Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source
February 26th, 2021
We presenteren een uitgebreide gids voor de voorbereiding van vaste doelmonsters, gegevensverzameling en gegevensverwerking voor seriële synchrotronkristallografie op Diamond beamline I24.
Seriële synchrotronkristallografie, of SSX, is een relatief nieuw en zich snel ontwikkelend gebied van MX.Het is zeer geschikt voor experimenten met lage doses en kamertemperatuur, maar misschien wel het belangrijkste, het is echt goed geschikt om dynamiek te volgen. Hierdoor kunnen stop-motionfilms van eiwitten in actie worden gemaakt. Bij I24 zijn meerdere modi van SSX beschikbaar.
Dit protocol richt zich op SSX met een vast doel, waarmee een breed scala aan seriële experimenten met beperkte hoeveelheden monsters mogelijk is. De siliciumchips kunnen beschadigd raken bij het laden en schoonmaken, als je er niet bekend mee bent. Ook is het chipuitlijningsprotocol volledig nieuw voor veel kristallografen en is de gegevensverwerking iets anders dan uw standaard rotatiegegevens.
Om een spaanhouder voor te bereiden, snijdt u twee vellen polyesterfolie in vierkanten van ongeveer 6 bij 6 centimeter en plaatst u de vellen over de twee basisplaten. Gebruik metalen afdichtingsringen, bevestig de vellen op hun plaats en trek vervolgens voorzichtig aan de overtollige folie om eventuele vouwen te verwijderen. Selecteer vervolgens een siliciumchip met openingen van de juiste grootte ten opzichte van de grootte van de te analyseren kristallen.
Gloei de chip gedurende 25 seconden op 0,39 millibar, met een stroom van 15 milliampere. Gebruik een pincet om de siliciumchip op de chiplaadtrap te plaatsen, met de verhoogde staven naar beneden gericht. Breng vervolgens met een pipet 200 microliter van de microkristalbrij aan op de platte kant van de chip en verspreid de slurry om alle stadsblokken van de chip te bedekken.
Als de chip beschadigd is, bedek eventuele gaten dan met een klein stukje polyesterfolie, om ervoor te zorgen dat een gelijkmatig vacuüm kan worden aangebracht. Breng vervolgens een zacht vacuüm aan om alle overtollige vloeistof door de chip te lokken. Verwijder de chip uit de chiplaadfase en dep voorzichtig de onderkant van de chip met filtreerpapier om overtollige vloeistof te verwijderen.
Plaats de geladen chip op de grotere helft van de chiphouder tussen de geleidingsmarkeringen, plat naar beneden. Plaats de kleine helft van de chiphouder op de chip om deze af te sluiten. De twee helften van de chiphouder moeten op hun plaats klikken.
Bevestig vervolgens met behulp van zeskantbouten de chip stevig op zijn plaats. Om de chip uit te lijnen, houdt u de chiphouder in een hoek van 30 graden terwijl u de houder nadert. Gebruik vervolgens de kinematische bevestigingen om de geladen chip op het XYZ-podium bij de bundellijn te plaatsen.
Wanneer de magneten contact maken, laat u de chiphouder parallel aan de stroom draaien en klikt u op zijn plaats. Zodra de chip is geplaatst, gebruikt u het beamline on-axis weergavesysteem en de grafische gebruikersinterface voor chipuitlijning om de fiduciale bovenlinks van de chip te lokaliseren. Als u fiduciair 0 wilt centreren in X, Y en Z, beweegt u in en uit focus om Z uit te lijnen, omhoog en omlaag om Y uit te lijnen, en links en rechts om X uit te lijnen.Klik vervolgens op Fiduciaal 0 instellen"Nadat u fiducial 1 en 2 op dezelfde manier hebt uitgelijnd met de röntgenstraal, klikt u op Coördinatensysteem maken" om een coördinatenmatrix te genereren.
Klik vervolgens op Block Check"om de XYZ-fase naar de eerste put van elk stadsblok te verplaatsen. Als het röntgenkruishaar op één lijn staat met de openingen, wordt de chip uitgelijnd. In deze grafische weergave van spot finding resultaten van DIALS kan een actualisering hit-rate plot worden waargenomen.
Als op een hit wordt geklikt, wordt de bijbehorende diffractieafbeelding weergegeven in de DIALS-beeldviewer. In deze tabel kunnen de huidige indexerings- en integratiepercentages worden gevisualiseerd die in realtime worden bijgewerkt naarmate de gegevens tijdens het bezoek worden verzameld. Visualisatie van de eenheidscelparameters kan polymorfen onthullen.
Tweedimensionale plots van nuttige parameters kunnen ook worden geproduceerd om variaties te onthullen die optreden als gevolg van belastings- of uitdrogingseffecten. Stereografische projecties kunnen de aan- of afwezigheid van voorkeursoriëntaties onthullen die kunnen worden teruggevoerd naar het belastingsprotocol. In deze projectie kunnen bijvoorbeeld de effecten van het overbelasten van een chip met lysozymkristallen worden waargenomen.
Pipetteer bij het laden van de chip langzaam en gebruik uw vinger om de pipet boven de chip te laten rusten. Dit voorkomt dat je de chip aanraakt en per ongeluk gaten in het silicium prikt. Maak bij het verwerken van gegevens gebruik van de beschikbare geautomatiseerde pijpleidingen.
Dit geeft u een goed idee van hoe uw experiment vordert en of u iets moet variëren. Deze methode kan worden toegepast op elk eiwitsysteem dat in aanzienlijke hoeveelheden kan worden gekristalliseerd. En de reactie kan worden veroorzaakt door lichte röntgenstralen of snelle menging.
Dynamische studies op een reeks structuren kunnen inzicht geven in hoe eiwitten functioneren.
Overzicht
Dit artikel biedt een uitgebreide gids voor de voorbereiding van vaste doelmonsters, gegevensverzameling en gegevensverwerking voor seriële synchrotron-kristallografie op Diamond beamline I24. Het benadrukt de methodologie voor het uitvoeren van experimenten met beperkte monsterhoeveelheden terwijl de chipintegriteit wordt gegarandeerd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structurele biologie
- Kristallografie
- Eiwitdynamica
Achtergrond
- Seriële synchrotron-kristallografie (SSX) is een ontwikkelend gebied in macromoleculaire kristallografie.
- Het is geschikt voor laagdosis en kamertemperatuurexperimenten.
- SSX maakt dynamische studies van eiwitten mogelijk, waardoor hun werking kan worden gevisualiseerd.
- Fixed-target SSX kan effectief gebruik maken van beperkte monsterhoeveelheden.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor fixed-target SSX op Diamond beamline I24.
- Om een correcte chipvoorbereiding en -uitlijning voor optimale gegevensverzameling te garanderen.
- Om de verschillen in gegevensverwerking in vergelijking met standaard rotatiegegevens te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van siliciumchips met behulp van polyesterfolie en afdichtingstechnieken.
- Toepassing van microkristallenslurry op de chips en vacuümaspiratie.
- Chipuitlijning met behulp van een grafische gebruikersinterface op de beamline.
- Real-time gegevensvisualisatie en -verwerking met behulp van geautomatiseerde pipelines.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle uitlijning van chips leidt tot nauwkeurige gegevensverzameling.
- Real-time monitoring van indexerings- en integratiesnelheden tijdens experimenten.
- Visualisatie van eenheidscelparameters onthult polymorfen en laadeffecten.
- Dynamische studies bieden inzichten in eiwitfunctionaliteit.
Conclusies
- Het protocol verbetert de efficiëntie van fixed-target SSX-experimenten.
- Juiste chipbehandeling en -uitlijning zijn cruciaal voor succesvolle gegevensverzameling.
- Dynamische studies met behulp van SSX kunnen ons begrip van eiwitgedrag aanzienlijk bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
