Monitoring van neutrofiele Elastase en Cathepsine G-activiteit in menselijke Sputummonsters
21 mei 2021
De hierin beschreven protocollen bieden een gids om de activiteit van neutrofiele proteasen in humaan sputum te visualiseren en te kwantificeren. De toepassingen van een dergelijke analyse variëren van de evaluatie van ontstekingsremmende behandelingen tot biomarkervalidatie, geneesmiddelenscreening en grote cohort klinische studies.
Onze FRET-sonde en protocollen maken de snelle en gevoelige kwantificering van vrije en oppervlaktegebonden elastase- en cathespin G-activiteit in sputum mogelijk bij patiënten met neutrofiele luchtwegaandoeningen. Deze methoden maken het mogelijk om verschillende aspecten van proteasen pathofysiologie te verkennen. Plaatlezermetingen maken grote screenings mogelijk.
Confocale microscopie visualiseert enzymactiviteit met subcellulaire oplossing. Terwijl flow cytometrie, maakt eencellige fenotypering en protease activiteit kwantificering op een gepersonaliseerde manier mogelijk. Deze techniek kan worden uitgebreid naar verschillende luchtwegaandoeningen zoals cystische fibrose, bronchiectasie of COPD.
En het kan worden aangepast aan verschillende BioSamples zoals bloed of bronchiale alveola lavash of muizenmonsters. Voordat u met de sputuminductieprocedure begint, moet u 200 microgram van de bèta 2-receptorantagonisten salbutamol inademen. Adem daarna hypertone 6%-zoutoplossing gedurende 15 minuten in met behulp van een vernevelaar.
Verzamel het verwachte sputum in een petrischaaltje. Scheid slijmklonters van het speeksel in een petrischaaltje met behulp van een pipetpunt. Weeg het slijm en voeg vervolgens vier volumedelen per gewicht van 10% Sputolysine en PBS toe aan het sputum.
Incubeer het mengsel op kamertemperatuur op een schommelende shaker gedurende 15 minuten om het slijm op te lossen. Doof de reactie door één milliliter koude PBS toe te voegen voor elke milliliter van 10% Sputolysine. Pipetteer het mengsel om een homogene oplossing te verkrijgen.
Filtreer het mengsel door een nylon celzeef van 100 micron in een buis van 50 milliliter. Herhaal de filtratiestap door een zeef van 40 micron en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius. Doe het supernatant in een verse tube en bewaar het op ijs.
Resuspend de celkorrel voorzichtig in 500 microliter koude PBS en leg deze op ijs. Ontdooi enzymen op ijs en stel een enzymstandaardcurve op zoals beschreven in het teksthandschrift. Verdun sputummonsters parallel aan het standaardpreparaat in de activeringsbuffer.
Stel op de plaatlezer de excitatiegolflengte in voor de NE FRET-sonde NEmo-1 tot 354 nanometer en de emissiegolflengte op 400 nanometer voor donor en 490 nanometer voor acceptor. Voor de CG FRET-sonde stelt sSam de excitatiegolflengte in op 405 nanometer en de emissie op 485 nanometer voor donor en 580 nanometer voor acceptor. Voeg 40 microliters monsters, standaarden of losse flodders toe aan de putten van een zwarte 96 well half area plate en voeg de mastermix toe.
Start de plaatlezer en noteer de toename van de donor-acceptatieverhouding na elke 60 tot 90 seconden gedurende ten minste 20 minuten, of totdat de toename van het signaal een plateau bereikt. Exporteer de gegevens en bereken de donor-acceptorverhouding door de donor-RFU te delen door de acceptor-RFU voor elk tijdspunt en monster. Bereken vervolgens het gemiddelde gemiddelde en de standaardafwijking van de donor-acceptorratio.
Bepaal de helling binnen de lineaire groei van de verandering tussen de donor en de acceptorverhouding. Resuspendeer voor elke meting 30.000 sputumcellen in een volume van 50 microliter PBS in een buis van 1,5 milliliter. Incubeer de sputumcellen met een specifieke remmer als negatieve controle en een geschikt enzym als positieve controle gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Voeg 50 microliter PBS met FRET reporter en een nucleaire vlek toe aan elke buis om een uiteindelijke concentratie van 2 micromolar te krijgen. Incubeer het mengsel gedurende 10 tot 20 minuten op kamertemperatuur. Blus de reactie door 100 microliters ijskoud PBS toe te voegen en plaats de monsters op ijs.
Cytospin het mengsel op microscopie dia's. Droog vervolgens aan de lucht en fixeer de cellen met ijskoude 10% methanol gedurende 10 minuten. Na fixatie aan de lucht drogen en het monster monteren met een geschikt montagemedium.
Leg de beelden vast met een confocale microscoop. Afbeelding ten minste 100 cellen per voorwaarde voor sluitende statistieken. Resuspend 1 miljoen cellen in 100 microliter PBS in een vijf milliliter FACS polystyreen ronde bodembuis, en plaats de buis op ijs.
Voeg twee microliters FC-blok toe aan elk monster. Incubeer de monsters vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg antilichaam toe elke buis en incubeer op ijs in het donker gedurende 30 minuten.
Was de cellen met twee milliliter koude PBS en centrifugeer op 300 keer G en vier graden Celsius. Ten slotte, resuspend in 200 microliters PBS. Verdeel de suspensie in twee buizen, elk 100 microliter en voeg vijf microliters cel levensvatbaarheidsvlek toe.
Voeg de juiste specifieke NSP-remmer toe aan de negatieve controlebuis en incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg PBS toe aan het monster en filtreer het door een 40 micron filter in een schone FACS-buis. Voeg de verslaggever toe aan het negatieve controlemonster en draai voorzichtig.
Begin met het verkrijgen van cellen geïncubeerd met deze specifieke remmer en pas indien nodig de poorten en de PMT-spanningen van de verslaggever enigszins aan. Om veranderingen in de donor vast te leggen om een verhouding te accepteren als gevolg van membraangebonden proteaseactiviteit, registreert u elke vijf tot tien minuten 100 neutrofielen uit elke buis. Bereken de FRET-verhouding door de donor te delen door de acceptorkanaalwaarden voor de monsters gemeten op de gated viable single neutrophils.
Beelden van neutrofielen die zijn geïncubeerd met 100 micromolar Sivilestat of onbehandeld zijn gebleven voordat verslaggever NEmo-2 wordt aangetrokken, worden hier getoond. Kernsignaal werd gebruikt om neutrofielen te identificeren aan de hand van hun kenmerken gesegmenteerde kernen en de ROI werd handmatig geselecteerd. De donor om een verhouding van sputum neutrofielen te accepteren werd uitgezet.
Elke stip vertegenwoordigt het gemiddelde van één ROI. Flow cytometrie gating maakt het mogelijk om sputum neutrofielen te discrimineren en te bestuderen. De MFI-verdeling op nul en 10 minuten werd waargenomen na toevoeging van verslaggevers.
De gemiddelde donor- en acceptor MFI-waarden voor 1000 sputum neutrofielen werden berekend. De D/A-verhouding bereikte een plateau na een eerste stijging. De gezonde donoren sputum inductie vergt enige oefening voor perfectie.
Vergeet niet om te ontspannen en de aerosol 10 tot 15 minuten voor de opschatting in te ademen. Bovendien houdt u sputumcellen altijd op ijs en verwerkt u ze zo snel mogelijk na de slijmopweving. We ontdekten dat oppervlaktegebonden proteaseactiviteit correleert met vroege longschade bij kinderen en met de ernst van longaandoeningen bij volwassen CF-patiënten.
Daarom maken deze methoden samen het mogelijk om proteasen te onderzoeken als vroege ontstekingsbiomarkers bij neutrofiele luchtwegaandoeningen.
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het visualiseren en kwantificeren van neutrofiele proteaseactiviteit in menselijk sputum. De beschreven methoden zijn toepasbaar voor het evalueren van ontstekingsremmende behandelingen en het uitvoeren van biomarker-validatie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Klinisch Onderzoek
Achtergrond
- Neutrofielproteasen spelen een belangrijke rol bij luchtwegaandoeningen.
- Inzicht in hun activiteit kan helpen bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- Huidige methoden maken een gedetailleerde analyse van de proteasefunctie in klinische monsters mogelijk.
- Technieken zoals FRET en flowcytometrie verhogen de gevoeligheid van de metingen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het kwantificeren van protease-activiteit in sputum.
- Om onderzoek naar de pathofysiologie van neutrofiele luchtwegziekten te faciliteren.
- Om grootschalige screenings en gepersonaliseerde geneeskundige benaderingen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- FRET-probes voor het meten van elastase- en cathepsine G-activiteit.
- Confocale microscopie voor het visualiseren van enzymactiviteit.
- Flowcytometrie voor analyse en fenotypering op enkelcelniveau.
- Gestandaardiseerde protocollen voor sputuminductie en -verwerking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van proteaseactiviteit in sputummonsters.
- De haalbaarheid van de methoden voor diverse luchtwegaandoeningen is aangetoond.
- Een uitgebreide analyse van de neutrofielenactiviteit is geleverd.
- Belangrijke parameters voor het optimaliseren van de experimentele condities zijn geïdentificeerd.
Conclusies
- De protocollen maken een effectieve studie van neutrofiele proteasen in klinische monsters mogelijk.
- Deze methoden kunnen het onderzoek naar behandelingen van luchtwegaandoeningen bevorderen.
- Verdere validatie van biomarkers en therapeutische targets wordt aangemoedigd.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het kwantificeren van de activiteiten van neutrofiel elastase en cathepsine G in menselijk sputum maakt een mechanische risicoreductie van protease-gestuurde inflammatoire pathways bij cystische fibrose en COPD mogelijk. Deze FRET-gebaseerde methoden bieden voorspellende zekerheid voor targetvalidatie door onderscheid te maken tussen vrije en membraangebonden proteasepools, wat de kwalificatie van biomarkers en het monitoren van therapeutische respons ondersteunt. De gestandaardiseerde workflow faciliteert de crossfunctionele vertaling van discovery naar preklinische evaluatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de activiteit van neutrofiele serineproteasen te kwantificeren in ziekte-relevante sputummatrices.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door het onderscheid tussen vrije en oppervlaktegebonden proteasepools met behulp van FRET-reporters.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Ondersteunt portfoliotriage door proteaseactiviteitsniveaus te correleren met de ernst van de longziekte bij neutrofiele luchtwegziekten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor Assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op high-throughput plate reader screening van protease-remmers.
- Kwantitatieve Output: Genereert metingen van de donor-acceptor-ratio, waardoor een reproduceerbare evaluatie van verbindingen tussen verschillende laboratoria mogelijk is.
- Herbruikbaarheid van Platform: Is aanpasbaar voor bloed-, BAL- en muizenmonsters, wat een schaalbare implementatie in discovery- en diagnostische workflows ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Koppel neutrofiel protease-activiteit aan pathofysiologische mechanismen bij cystische fibrose en COPD, in lijn met translationele biomarkerstrategieën.
- Preklinische continuïteit: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door protease-inhibitie in primaire menselijke neutrofielen uit sputum te kwantificeren.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt de bijdrage van proteasen aan weefselremodellering en immuunregulatie, waardoor onduidelijkheid bij de selectie van targets wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypotheseonderzoek in de vroege ontdekkingsfase tot lead-identificatie en preklinische validatie, ondersteund door het vermogen om protease-activiteit in klinisch relevante matrices te kwantificeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en de verduidelijking van pathways door het meten van neutrofiele elastase- en cathepsine G-activiteiten in sputum van neutrophiele luchtwegziekten.
- Screening: Maakt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid mogelijk via gestandaardiseerde FRET-reporterprotocollen die compatibel zijn met platereaders, confocale microscopie en flowcytometrie-platforms.
- Analytics: Biedt kwantitatieve donor-acceptor ratio read-outs die vergelijking van protease-inhibitie over verschillende condities en tijdspunten mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met preklinische continuïteit door protease-activiteit te correleren met de ernst van longziekten in patiëntenmonsters van cystische fibrose en COPD.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor de kwantificering van protease-activiteit over diverse monstertypes, ziekten en therapeutische modaliteiten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij doelwitvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in de pathofysiologie van neutrofiele proteasen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over plaatlezer-, microscopie- en flowcytometrie-metingen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij programma's voor inflammatoire ziekten.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van proteaseactiviteitsbiomarkers bij cystische fibrose en COPD.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in proteasebiochemie, FRET-assayontwerp en protocollen voor sputumverwerking.
- Vereist een platenlezer, confocale microscoop en flowcytometrie-instrumentatie met passende filtersets voor NEmo-1- en sSam-probes.
- Vraagt om cross-team standaardisatie van sputuminductie, verwerking en methoden voor de berekening van de FRET-ratio.
- Vereist aanpassingen voor variërende monstertypen zoals bloed, BAL en muismodellen, terwijl de stabiliteit van de proteaseactiviteit behouden blijft.
- Praktische beperkingen omvatten de tijdsgevoeligheid van de monsterverwerking en de noodzaak van onmiddellijke verwerking na het uitspugen om de levensvatbaarheid van neutrofielen en de proteaseactiviteit te behouden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:07
Cell Isolation and Supernatant Separation
2:36
Quantification of Soluble Neutrophil Serine Protease (NSP) Activity via Fluorimeter or Plate Reader Assay
4:13
Membrane-bound NSPs Activity Measurement via Fluorescence Microscopy
5:30
Membrane-bound NSPs Activity Measurement via Flow Cytometry
7:25
Results: Representative Images and Quantification of Membrane-Bound NE Activity on Neutrophils Isolated from CF Patient Sputum
8:26
Conclusion
