppervlak door de camera te bekijken en voegt u vervolgens gouden nanodeeltjes toe als een controle aan de injector van de monsterlaadpomp om het instrument in te stellen. Pas het cameraniveau op het scherm of op de knop aan de rechterkant van het instrument aan totdat het beeld gekleurde pixels begint weer te geven en verlaag vervolgens het cameraniveau.

Pas vervolgens het scherm aan om de afbeelding te optimaliseren. Klik met de linkermuisknop op de videoafbeelding. Houd de linkermuisknop ingedrukt en sleep de afbeelding omhoog en omlaag om de hele weergave te krijgen.

Stel de infusiesnelheid in en stel de camera zo in dat de gouden nanodeeltjes zichtbaar zijn op het camerascherm. Stel de infusiesnelheid in op hoog voor de eerste installatie om ervoor te zorgen dat de gouden nanodeeltjes worden gedetecteerd. Eenmaal gedetecteerd, vermindert u de snelheid tot 50 microliter per minuut om gouden nanodeeltjes te visualiseren.

Pas het cameraniveau aan om de deeltjes te visualiseren. Voor niet-besmeurde monsters past u de schermversterking aan op niveau vijf om de camerafocus te bereiken en stelt u het cameraniveau in op acht. Zodra de focus is ingesteld, neemt u het monster op.

Reinig het apparaat na optimalisatie opnieuw met water voordat u andere monsters beoordeelt om ervoor te zorgen dat de slang schoon is en dat er geen deeltjes aanwezig zijn. Om bevlekte monsters te analyseren, past u de camera aan de filterpositie aan die het geschikte fluorescerende filter bevat en laadt u verdunde en bevlekte monsters op de injector van de monsterlaadpomp, waardoor de snelheid wordt verminderd tot 20 microliters per minuut voor analyse. Stel de schermversterking in op vijf en het cameraniveau op 13.

Sla de gegevens na elke meting op. Bereken het gemiddelde aantal nanodeeltjes voor alle vijf de metingen voor elk afzonderlijk monster en analyseer de gegevens met behulp van standaarddeviatie of standaardfout van het gemiddelde. Gebruik T-tests voor gekoppelde analyse.

Fluo-4 AM was in staat om zich te binden aan zowel calciumoxalaatkristallen, die tussen de 50 en 270 nanometer groot waren en een gemiddelde concentratie hadden van 1, 260 miljoen deeltjes per milliliter, als calciumfosfaatkristallen, die tussen de 30 en 225 nanometer lagen en een gemiddelde concentratie van 2,220 miljoen deeltjes per milliliter hadden. 24-uurs urinemonsters verzameld vóór de oxalaatbelasting bevatten enkele urinenanokristallen tussen 110 en 300 nanometer groot. Daarentegen was er een aanzienlijke toename van nanokristallen in urinewegmonsters die aanwezig waren in postoxalaatmonsters.

Om de reproduceerbaarheid van de methode te bevestigen, werden de monsters driemaal gemeten en was er geen significante variatie in technische replicaties. Wanneer u dit protocol probeert, kan het moeilijk zijn om monsters zonder bellen aan de machine toe te voegen. Om dit te voorkomen, voegt u lucht en water toe aan de machine en voegt u vervolgens langzaam monsters toe.

Zorg er ook voor dat u uw monsters voortdurend controleert en dat er geen bellen aanwezig zijn. Deze nieuwe methode zal worden getest bij personen met calciumoxalaat niersteenziekte om de progressie van de ziekte te volgen en/of om het risico op niersteen te voorspellen.