TGF-β-gemedieerde Endotheel naar Mesenchymal Transition (EndMT) en de functionele beoordeling van EndMT-effectoren met crispr/cas9 genbewerking

Endotheel naar mesenchymale overgang is een cellulair proces waarbij endotheelcellen hun kasseienmorfologie veranderen in een fibroblast-achtig fenotype. En de cytokine TGF-beta, die groeifactor bèta transformeert, is een belangrijke drijfveer voor deze overgang. Analyse van de veranderingen in de celmorfologie en de expressieniveaus van endotheel- en mesenchymale markers stelt ons in staat om het optreden van endotheel- naar mesenchymale overgang te beoordelen.

Opkomende gegevens koppelen het endotheel aan het mesenchymale overgangsproces aan verschillende ziekten, waaronder kanker, hart- en vaatziekten en fibrose. En de gegevens suggereren dat de interventie van therapeutisch voordeel kan zijn. Door het endotheliale naar mesenchymale overgangsproces te stimuleren, dat optreedt tijdens embryogenese en orgaanontwikkeling, kunnen we mogelijk mesenchymale weefsels zoals kraakbeen, bot en spieren regenereren.

Om het intracellulaire eiwit te detecteren door immunoflourescence-kleuring, is celpermeabilisatie met 0,1% Triton X-100 nodig om de antilichamen door de celmembranen te laten gaan. Met deze videodemonstratie krijgen onderzoekers een goed inzicht in hoe ze de rol van cytokinen zoals TGF-bèta in endotheel- tot mesenchymale overgang kunnen onderzoeken. Ten eerste, zaad 1 x 10^5 spiegelende pancreas eilandje endotheel MS1 cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 100 eenheden per milliliter penicilline en streptomycine op een 0,1% gelatine-gecoate kweekplaat.

Was na een nachtelijke incubatie in de celkweek-incubator de cellen met PBS voordat u ze behandelt met twee milliliter trypsine van 0,25%, 0,02% EDTA-oplossing gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn begonnen los te maken, dooft u de reactie met vijf milliliter volledig kweekmedium en brengt u de resulterende celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter voor centrifugeren. Resuspend de pellet in vier milliliter vers compleet medium om te tellen.

En zaai 1 X 10^3 cellen per kubieke centimeter in een nieuwe celkweekcontainer. Behandel na de nachtkweek twee putten met vijf micromolar TGF-bètareceptorkinaseremmer SB-431542 en twee putten met DMSO-oplosmiddelcontrole. En plaats de cellen in celkweek incubator gedurende 30 minuten.

Behandel aan het einde van de incubatie twee putten met voertuigcontrole en twee putten met TGF-beta 2. Gebruik na drie dagen een omgekeerde microscoop om de celmorfologie van elke celbehandelingsgroep onder brightfield-beeldvorming te onderzoeken. Om endMT-gerelateerde markerveranderingen door immunofluorescente kleuring te beoordelen, koppelt u de cellen los van een geschikte MS1-celkweek, zoals aangetoond.

En zaai de cellen op een 1,9 X 10^3 cellen concentratie op 0,1%gelatine-gecoate 12 millimeter ronde afdekglazen geplaatst in individuele putten van een 24-put plaat. Behandel de cellen na een nachtkweek gedurende drie dagen met één nanogram milliliter TGF-beta 2. Was aan het einde van de incubatie de cellen met PBS en bevestig de behandelde culturen met 300 microliter 4% formaldehyde per put gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Was de cellen aan het einde van de fixatie drie keer met PBS voordat u de cellen permeabiliseert met 300 microliters van 0,1%Triton X-100 en PBS per put gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen aan het einde van de incubatie drie keer in PBS en blokkeer de cellen met 3%BSA in PBS. Label de cellen na 45 minuten bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur met primaire PECAM-1- en SM22-alfaantistoffen, gevolgd door drie wasbeurten in PBS.

Na de laatste wasbeurt de cellen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur incuberen met de juiste secundaire antilichamen en de cellen driemaal wassen met PBS voordat u de cellen monteert met een DAPI-aangevuld montagemedium en een afdekstrook. Sluit vervolgens de randen van de afdekstrip af met duidelijke nagellak en beeld de celmarkerexpressie af met fluorescentie confocale microscopie met behulp van de juiste filters volgens standaard beeldvormingsprotocollen. Na drie dagen behandeling met TGF-beta 2 verliezen endotheel MS1-cellen hun kasseienachtige structuur en differentiëren ze zich in spindelvormige mesenchymale cellen.

Deze TGF-bèta 2 geïnduceerde differentiatie wordt onderdrukt wanneer de cellen worden blootgesteld aan de TGF-bètareceptorkinaseremmer SB-431542. De expressie van endotheeleiwit PECAM-1 is robuust verminderd na TGF-beta 2-stimulatie, terwijl de mesenchymale factor SM-22 alpha grondig wordt geherreguleerd. Bovendien wordt Snail duidelijk geherreguleerd door blootstelling aan TGF-beta 2, terwijl slugexpressie niet wordt beïnvloed.

Zoals waargenomen CRISPR-Cas9 genbewerking kan worden gebruikt om de introductie van twee onafhankelijke Snail single guide RNAs in Cas9-expressing MS1-cellen te vergemakkelijken om de slakkenexpressie te verstoren. De knock-out van Snail is voldoende om de fibroblast-achtige celmorfologie aangedreven door TGF-beta 2 in MS1-cellen te remmen en om de TGF-beta 2 gemedieerde PECAM-1-afname en SM-22 alfaverbetering te blokkeren. De beoordeling van veranderingen in de celmorfologie en de expressie van endotheel- en mesenchymale markers door immunofluorescentie kan verder worden gevalideerd door de expressie van deze markers op kwantitatieve PCR in westerse vlekanalyse te meten.

Deze techniek voor het detecteren van endotheel voor mesenchymale overgang heeft de onderzoekers in staat gesteld om deze opkomende betekenis te onderzoeken als een fysiologisch proces dat optreedt bij meerdere ziekten.