Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source
26 februari 2021
We presenteren een uitgebreide gids voor de voorbereiding van vaste doelmonsters, gegevensverzameling en gegevensverwerking voor seriële synchrotronkristallografie op Diamond beamline I24.
Seriële synchrotronkristallografie, of SSX, is een relatief nieuw en zich snel ontwikkelend gebied van MX.Het is zeer geschikt voor experimenten met lage doses en kamertemperatuur, maar misschien wel het belangrijkste, het is echt goed geschikt om dynamiek te volgen. Hierdoor kunnen stop-motionfilms van eiwitten in actie worden gemaakt. Bij I24 zijn meerdere modi van SSX beschikbaar.
Dit protocol richt zich op SSX met een vast doel, waarmee een breed scala aan seriële experimenten met beperkte hoeveelheden monsters mogelijk is. De siliciumchips kunnen beschadigd raken bij het laden en schoonmaken, als je er niet bekend mee bent. Ook is het chipuitlijningsprotocol volledig nieuw voor veel kristallografen en is de gegevensverwerking iets anders dan uw standaard rotatiegegevens.
Om een spaanhouder voor te bereiden, snijdt u twee vellen polyesterfolie in vierkanten van ongeveer 6 bij 6 centimeter en plaatst u de vellen over de twee basisplaten. Gebruik metalen afdichtingsringen, bevestig de vellen op hun plaats en trek vervolgens voorzichtig aan de overtollige folie om eventuele vouwen te verwijderen. Selecteer vervolgens een siliciumchip met openingen van de juiste grootte ten opzichte van de grootte van de te analyseren kristallen.
Gloei de chip gedurende 25 seconden op 0,39 millibar, met een stroom van 15 milliampere. Gebruik een pincet om de siliciumchip op de chiplaadtrap te plaatsen, met de verhoogde staven naar beneden gericht. Breng vervolgens met een pipet 200 microliter van de microkristalbrij aan op de platte kant van de chip en verspreid de slurry om alle stadsblokken van de chip te bedekken.
Als de chip beschadigd is, bedek eventuele gaten dan met een klein stukje polyesterfolie, om ervoor te zorgen dat een gelijkmatig vacuüm kan worden aangebracht. Breng vervolgens een zacht vacuüm aan om alle overtollige vloeistof door de chip te lokken. Verwijder de chip uit de chiplaadfase en dep voorzichtig de onderkant van de chip met filtreerpapier om overtollige vloeistof te verwijderen.
Plaats de geladen chip op de grotere helft van de chiphouder tussen de geleidingsmarkeringen, plat naar beneden. Plaats de kleine helft van de chiphouder op de chip om deze af te sluiten. De twee helften van de chiphouder moeten op hun plaats klikken.
Bevestig vervolgens met behulp van zeskantbouten de chip stevig op zijn plaats. Om de chip uit te lijnen, houdt u de chiphouder in een hoek van 30 graden terwijl u de houder nadert. Gebruik vervolgens de kinematische bevestigingen om de geladen chip op het XYZ-podium bij de bundellijn te plaatsen.
Wanneer de magneten contact maken, laat u de chiphouder parallel aan de stroom draaien en klikt u op zijn plaats. Zodra de chip is geplaatst, gebruikt u het beamline on-axis weergavesysteem en de grafische gebruikersinterface voor chipuitlijning om de fiduciale bovenlinks van de chip te lokaliseren. Als u fiduciair 0 wilt centreren in X, Y en Z, beweegt u in en uit focus om Z uit te lijnen, omhoog en omlaag om Y uit te lijnen, en links en rechts om X uit te lijnen.Klik vervolgens op Fiduciaal 0 instellen"Nadat u fiducial 1 en 2 op dezelfde manier hebt uitgelijnd met de röntgenstraal, klikt u op Coördinatensysteem maken" om een coördinatenmatrix te genereren.
Klik vervolgens op Block Check"om de XYZ-fase naar de eerste put van elk stadsblok te verplaatsen. Als het röntgenkruishaar op één lijn staat met de openingen, wordt de chip uitgelijnd. In deze grafische weergave van spot finding resultaten van DIALS kan een actualisering hit-rate plot worden waargenomen.
Als op een hit wordt geklikt, wordt de bijbehorende diffractieafbeelding weergegeven in de DIALS-beeldviewer. In deze tabel kunnen de huidige indexerings- en integratiepercentages worden gevisualiseerd die in realtime worden bijgewerkt naarmate de gegevens tijdens het bezoek worden verzameld. Visualisatie van de eenheidscelparameters kan polymorfen onthullen.
Tweedimensionale plots van nuttige parameters kunnen ook worden geproduceerd om variaties te onthullen die optreden als gevolg van belastings- of uitdrogingseffecten. Stereografische projecties kunnen de aan- of afwezigheid van voorkeursoriëntaties onthullen die kunnen worden teruggevoerd naar het belastingsprotocol. In deze projectie kunnen bijvoorbeeld de effecten van het overbelasten van een chip met lysozymkristallen worden waargenomen.
Pipetteer bij het laden van de chip langzaam en gebruik uw vinger om de pipet boven de chip te laten rusten. Dit voorkomt dat je de chip aanraakt en per ongeluk gaten in het silicium prikt. Maak bij het verwerken van gegevens gebruik van de beschikbare geautomatiseerde pijpleidingen.
Dit geeft u een goed idee van hoe uw experiment vordert en of u iets moet variëren. Deze methode kan worden toegepast op elk eiwitsysteem dat in aanzienlijke hoeveelheden kan worden gekristalliseerd. En de reactie kan worden veroorzaakt door lichte röntgenstralen of snelle menging.
Dynamische studies op een reeks structuren kunnen inzicht geven in hoe eiwitten functioneren.
Overzicht
Dit artikel biedt een uitgebreide handleiding voor de preparatie van vaste-doelwitmonsters, gegevensverzameling en gegevensverwerking voor seriële synchrotronkristallografie bij de Diamond beamline I24. Er wordt nadruk gelegd op de methodologie voor het uitvoeren van experimenten met beperkte monstermengden, terwijl de integriteit van de chip behouden blijft.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Structurele biologie
- Kristallografie
- Proteïnedynamica
Achtergrond
- Seriële synchrotronkristallografie (SSX) is een zich ontwikkelend gebied binnen de macromoleculaire kristallografie.
- Het is geschikt voor experimenten met een lage dosis en op kamertemperatuur.
- SSX maakt dynamische studies van eiwitten mogelijk, waardoor hun werking gevisualiseerd kan worden.
- Fixed-target SSX kan beperkte monsterhoeveelheden effectief benutten.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor fixed-target SSX bij de Diamond beamline I24.
- Om een juiste chipvoorbereiding en uitlijning te garanderen voor optimale gegevensverzameling.
- Om de verschillen in gegevensverwerking ten opzichte van standaard rotatiedata te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van siliciumchips met behulp van polyesterfolie en verzegelingstechnieken.
- Aanbrengen van microkristalsuspensie op de chips en vacuümaspiratie.
- Uitlijning van de chips met behulp van een grafische gebruikersinterface bij de beamline.
- Real-time datavisualisatie en -verwerking met behulp van geautomatiseerde pipelines.
Belangrijkste Resultaten
- Een succesvolle uitlijning van de chips leidt tot een nauwkeurige gegevensverzameling.
- Realtime monitoring van de indexerings- en integratiesnelheden tijdens experimenten.
- Visualisatie van eenheidscelparameters onthult polymorfen en ladeffecten.
- Dynamische studies bieden inzicht in de eiwitfunctionaliteit.
Conclusies
- Het protocol verhoogt de efficiëntie van fixed-target SSX-experimenten.
- Een juiste hantering en uitlijning van de chip zijn cruciaal voor een succesvolle gegevensverzameling.
- Dynamische studies met behulp van SSX kunnen ons begrip van het eiwitgedrag aanzienlijk verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Seriële synchrotronkristallografie met een vast target stelt structurele biologen in staat om dynamische studies van eiwitten uit te voeren met beperkte hoeveelheden monster, wat targetvalidatie ondersteunt door middel van structurele inzichten met een hoge resolutie. Deze methode vermindert het monsterverbruik terwijl de datakwaliteit behouden blijft, wat cruciaal is voor vroege ontdekkingsfasen waarin eiwitexpressie en -zuivering knelpunten vormen. Door experimenten bij kamertemperatuur en tijdsongeloopte experimenten te faciliteren, wordt het mechanistische begrip van de eiwitfunctie verbeterd, wat bijdraagt aan leadoptimalisatie en het verminderen van risico's in de preklinische ontwikkeling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door eiwitconformaties in actie vast te leggen, wat bijdraagt aan functionele targetvalidatie.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van grote kristalvolumes, waardoor screening van uitdagende targets met beperkte expressieopbrengsten mogelijk wordt.
- Voorspellend vertrouwen: Levert structurele gegevens die bijdragen aan de karakterisering van de bindingsplaats en het werkingsmechanisme, wat de besluitvorming bij targetselectie verbetert.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve elektronendichtheidskaarten uit microkristallen, waardoor nauwkeurige beoordelingen van ligandbinding mogelijk zijn.
- Operationele waarde: Standaardiseert monsterplaatsing en uitlijning via chipgebaseerde systemen, wat de reproduceerbaarheid bij screeningcampagnes verbetert.
- Assay-gereedheid: Levert real-time hit-rate- en indexeringsmetrieken die go/no-go-beslissingen ondersteunen tijdens fragment- of compound-screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Onthult polymorfe vormen en conformationele veranderingen die de drugbinding of stabiliteit kunnen beïnvloeden, wat bijdraagt aan formuleringsstrategieën.
- Operationele waarde: Legt tijdsongeloopte structurele gegevens vast die gecorreleerd kunnen worden met functionele assays, waardoor de afstemming van translationele biomarkers wordt versterkt.
- Risicobeperking: Identificeert vroegtijdig artefacten door belading of dehydratatie-effecten, waardoor het risico op misinterpretatie bij downstream-optimalisatie wordt verminderd.
Integratie van Pipeline en Workflow
Fixed-target SSX wordt geïntegreerd in de discovery-workflow na targetidentificatie en assayontwikkeling, waarbij structurele inzichten worden geboden die de leadidentificatie en preklinische validatie sturen. Het ondersteunt iteratieve design-make-test-analyze cycli door snelle structurele feedback te leveren over verbinding-binding en proteïnedynamica.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door ligand-geïnduceerde conformationele veranderingen en proteïnedynamiek die relevant zijn voor het werkingsmechanisme te visualiseren.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde chipvoorbereiding en uitlijning, waardoor een consistente datakwaliteit bij compound-screenings wordt gewaarborgd.
- Analytics: Levert kwantitatieve output, waaronder eenheidscelparameters, hitrates en integratiemetrieken, die een objectieve vergelijking van experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt structurele observaties met functionele uitkomsten door dynamiek te onthullen die de biologische beschikbaarheid of target-engagement kan beïnvloeden.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor structurele screening over meerdere targets, waardoor revalidatie-inspanningen in multi-projectomgevingen worden verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door het leveren van structurele gegevens met een hoge resolutie en tijdsresolutie onder bijna fysiologische omstandigheden.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde chipafhandeling, uitlijningsprotocollen en geautomatiseerde dataprocessing-pipelines.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het minimaliseren van het monsterverbruik en het mogelijk maken van snelle iteraties in campagnes voor structurele optimalisatie.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistische ambiguïteit in target-ligand-interacties te verminderen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in macromoleculaire kristallografie en bekendheid met technieken voor monsterbehandeling op basis van synchrotrons.
- Afhankelijk van toegang tot beamline-infrastructuur met kinematische montage, on-axis weergave en geautomatiseerde datapijplijnen zoals DIALS.
- Noodzaakt tot cross-team standaardisatie van chipvoorbereiding, vacuümaspiratie en uitlijnprocedures om dataconsistentie te waarborgen.
- Omvat aanpassingen voor verschillende kristalformaten en ruimtegroepen, waarbij selectie van de diafragmaopening en spreidingstechnieken moeten worden bijgesteld.
- Bevat praktische beperkingen zoals de fragiliteit van de chip tijdens het laden en reinigen, en gevoeligheid voor dehydratie-effecten die de kristalkwaliteit in de loop van de tijd kunnen beïnvloeden.
