Name: Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Leer vaste-doel seriële synchrotronkristallografie voor structurele biologie met siliciumchips. Deze methode optimaliseert dataverzameling bij Diamond Light Source I24 voor eiwitdynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de iNEXT-Discovery (Grant 871037) gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie.

1. Een chip voorbereiden en laden
OPMERKING: Het proces vindt plaats in een vochtigheidsgecontroleerde omgeving(figuur 1),meestal tussen 80% en 90% of hogere relatieve vochtigheid, om te voorkomen dat eiwitkristallen uitdrogen. Eenmaal geladen en verzegeld, kunnen kristallen meer dan 24 uur overleven. Dit kan echter sterk variëren tussen kristalsystemen. In de kamer is een vacuümpomp met laag vermogen bevestigd aan een laadtrap om een siliciumchip te houden (figuur 1), een siliciumchip, een chiphouder met polyesterfolie (figuur 2), een p200-pipet, 200 μL pipetpunten, pincet, filterpapier en de eiwitkristalbrij zijn vereist.
<ol><li>Bereid een chiphouder voor.<ol>
<li>Knip twee vellen polyesterfolie in vierkanten van ongeveer 6 cm x 6 cm.</li>
		<li>Leg de polyester platen over de twee bodemplaten (groot en klein).</li>
		<li>Bevestig de polyester platen op hun plaats met behulp van de metalen afdichtingsringen.</li>
		<li>Trek voorzichtig aan de overtollige polyesterfolie om eventuele vouwen te verwijderen om het visualiseren en centreren van monsters later gemakkelijker te maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer een siliciumchip met openingen van de juiste grootte (7-30 μm) ten opzichte van de grootte van de kristallen.</li>
	<li>Gloei de chip gedurende 25 seconden op 0,39 mBar en gebruik een stroom van 15 mA om microkristallen eenvoudig op de chip te verspreiden.</li>
	<li>Plaats de siliciumchip op de chiplaadtrap met een pincet met de verhoogde staven naar beneden gericht.</li>
	<li>Breng 200 μL van de microkristal slurry aan op de platte kant van de chip met behulp van een pipet.</li>
	<li>Spreid de kristallen slurry uit om alle "stadsblokken" van de chip te bedekken.</li>
	<li>Als de chip beschadigd is, bedek dan eventuele gaten met een klein stukje polyesterfolie of filterpipetpunt om ervoor te zorgen dat een gelijkmatig vacuüm kan worden aangebracht.</li>
	<li>Breng een zacht vacuüm aan totdat alle overtollige vloeistof door de chip is gezogen.</li>
	<li>Verwijder de chip uit de chiplaadfase met een pincet.</li>
	<li>Dep de onderkant van de chip voorzichtig met filterpapier om overtollige vloeistof te verwijderen.</li>
	<li>Plaats de geladen chip op de grotere helft van de chiphouder tussen de geleidingsmarkeringen plat naar beneden.</li>
	<li>Sluit de chip af door de kleine helft van de chiphouder erop te plaatsen.<ol>
<li>De twee helften van de chiphouder klikken op hun plaats. Als de tweede helft niet vlak zit, draai dan 180° aan de houder om de magneten goed uit te lijnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schroef de spaanhouder dicht met zeskantbouten om de chip stevig op zijn plaats te bevestigen. OPMERKING: Als alternatief kan een "chiploze" chip op een vergelijkbare manier worden geladen, met een kleiner volume kristalbrij (~ 15 μL) ingeklemd tussen de twee lagen polyesterfolie in de chiphouder 37, of een kleiner volume kan worden geladen met behulp van een 50 μm dikke dubbelzijdige kleefafstandhouder die rechtstreeks op de polyesterfolie wordt aangebracht zoals eerder beschreven 38 . Het gebruik van lijmafstandhouders maakt het ook mogelijk om meerdere monsters (of varianten van monsters zoals ligand soaks) op elke chiploze chip te laden. Een complementaire belastingsbenadering die gebruikmaakt van akoestische druppeluitwerping (ADE) om siliciumchips te laden, kan ook worden gebruikt bij Diamond39. Met ADE kunnen chips worden geladen met kleinere volumes kristal slurry dan pipetlading. Het is een bijzonder nuttige techniek wanneer monsters schaars zijn, hoewel rekening moet worden gehouden met de chemische samenstelling en viscositeit van de drijfmest.</li>
</ol>2. GUI en setup bij de beamline
<ol><li>Voer alle chipuitlijning en -installatie voor gegevensverzameling uit via een eenvoudige EPICS Display Manager (edm) grafische gebruikersinterface (GUI)(Afbeelding 3a). Dit biedt een point-and-click-interface voor beamline-instrumentatie en biedt invoerparameters voor op Python gebaseerde gegevensverzameling. Subvensters bieden extra controle voor het verzamelen uit subregio's van een monsterhouder(figuur 3b)of laser/LED-pompsonde-experimenten(figuur 3c).</li>
</ol>3. De chip uitlijnen
<ol><li>Plaats de geladen chip op het XYZ-podium bij de beamline (weergegeven in figuur 4a)met behulp van de kinematische bevestigingen.<ol>
<li>Zorg ervoor dat u de stadia niet langs hun rijrichting trekt. De magneten in de kinematische steunen zijn vrij sterk, dus dit kan vrij gemakkelijk per ongeluk worden gedaan.</li>
		<li>Bij het naderen van de houder moet de spaanhouder onder een lichte hoek (±30°) worden gehouden. Wanneer de magneten contact maken, kan de chiphouder evenwijdig aan de vloer draaien (0°) en klikt de chiphouder op zijn plaats(figuur 4b).</li>
		<li>Volg bij het lossen van een chip een omgekeerd pad. Draai en hoek de chip weg van de trappen voordat u de chiphouder wegtrekt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik het on-axis weergavesysteem van de beamline en de GUI voor chipuitlijning om de fiduciale boven in de linkerbovenhoek van de chip te lokaliseren. Fiducialen zijn drie vierkanten, twee kleine en een grote, haaks op elkaar (figuur 5a). De chip is verlicht, zodat de chip er donker uitziet met openingen als witte vierkanten.</li>
	<li>Centreer op fiduciale nul in X, Y en Z (figuur 5b). Lijn X en Y uit door respectievelijk naar links/rechts en omhoog/omlaag te bewegen. Lijn Z uit door de chip in en uit focus te bewegen.</li>
	<li>Klik op Fiducial Zero instellen .</li>
	<li>Herhaal stap 3.2 voor fiduciair (rechtsboven, figuur 5c) en fiduciale twee (linksonder, figuur 5d) om alle fiducialen uit te lijnen met de röntgenstraal.</li>
	<li>Genereer een coördinatenmatrix door op make coördinaatsysteemte drukken , dit berekent de offset, pitch, roll en yaw van de chip ten opzichte van de fasen waardoor alle volgende bewegingen in het chipcoördinaatframe kunnen worden uitgevoerd.</li>
	<li>Klik op Blokcontrole om de XYZ-fase naar de eerste put van elk stadsblok te verplaatsen voor visuele bevestiging dat de chip goed is uitgelijnd.</li>
	<li>Als het röntgenkruishaar in lijn staat met de openingen, wordt de chip uitgelijnd. Zo niet, herhaal dan stap 3.2-3.3. OPMERKINGEN: In geval van problemen met uitlijnen (gebroken fiducials), kunnen verschillende openingen op de chip worden gebruikt voor uitlijning met behulp van het uitlijningsmenu "uitlijningstype". Er zijn veel verschillende soorten chips beschikbaar voor het verzamelen van vaste doelgegevens. Verschillende chiptypes worden ondergebracht door gebruik te maken van het 'chiptype' pull-down menu. De meest gebruikte chiptypes bij I24 zijn 'Oxford' en 'custom' chips. Het aantal en de afstand van openingen en fiducials op de chip worden gelezen uit een chipwoordenboek dat is gedefinieerd via het vervolgkeuzemenu. Aangepaste chip maakt het mogelijk om de diafragmaafstand on-the-fly te definiëren, wat vooral handig is voor dunne-film sheet-on-sheet of andere 'chipless' type chips waarbij kristallen zich willekeurig over de houder bevinden37. Een nieuwe Python GUI, met move-on-click-functionaliteit en geautomatiseerde chipuitlijning, is momenteel in ontwikkeling, maar is nog niet klaar voor routinematig gebruik op het moment van het schrijven van dit manuscript.</li>
</ol>4. Gegevensverzameling instellen
OPMERKING: Het instellen van gegevensverzameling is afhankelijk van het systeem dat wordt bestudeerd en het experiment dat moet worden uitgevoerd. Dit kan variëren van het eenvoudigste SSX-experiment, het verzamelen van een lage dosisstructuur, tot een tijdsoplost experiment met behulp van lasers of snelle menging om een reactie te initiëren die meerdere volledige datasets vereist op verschillende tijdvertragingen. Om een gegevensverzameling in te stellen, moeten de volgende parameters worden gedefinieerd.
<ol><li>Experimentele variabelen: Vul de map, bestandsnaam, belichtingstijd, transmissie, detectorafstand en het aantal opnamen per diafragma in, indien van toepassing.</li>
	<li>Chiptype: Zoals hierboven beschreven, stemt u het chiptype af op de gebruikte chip.<ol>
<li>Als een dunne film of 'chiploze' chip wordt gebruikt, stelt u het chiptype in op Geen.</li>
		<li>Definieer het aantal stappen en de stapgrootte in zowel x als y in de GUI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stel het kaarttype in: hiermee kunnen subsecties van een chip worden geselecteerd voor gegevensverzameling(figuur 3b). 'Geen' betekent dat gegevens worden verzameld van elk diafragma op een chip. 'Lite' betekent dat gegevens worden verzameld van geselecteerde stadsblokken op de chip(figuur 3b). Dit kan handig zijn als bijvoorbeeld bekend is dat een gebied van een chip slecht geladen of leeg is. Met 'Vol' kunnen afzonderlijke diafragma's worden geselecteerd voor gegevensverzameling. In dit geval moet een correct opgemaakt tekstbestand worden verstrekt. Details en een sjabloon kunnen worden verkregen bij beamline-medewerkers.</li>
	<li>Pompsonde: Selecteer het type pompsonde-experiment en de gewenste tijdsvertraging. Het activeren van de pomp (meestal een LED of laser) is vaak specifiek voor een bepaald experiment, dus zal hier niet in detail worden beschreven.<ol>
<li>'Korte' vertragingen verwijzen naar experimenten waarbij er een woning is bij elke opening tussen de pomp en de sonde (d.w.z. pomp, sonde, 'ga naar het volgende monster.) Vertragingen zijn meestal in de orde van 1 seconde of tientallen milliseconden.</li>
		<li>Lange vertragingen verwijzen naar een excite and visit again (EAVA) -strategie, waarbij openingen twee keer worden bezocht, met een gedefinieerde tijdsvertraging tussen bezoeken (d.w.z. pompen, verplaatsen, pompen, bewegen, sonde, verplaatsen, sonde, enz.). De tijdvertraging wordt berekend en röntgenblootstellingstijden(figuur 3c)en is meestal ~ 1 seconde of meer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gemeenschappelijke methoden voor het verzamelen van gegevens
OPMERKING: Hieronder volgen de belangrijkste parameters die bepalen welk type experiment wordt uitgevoerd. In dit gedeelte wordt ervan uitgegaan dat de andere instellingen van protocol 3 "Gegevensverzameling instellen" zijn gedefinieerd.
<ol><li>
Scenario 1: Gegevensverzameling met lage doses. Verzameling van een enkele diffractieafbeelding van elk geselecteerd diafragma op de monsterhouder.<ol>
<li>Stel het aantal opnames per diafragma in op 1.</li>
		<li>Stel pompsonde in op Geen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scenario 2: Een dosisreeks, waarbij n beelden sequentieel worden verzameld van elk geselecteerd diafragma op de monsterhouder. De chip staat stationair bij elk diafragma terwijl elke set n beelden wordt verzameld.<ol>
<li>Stel het aantal opnames per diafragma in op'n'. Merk op dat de verwerking wordt vereenvoudigd als n= 5, 10, 20 of een ander veelvoud van 10. Het is moeilijk om trends vast te stellen als n < 5. Het is handig om rekening te houden met de totale tijd die nodig is om een chip te bedekken en het aantal afbeeldingsbestanden dat wordt geproduceerd wanneer n wordt verhoogd.</li>
		<li>Stel pompsonde in op Geen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scenario 3: Pomp-sonde methoden<ol>
<li>Selecteer een methode in het vervolgkeuzemenu Pompsonde om het controlecentrum voor laserexcitatie te openen.</li>
		<li>Vul voor een pompsonde-experiment de Laser Dwell in bij elke diafragma-optie.</li>
		<li>Vul voor EAVA de Laser Dwell in bij elk diafragma en röntgenbelichting en klik op Berekenen.</li>
		<li>Selecteer de juiste herhaaloptie in het vervolgkeuzemenu van de edm GUI-pompsonde voor de gewenste vertragingstijd.</li>
		<li>Als het experiment een voorverlichtingsstap vereist, vult u de sectie Laser 2 Dwell in.</li>
		<li>Nadat alle experimentele variabelen zijn gedefinieerd, drukt u op Parameters instellen en een korte lijst maken. Dit laadt experimentele variabelen op de geobrick-controller. Nadat dit is gebeurd, drukt u op Start om de detector naar binnen te verplaatsen, de achtergrondverlichting uit te schakelen en de gegevensverzameling te starten. Op alle punten bij het instellen van gegevensverzameling is het handig om een terminalvenster te openen waarin feedback over de status en het resultaat van elk van de stappen wordt afgedrukt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Gegevensverwerking
OPMERKING: In grote lijnen kan gegevensverwerking worden onderverdeeld in drie groepen op basis van de urgentie waarmee feedback vereist is. Snelle feedback is nodig om aan te tonen of kristallen aanwezig zijn en diffracteren, en zo ja, in welke getallen. Dit moet gelijke tred houden met het verzamelen van gegevens. Het uitvoeren van gegevensindexering en -integratie die langzamer kan zijn, maar nog steeds moet worden uitgevoerd op vergelijkbare tijdschalen met gegevensverzameling. Het samenvoegen en schalen van reflectie-intensiteiten tot een mtz-bestand voor structuuroplossing en het genereren van elektronendichtheidskaarten vertegenwoordigt de laatste stap en kan nog langzamer zijn. Hier zullen startpijplijnen op I24 voor alleen de eerste twee fasen worden besproken, omdat ze nodig zijn voor realtime feedback om uw experiment te begeleiden, hoewel merk op dat statistieken zoals hit-rates en schaalstatistieken geen vervanging zijn voor het inspecteren van de elektronendichtheid, wat de enige bevestiging kan zijn dat een ligand is gebonden, of een reactie heeft plaatsgevonden, in kristallo.
<ol><li>Snelle feedback<ol>
<li>Om de gegevensverwerkingsmodules te laden, laadt u de module i24-ssx in de terminal op elk beamline-werkstation.</li>
		<li>Om de hit-finding analyse uit te voeren, typt u i24-ssx /path/to/visit/directory/ naar de terminal: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ OPMERKING: Dit opent drie terminalvensters en, zodra gegevens naar schijf zijn geschreven, een grafische weergave van spot finding resultaten van Diffraction Integration for Advanced Light Sources (DIALS) 40,41(Figuur 6a).<ol>
<li>Standaardinstellingen scoren elke 10e afbeelding en worden om de paar seconden vernieuwd om de rekenbelasting te minimaliseren.</li>
			<li>Wijzig de standaardinstelling door een argument toe te voegen aan het einde van de bovenstaande opdracht. Bijvoorbeeld, 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx zou hit finding uitvoeren op elke andere afbeelding. Dit kan echter het cluster (een gedeelde bron!) onnodig belasten en de verwerkingstijden vertragen. De grafiek is kleurgecodeerd op basis van de kans op succesvolle indexering, rood laat zien dat er minstens 15 Bragg-vlekken zijn gevonden (goede kans op indexering), blauw toont weinig tot geen nuttige diffractie.</li>
			<li>Bekijk diffractiebeelden van belang in de DIALS-beeldviewer door op de spots op de spotzoekerinterface te klikken.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Feedback over indexering en integratie OPMERKING: Indexering en integratie van diffractiegegevens worden uitgevoerd met DIALS met behulp van de dials.still_process functie 40,41. Als zodanig moet specifieke informatie met betrekking tot uw kristal (verwachte kristalruimtegroep, eenheidscel en een experimentgeometrie) in een .phil-tekstbestand worden geplaatst.<ol>
<li>Laad DIALS-modules door module load dials in een terminal te typen.</li>
		<li>Als u wilt beginnen met het verwerken van een gegevensset, typt u dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. De voortgang van alle nog steeds verwerkende datasets kan worden gevolgd door het stills_monitor script uit te voeren door monitor_stills_process.py te typen (na het uitvoeren van modulebelasting i24-ssx en het wijzigen van de map naar het huidige bezoek) (Figuur 6b).</li>
		<li>De eenheidscelverdeling van geïndexeerde diffractiegegevens (Figuur 7a) kan worden bewaakt met behulp van het commando ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true Dit is vooral handig om eenheidscelpolymorfen te identificeren en op te lossen zoals eerder besproken 42.</li>
		<li>'Visualzie' als, en hoe, deze verdeling varieert over een vast doel door het produceren van een 2D-plot (Figuur 7b) met behulp van het commando python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>Produceer stereografische projecties van alle geïndexeerde diffractiegegevens (figuur 7c) met behulp van het DIALS-commando dials.stereographic_projection hkl = 0,0,1 expand_to_P 1 = True /path/to/dials/output/*refined.expt. OPMERKING: Het is een veel voorkomende pathologie bij het verwerken van stilstaande gegevens van kristallen waarbij de symmetrie van het Bravais-rooster hoger is dan de ruimtegroepsymmetrie die gegevens samenvoegde als een perfecte tweeling verschijnen. Gegevensverwerkingsalgoritmen zijn geëvolueerd om deze pathologie op te lossen 43,44,45,46, maar gebruikers moeten hier rekening mee houden bij het verwerken van hun gegevens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Seriële synchrotrongegevensverzameling is een relatief nieuwe techniek bij MX-beamlines, die de kloof overbrugt tussen de ultrasnelle gegevensverzamelingen die momenteel worden uitgevoerd bij XFET's en traditionele synchrotron-gebaseerde MX. Dit manuscript is bedoeld om een overzicht te geven van hoe u met succes vaste doelseriegegevens kunt verzamelen op beamline I24, Diamond Light Source voor lage dosis, dosisreeksen en tijd-opgeloste experimenten. Net als bij standaard kristallografie is monstervoorbereiding een belangrijke flessenhals in structuuroplossing. SSX is niet anders, en de bereiding van een homogene kristalbrij in voldoende hoeveelheden heeft nog niet geprofiteerd van enkele decennia van studie en verfijning zoals de groei van enkele grote eiwitkristallen. De bereiding van deze slurries valt echter buiten het bestek van dit artikel en is elders samengevat36. De kritieke stap in de hier beschreven aanpak omvat het zorgvuldige gebruik van het beschikbare monster met behulp van eenvoudig te gebruiken GUI-interfaces (stap 3) en geautomatiseerde gegevensverwerkingspijplijnen (stap 6) om de chipbelasting te informeren (stap 1) en hoe een experiment moet verlopen.
De snelle feedbackpijplijn is een krachtig hulpmiddel waarmee gebruikers de initiële hit rates tijdens het verzamelen van gegevens kunnen beoordelen om latere protocollen voor het laden van chips te informeren voor een succesvolle gegevensverzameling. Bij een lage hit rate (<5%) lopen gebruikers het risico onvolledige gegevens te verzamelen en/of beamtime te verspillen met extra collecties. In dit geval kan het monster worden samengevoegd, geconcentreerd door zachte centrifugatie, en/of kunnen grotere volumes worden geladen in stap 1.5. Een hogere hit rate is over het algemeen gunstig, maar er is een punt van afnemend rendement waar overbelasting leidt tot meerdere kristallen in dezelfde put. DIALS is in staat om te gaan met multi-roosterdiffractiegegevens50, maar een grotere zorg dan indexering en integratie is het schadelijke effect dat kristalgroepering kan hebben op de gelijkmatige activering van kristallen door laserlicht of snelle menging voor nauwkeurige tijd opgeloste experimenten. Daarom moet bijzondere aandacht worden besteed aan het voorkomen van overbelasting van vaste doelen voor tijdsoplossende experimenten.
De indexerings- en integratieverwerkingsstap produceert een plot waarbij het centrale kruis de bundelrichting vertegenwoordigt, elk punt de richting van de hkl 001-reflectie van individuele roosters vertegenwoordigt en de buitenste ring van de cirkel een rotatie van 90 ° van de bundelas vertegenwoordigt. Dit laat zien of uw kristallen een voorkeursoriëntatie hebben, wat van invloed kan zijn op de volledigheid van de gegevens en de noodzaak aangeeft om meer gegevens te verzamelen of het laadprotocol te variëren. In het linkerpaneel van figuur 7cwordt het effect van het overbelasten van een chip met HEWL-kristallen getoond. Naarmate openingen zich vullen met meer kristallen, kleven ze aan de schuine wanden van de openingen in plaats van in een willekeurige oriëntatie aan de basis te wiggen. De twee orthogonale ellipsen zijn het resultaat van kristallen die op de binnenwanden van de chip liggen en die zich op ~ 35 ° ten opzichte van de straalrichting bevinden. Dit vermindert het volume van de geladen kristallen, vermindert de hit rate en vermindert drastisch de fractie van kristallen die in deze voorkeursvlakken liggen.
Opgemerkt moet worden dat andere seriële benaderingen beschikbaar zijn bij I24, zoals LCP-extruders en microfluïdische chips. Deze gebruiken vergelijkbare GUI's en dezelfde verwerkingspijplijnen, dus veel van het bovenstaande blijft van toepassing, zelfs als een andere techniek wordt gebruikt. Er bestaan een aantal seriële benaderingen voor zowel SSX als SFX buiten de hier beschreven vaste doelbenadering, elk heeft bepaalde voordelen ten opzichte van de andere, afhankelijk van het uit te voeren experiment en de beamline die voor het experiment wordt gebruikt. Aangezien seriële benaderingen snel evolueren, is het raadzaam om de beamline-webpagina's (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) te controleren op recente updates en in een zo vroeg mogelijk stadium met beamline-medewerkers te praten bij het plannen van beamtime. Toegang tot I24 voor standaard- en seriële experimenten is gratis op het punt van gebruik. Voor gebruikers in het VK en de EU worden reis- en verblijfskosten gedeeltelijk gedekt door iNEXT Discovery.

Seriële synchrotronkristallografie (SSX) is een opkomende methode van gegevensverzameling die is geïnspireerd door röntgenvrije elektronenlasers (XFEL)1,2,3. Bij een XFEL wordt een enkel diffractiepatroon geregistreerd van een meestal zeer klein eiwitkristal, voordat het kristal wordt vernietigd door de extreem heldere röntgenpuls. Dit betekent meestal dat een nieuw kristal in de röntgenstraal moet worden ingebracht om een ander diffractiepatroon te verkrijgen4. Deze behoefte om kristallen voortdurend aan te vullen heeft geleid tot de ontwikkeling van vele seriële monsterafgiftetechnieken5.
Bij synchrotrons worden klassieke (niet-seriële) rotatiekristallografiemethoden op grote schaal toegepast, waarbij gebruik wordt gemaakt van een enkel groot kristal dat wordt gedraaid in een röntgenstraal met behulp van een goniometer om een complete dataset te verzamelen voor structuuroplossing6. Om de levensduur van kristallen te verlengen, zodat een volledige dataset7, 8kan worden verzameld en ook om verzending en geautomatiseerde monsteroverdracht tevergemakkelijken,worden kristallen gecryokoeld tot ~ 100 K voor gegevensverzameling. Bij intense microfocusbundellijnen worden vaak multikristalstrategieën gebruikt, omdat stralingsschade het verzamelen van een volledige dataset van een enkel kristal9,10,11kan verbieden. Ondanks de limieten die worden opgelegd door stralingsschade, blijft het aantal gebruikte kristallen relatief bescheiden en is de gebruikte aanpak in wezen identiek aan het experiment met één kristal.
SSX, aan de andere kant, gebruikt seriële monsterafgifte om enkele stilstaande diffractiepatronen te verkrijgen van duizenden willekeurig georiënteerde kristallen om een complete dataset te genereren. Opgemerkt wordt dat seriële technieken met kristalrotatie in ontwikkeling zijn12,13 hoewelwe ons richten op stilstaande, nulrotatie, benaderingen. Er is een grote verscheidenheid aan monsterafgiftesystemen met verschillende voor- ennadelen 14, variërend van het leveren van een stroom kristallen in een stroomgerichte / viskeuze jet15,16,17,microfluïdische chip18,19of kristallen op een vast doel zoals een geëtste siliciumchip20,21 . Doorgaans worden kristallen bij kamertemperatuur gehouden, waardoor een grotere conformatiediversiteit kan worden waargenomen en een meer fysiologisch relevante omgeving wordt geboden22. SSX maakt het verzamelen van datasets met een zeer lage dosismogelijk 23, omdat de totale dosis van de dataset gelijk is aan een enkele korte röntgenblootstelling van één kristal. Een ander groot voordeel dat SSX biedt, is de studie van eiwitdynamica door middel van tijd-opgeloste methoden, met reacties veroorzaakt door blootstelling aan laserlicht24,25,26,27of door het mengen van kristallen en ligand / substraat28,29. Het gebruik van kleinere kristallen betekent dat laserlicht het hele kristal kan binnendringen, waardoor de reactie uniform wordt geïnitieerd zonder multifotonenabsorptie om goed gedefinieerde reactietussenproducten te bieden voor diffractiegegevens die op verschillende tijdstippen zijn genomen27. Het gebruik van grotere kristallen en op rotatie gebaseerde methoden voor gegevensverzameling lijdt aan een beperkte laserpenetratiediepte, niet-uniforme of multifotonenactivering, stralingsschade en mechanische overheadtijd binnen gegevensvegen, wat resulteert in een mix van reactietussenproducten die moeilijk of onmogelijk te interpreteren kunnen zijn bij hogere reactiesnelheden. Kleinere kristallen bieden een vergelijkbaar voordeel bij mengexperimenten, omdat liganden snel en gelijkmatiger door het kristal kunnen diffunderen, waardoor gedefinieerde reactietussenproducten opnieuw kunnen worden geregistreerd op verschillende tijdvertragingen30,31,32.
Bij Diamond's microfocus beamline I24 kunnen zowel conventionele rotatie- als SSX-experimenten worden uitgevoerd. Hier wordt een uitgebreid protocol voor SSX-monstervoorbereiding en gegevensverzameling gepresenteerd met behulp van vaste doelen op I24 en protocollen voor gegevensanalyse van seriële gegevens bij Diamond. Hoewel het manuscript en de bijbehorende video's gebruikers in staat moeten stellen een succesvol SSX-experiment uit te voeren op I24, moet worden opgemerkt dat dit een snel ontwikkelend veld is en dat de benaderingen voortdurend evolueren. Er moet ook worden opgemerkt dat seriële methoden beschikbaar zijn bij andere synchrotronbronnen, waaronder maar niet beperkt tot Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI en PXII)34en NSLS (FMX)35. Hoewel de specifieke kenmerken van seriële gegevensverzameling en -verwerking tussen bronnen zullen verschillen, blijven de kernprincipes hetzelfde. De onderstaande protocollen moeten worden gezien als een startpunt en een pad naar het basiskamp in plaats van de top van wat er zou kunnen worden bereikt.
Dit protocol gaat ervan uit dat de gebruikers een eiwit- of klein molecuulkristalsysteem hebben, waaruit een microkristal slurry in de orde van grootte van 0,5-2,0 ml met een goede dichtheid van microkristallen per ml is geproduceerd. Protocollen voor het verkrijgen van kristal slurries zijn eerder beschreven 36. Er zijn veel verschillende soorten vaste doelen beschikbaar, de meest gebruikte bij I24 maken gebruik van een nauwkeurig gedefinieerde siliciumchip. Om zich te onderscheiden van andere chiplay-outs, onder en in de beamline-interface, wordt dit een 'Oxford-chip' genoemd. Zoals eerder beschreven bestaat de Oxford chip lay-out uit 8×8 'city blocks', elk met 20×20 diafragma's voor een totaal van 25.600 diafragma's20,21.

<table><tbody><tr><td>Chip Holders</td><td>Custom Built</td><td>N/A</td><td>In-house custom gebouwde metalen chip holders bestaande uit 2 magnetische basisplaten, 2 metalen ringen en een kinematische montage.</td></tr><tr><td>Chipless Chip Spacers</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>LCP-kleefbladen verkrijgbaar als onderdeel van de LCP-modulaire serie</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>Een multi-as controller/versterker met een aangepaste Diamond Light Source hardwareconfiguratie</td></tr><tr><td>Kinematic Mounts</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>Vierkante bases met 3 magneten gerangschikt in een driehoek bevestigd aan chip holders.</td></tr><tr><td>KNF Laboport Vacuümpomp</td><td>Merck</td><td>Z262285-1EA</td><td>Solide PTFE vacuümpomp, 10 l/min pompsnelheid.</td></tr><tr><td>Mylar-vellen 6 µm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15360562</td><td>300 ft rol van 6 µm dikke mylar XRF-folie van SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar-vellen 3 µm</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>300 ft rol van 3 µm dikke mylar XRF-folie van SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>Een compacte, zelfstandige glow discharge-systeem gebruikt om hydrofiele oppervlakken te produceren</td></tr><tr><td>Silicion Chips</td><td>University of Southampton</td><td>N/A</td><td>Op maat geëtste silicium chips met 25.600 gaten, verkrijgbaar in verschillende maten.</td></tr><tr><td>Translation Stages</td><td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ-monsterstanden zijn een gezamenlijk ontwerp van Diamond Light Source en SmarAct, op maat gebouwd door SmarAct met behulp van drie lineaire translatie 50 mm reisfasen, nauwkeurige gekruiste rolleiderails en een geïntegreerde sensor met een resolutie van maximaal 1 nm</td></tr><tr><td>1byOne Bevochtiger (701UK-0003 )</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>Commercieel verkrijgbare 1,3 liter ultrasone bevochtiger</td></tr></tbody></table>

vaste doel seriële gegevensverzameling bij diamond light source

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriële gegevensverzameling is een relatief nieuwe techniek voor synchrotrongebruikers. Een gebruikershandleiding voor het verzamelen van vaste doelgegevens op I24, Diamond Light Source wordt gepresenteerd met gedetailleerde stapsgewijze instructies, cijfers en video's voor een soepele gegevensverzameling.

Gegevensverzameling en -serie met lage doses Gegevens over lage doses (stap 5.1: scenario 1) en dosisreeksen (stap 5.2: scenario 2) werden verzameld over microkristallen van kopernitrietreductase bij I24 en zijn eerder gepubliceerd 42. Alle monsters werden voorbereid zoals beschreven in stap 1, gegevens verzameld volgens stap 3, 4 en 5, en verwerkt met behulp van methoden in stap 6. In dit werk werd een snelle dosisreeks verzameld met 20 diffractiefoto's gemaakt bij elk diafragma (d.w.z. n= 20 in de hierboven getoonde GUI voor gegevensverzameling) voordat naar een nieuw monster werd verplaatst. Uit deze gegevens werd een bimodale verdeling van eenheidscellen in ruimtegroep P213 geïdentificeerd (a = b = c = 97,25 Å en a = b = c = 96,38 Å). Het identificeren en scheiden van deze eenheidscelpolymorfen voor verwerking toonde een duidelijke verbetering van de indicatoren voor gegevenskwaliteit en onthulde twee verschillende structuren in een flexibele lus tussen residuen 189-193 in plaats van de gemengde toestand die werd waargenomen bij het verwerken van alle gegevens samen. Identificatie van dergelijke polymorfen zou het verschil kunnen maken in een delicate tijd-opgeloste structurele studie waar slechts kleine structurele veranderingen worden verwacht. Bovendien onthulde de verzamelde dosisreeks een dosisafhankelijke eenheidscelverandering in het kristal, waarbij een verhoogde dosis de populatie verlegde ten gunste van de grotere eenheidscel.
Vergelijkbaar werk werd uitgevoerd door Ebrahim et al (2019)47, waar een dosisreeks (Stap 5.2: Scenario 2) werd verzameld uit een heemperoxidase van het kleurstoftype van Streptomyces lividans (DtpAa) om lage dosisstructuren van SSX (Stap 5.1: Scenario 1) te vergelijken met die gemeten in hetzelfde vaste doelsysteem met behulp van SFX. SFX-gegevens werden verzameld bij SACLA Beamline BL2 EH3 met een pulslengte van 10 femtoseconden en een herhalingsfrequentie van 30 Hz. De 10 femtoseconde pulsduur zorgt ervoor dat dosisafhankelijke effecten niet aanwezig zijn in de SFX-gegevens. SFX-gegevens werden vergeleken met SSX-gegevens verzameld op beamline I24, waar 10 opeenvolgende blootstellingen van 10 milliseconden werden gemeten op elke monsterpositie (d.w.z. n= 10). De dosisafhankelijke migratie van een heemijzer gecoördineerd watermolecuul weg van het ijzer werd waargenomen, evenals een conformatieverandering in een van de heempropionaatgroepen in de SSX-dosisreeks. Hoewel niet schadevrij zoals de SFX-structuur, maakte de dosisreeks het mogelijk om de Fe-O-bindingslengte van een nul-dosis dataset (ferri-heem) te extrapoleren, waarbij dit binnen experimentele fouten overeenkwam met de waarde verkregen uit SFX.
De hier beschreven methoden voor het verzamelen van seriële kristallografiegegevens kunnen ook eenvoudig worden aangepast om nieuwe monsteromgevingen te bieden om bijvoorbeeld anaerobe eiwitstructuren bij kamertemperatuur te bestuderen. Zoals uiteengezet in Rabe et al 2020 48, maakt het laden van een 'sheet-on-sheet' monster, of 'chipless chip', met verschillende afdichtingsfilms in een anerobe kamer het mogelijk om structurele gegevens bij kamertemperatuur te verzamelen van dioxygeengevoelige monsters.
Pomp sonde Hoewel de volgende representatieve resultaten niet werden verzameld bij Diamond Beamline I24, zijn deze methoden ontwikkeld in nauwe samenwerking tussen faciliteiten in het iNEXT-programma om te werken aan standaardmethoden in de ontwikkeling van seriële kristallografiemethoden. Beamline I24 biedt, of zal binnenkort, gelijkwaardige verzamelmethoden aanbieden als de hieronder beschreven methoden om dergelijke experimenten uit te voeren met behulp van de methoden die in de bovenstaande protocollen worden beschreven.
Pompsonde: Snel mengen Rapid mixing SSX is uitgevoerd bij beamline T-REXX op PETRA III door Mehrabi et al (2019) 28 met behulp van een piëzo-aangedreven druppelinjector om reacties op vaste doelen te initiëren. Dit werk presenteert een proof of principle op chipmengingsexperiment dat GlcNac3bindt aan lysozymmicrokristallen, waarbij binding optreedt binnen 50 ms nadat een druppel van 75 pL op het monster wordt aangebracht. Deze studie werd gevolgd door een 7-structuur tijd-opgeloste reeks xylose-isomerase-activiteit, die glucosebinding binnen 15 ms en de vorming van een open ringconformatie in het glucosemolecuul na een tijdsvertraging van 60 seconden aantoonde. Een gelijkwaardige opstelling voor druppelinjectie is momenteel in ontwikkeling voor gebruik op I24.
Pompsonde: Lichtactivering Een lichtgeactiveerd pomp-sonde serieel experiment wordt gepresenteerd in Schulz et al (2018) 49. Fluoroacetaatdehydrogenase werd gedrenkt met gefotocageerd fluoroacetaat en gepompt met 320-360 nm laserlicht om structuren te produceren op 4 tijdstippen (t = 0, 30, 752 en 2.052 ms). De rusttoestandstructuur (0 ms) toont een lege actieve plaats, met uitzondering van enkele watermoleculen, en een equivalente dichtheid tussen de dopdomeinen van beide eiwitsubeenheden. 30 ms en 752 ms na lichtactivering kan een significante vermindering van de elektronendichtheid worden waargenomen in het cap-domein van subeenheid B ten opzichte van subeenheid A. De vermindering van de elektronendichtheid in het cap-domein van subeenheid B valt samen met het verschijnen van fluoroacetaat in de actieve plaats van subeenheid A bij 752 ms. De laatste dataset op 2.052 ms toont verdere structurele herschikking van het ligand, vermoedelijk om de juiste geometrie voor SN2-aanval te vergemakkelijken, en mogelijke vorming van een tussentoestand in de reactie. Op de I24 kan een draagbaar Pharos-lasersysteem worden gebruikt dat instelbaar is van 210-2500 nm en femtosecondepulsen levert voor lichtactivering. De eerste experimenten toonden de succesvolle activering van een fotokooi met behulp van 308 nm excitatie met binding van het vrijgegeven ligand aan het waargenomen doeleiwit. Op het moment van schrijven is de integratie in het beamline-veiligheidssysteem voor personeel aan de gang en worden routinematige gebruikersexperimenten begin 2021 verwacht. Voor experimenten waarbij minder intense lichtpulsen nodig zijn, is lichtactivering met TTL-gestuurde LED's met succes uitgevoerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Figuur 1: Monsterbeladingsapparatuur op zijn plaats bij Diamond Light Source. De opstelling bestaat uit een vacuümpomp (a), handschoenenkastje (b) en luchtbevochtiger (c). In het handschoenenkastje wordt vacuümdruk gebruikt om te werken op een chip geladen met kristal slurry die wordt vastgehouden in een monsterblok (d) bevestigd aan een Büchner-kolf(e,groene pijl), via een drukregelaar(f,gele pijl) bevestigd aan een stopkraan(g,blauwe pijl). Vochtige lucht wordt in de tent gepompt via plastic buizen die aan de luchtbevochtiger (h) zijn bevestigd en gemeten met behulp van een hygrometer (i). Componenten worden op hun plaats gehouden met behulp van klemstandaards(j). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Figuur 2: Monsterhouders. Ze gebruiken een metalen O-ring (a) om polyesterfilm op een bovenzijde (b) en onderste (c) helft te klemmen, waarbij de onderste helft magnetische bevestigingen (d) draagt die worden gebruikt om de monsterhouder aan de monstertrappen te bevestigen. De polyesterfilm (6 μm (e) of 3 μm (f)) en rubberen O-ringen (witte pijlen) voorkomen dat een kristalbeladen chip snel droogt in een monsterhouder die goed is gesloten met zeskantbouten (g). Chips worden gereinigd met behulp van opeenvolgende baden van 15 minuten in dH2O, 1 M HCl en dH2O (h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Figuur 3: Data collection GUI voor fixed target data collection at I24. (a) Toont de belangrijkste interface die wordt gebruikt voor het uitlijnen van chips en het definiëren van parameters voor gegevensverzameling, (b) is de mapping lite interface die wordt gebruikt voor het definiëren van subregio's van een chip voor gegevensverzameling en (c) is een interface voor het definiëren van parameters voor laserverlichting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Figuur 4: Het proces van het monteren van een spaanhouder op de trappen zoals beschreven in stap 3, punt 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Figuur 5: Spaanuitlijning. Een chip wordt uitgelijnd door op drie fiduciale markers op de chip te klikken die wordt weergegeven in (a). De weergaven van fiducialen 0, 1 en 2 door het beamline on-axis kijksysteem worden weergegeven in (b), (c) en (d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Figuur 6: Resultaten voor automatische verwerking worden gestart zoals beschreven in stap 6.1. Er wordt een hit-rate plot weergegeven(a), inzet). Als er op een 'hit' wordt geklikt, wordt het bijbehorende diffractiebeeld weergegeven in de image viewer van dials. De hit-rate voor de huidige gegevensverzameling wordt weergegeven (29,6% in dit voorbeeld). Paneel (b) toont een voorbeeld van een venster met de huidige indexerings- en integratiesnelheden voor gegevens die tot nu toe tijdens het bezoek zijn verzameld en die in realtime worden bijgewerkt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Figuur 7: Meer diepgaande data-analyse. Visualisatie van eenheidscelparameters kan polymorfen (a) onthullen. Gemiddelde eenheid celparameters worden berekend; dit geldt echter nog niet voor individuele gemiddelden voor polymorfen. Visualisatie van een kleine subset van gegevens (getoonde gegevens zijn een subset van 793 kopernitrietreductasekristallen uit de gegevens beschreven in Ebrahim et al 2019) is vaak voldoende om trends te onthullen. 2D-plots van nuttige parameters kunnen ook worden geproduceerd om variaties te onthullen die optreden als gevolg van belastings- of uitdrogingseffecten die kunnen worden aangepakt voor toekomstige gegevensverzamelingen (b). Stereografische projecties kunnen de aan- of afwezigheid van voorkeursoriëntaties onthullen die worden teruggevoerd naar het belastingsprotocol (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We presenteren een uitgebreide gids voor de voorbereiding van vaste doelmonsters, gegevensverzameling en gegevensverwerking voor seriële synchrotronkristallografie op Diamond beamline I24.

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Seriële synchrotronkristallografie, of SSX, is een relatief nieuw en zich snel ontwikkelend gebied van MX.Het is zeer geschikt voor experimenten met lage doses en kamertemperatuur, maar misschien wel het belangrijkste, het is echt goed geschikt om dynamiek te volgen. Hierdoor kunnen stop-motionfilms van eiwitten in actie worden gemaakt. Bij I24 zijn meerdere modi van SSX beschikbaar.Dit protocol richt zich op SSX met een vast doel, waarmee een breed scala aan seriële experimenten met beperkte hoeveelheden monsters mogelijk is. De siliciumchips kunnen beschadigd raken bij het laden en schoonmaken, als je er niet bekend mee bent. Ook is het chipuitlijningsprotocol volledig nieuw voor veel kristallografen en is de gegevensverwerking iets anders dan uw standaard rotatiegegevens.Om een spaanhouder voor te bereiden, snijdt u twee vellen polyesterfolie in vierkanten van ongeveer 6 bij 6 centimeter en plaatst u de vellen over de twee basisplaten. Gebruik metalen afdichtingsringen, bevestig de vellen op hun plaats en trek vervolgens voorzichtig aan de overtollige folie om eventuele vouwen te verwijderen. Selecteer vervolgens een siliciumchip met openingen van de juiste grootte ten opzichte van de grootte van de te analyseren kristallen.Gloei de chip gedurende 25 seconden op 0,39 millibar, met een stroom van 15 milliampere. Gebruik een pincet om de siliciumchip op de chiplaadtrap te plaatsen, met de verhoogde staven naar beneden gericht. Breng vervolgens met een pipet 200 microliter van de microkristalbrij aan op de platte kant van de chip en verspreid de slurry om alle stadsblokken van de chip te bedekken.Als de chip beschadigd is, bedek eventuele gaten dan met een klein stukje polyesterfolie, om ervoor te zorgen dat een gelijkmatig vacuüm kan worden aangebracht. Breng vervolgens een zacht vacuüm aan om alle overtollige vloeistof door de chip te lokken. Verwijder de chip uit de chiplaadfase en dep voorzichtig de onderkant van de chip met filtreerpapier om overtollige vloeistof te verwijderen.Plaats de geladen chip op de grotere helft van de chiphouder tussen de geleidingsmarkeringen, plat naar beneden. Plaats de kleine helft van de chiphouder op de chip om deze af te sluiten. De twee helften van de chiphouder moeten op hun plaats klikken.Bevestig vervolgens met behulp van zeskantbouten de chip stevig op zijn plaats. Om de chip uit te lijnen, houdt u de chiphouder in een hoek van 30 graden terwijl u de houder nadert. Gebruik vervolgens de kinematische bevestigingen om de geladen chip op het XYZ-podium bij de bundellijn te plaatsen.Wanneer de magneten contact maken, laat u de chiphouder parallel aan de stroom draaien en klikt u op zijn plaats. Zodra de chip is geplaatst, gebruikt u het beamline on-axis weergavesysteem en de grafische gebruikersinterface voor chipuitlijning om de fiduciale bovenlinks van de chip te lokaliseren. Als u fiduciair 0 wilt centreren in X, Y en Z, beweegt u in en uit focus om Z uit te lijnen, omhoog en omlaag om Y uit te lijnen, en links en rechts om X uit te lijnen.Klik vervolgens op Fiduciaal 0 instellen"Nadat u fiducial 1 en 2 op dezelfde manier hebt uitgelijnd met de röntgenstraal, klikt u op Coördinatensysteem maken" om een coördinatenmatrix te genereren.Klik vervolgens op Block Check"om de XYZ-fase naar de eerste put van elk stadsblok te verplaatsen. Als het röntgenkruishaar op één lijn staat met de openingen, wordt de chip uitgelijnd. In deze grafische weergave van spot finding resultaten van DIALS kan een actualisering hit-rate plot worden waargenomen.Als op een hit wordt geklikt, wordt de bijbehorende diffractieafbeelding weergegeven in de DIALS-beeldviewer. In deze tabel kunnen de huidige indexerings- en integratiepercentages worden gevisualiseerd die in realtime worden bijgewerkt naarmate de gegevens tijdens het bezoek worden verzameld. Visualisatie van de eenheidscelparameters kan polymorfen onthullen.Tweedimensionale plots van nuttige parameters kunnen ook worden geproduceerd om variaties te onthullen die optreden als gevolg van belastings- of uitdrogingseffecten. Stereografische projecties kunnen de aan- of afwezigheid van voorkeursoriëntaties onthullen die kunnen worden teruggevoerd naar het belastingsprotocol. In deze projectie kunnen bijvoorbeeld de effecten van het overbelasten van een chip met lysozymkristallen worden waargenomen.Pipetteer bij het laden van de chip langzaam en gebruik uw vinger om de pipet boven de chip te laten rusten. Dit voorkomt dat je de chip aanraakt en per ongeluk gaten in het silicium prikt. Maak bij het verwerken van gegevens gebruik van de beschikbare geautomatiseerde pijpleidingen.Dit geeft u een goed idee van hoe uw experiment vordert en of u iets moet variëren. Deze methode kan worden toegepast op elk eiwitsysteem dat in aanzienlijke hoeveelheden kan worden gekristalliseerd. En de reactie kan worden veroorzaakt door lichte röntgenstralen of snelle menging.Dynamische studies op een reeks structuren kunnen inzicht geven in hoe eiwitten functioneren.

fixed-target-serial-data-collection-at-diamond-light-source

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Digitale Micromirror apparaten (DMD) kan genereren complexe patronen in ruimte en tijd om mee te neuronale prikkelbaarheid te controleren. Die relevant zijn voor het ontwerp, de bouw en de exploitatie van het DMD-systemen worden besproken. Een dergelijk systeem kon de demonstratie van niet-lineaire integratie tussen distale dendritische tak punten.

Patroon fotostimulering met Digital Micromirror Apparaten voor het Dendritische Integratie Onderzoek Across Branch Punten

Drosophila-larven zijn lichtgevoelig en reageren op veranderingen in het omringende licht. Deze video beschrijft een test die hun vermogen om licht te vermijden test, de zogenaamde light spot assay. Het aanbevolen protocol laat zien hoe u de test instelt met een led met blauw licht en laat zien hoe u het gedrag van het dier kunt registreren als reactie op de ontmoeting met het licht.

Light Spot Assay: een methode om drosophila-fototactisch gedrag te onderzoeken

Deze gegevens van het protocol, de bouw en de exploitatie van een real-time 3D één deeltje tracking Microscoop staat tracking nanoschaal fluorescerende probes hoge diffusive snelheden en lage foton graaf tarieven.

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

Dit protocol introduceert een lichtvlek test om Drosophila larvale phototactische gedrag te onderzoeken. Bij deze test wordt een lichtvlek opgewekt als licht stimulatie en wordt het proces van het vermijden van larvale licht door een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem vastgelegd.

Licht spot-gebaseerde assay voor analyse van Drosophila larval phototaxis

Een protocol wordt gepresenteerd voor geautomatiseerde bestraling van dunne goudfolie met hoge intensiteit laserpulsen. Het protocol bevat een stapsgewijze beschrijving van het micromachining doelfabricageproces en een gedetailleerde handleiding voor hoe doelen in de focus van de laser worden gebracht met een snelheid van 0,2 Hz.

Geautomatiseerde levering van microfabriceerde doelen voor intense laser bestraling experimenten

Hier presenteren we een protocol voor cryogene monstervoorbereiding en overdracht van kristallen naar het vacuümeindstation op beamline I23 bij Diamond Light Source, voor macromoleculaire röntgenkristallografie-experimenten met lange golflengte.

Monstervoorbereidings- en overdrachtsprotocol voor in-vacuüm kristallografie met lange golflengte op Beamline I23 bij Diamond Light Source

Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.

On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

We presenteren een protocol voor de kristallisatie van eiwitten met behulp van de kristallisatiefaciliteit in het Research Complex in Harwell en de daaropvolgende in situ röntgenkristallografische gegevensverzameling van kristallen in de platen bij Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We beschrijven monstervereisten, kristallisatieprotocollen en richtlijnen voor gegevensverzameling.

Kristallisatie en in situ verzameling van gegevens over kamertemperatuur met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell en Beamline VMXi, Diamond Light Source

Het protocol maakt gebruik van geavanceerde light-sheet microscopie samen met aangepaste methoden voor het opruimen van weefsel om ingewikkelde hartstructuren in knaagdierharten te onderzoeken, met een groot potentieel voor het begrijpen van cardiale morfogenese en remodellering.

Light-sheet beeldvorming om de hartstructuur in knaagdierharten te onthullen

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Leer vaste-doel seriële synchrotronkristallografie voor structurele biologie met siliciumchips. Deze methode optimaliseert dataverzameling bij Diamond Light Source I24 voor eiwitdynamica.

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Meer video's verkennen