Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Deze techniek maakt gebruik van instrumenten die vaak in de meeste laboratoriumomgevingen worden aangetroffen en maakt het mogelijk om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren. Deze methode kan belangrijke inzichten bieden in hoe lipidenmetabolisme enzymen worden gereguleerd in een cellulaire context en in verschillende genetische achtergronden. Ent een kolonie van een gistkweekplaat in 20 milliliter SC-media met 2% dextrose en incubeer bij 30 graden Celsius voor een nacht met schudden bij 200 tpm.

Verdun de volgende dag de cultuur in 50 milliliter verse media tot een laatste OD van 0,2 en laat het 24 uur groeien totdat de stationaire fase is bereikt. Bereid twee 20 milliliter aliquots blusbuffer voor elk monster en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Bereid tegelijkertijd radiolabelmedia voor door azijnzuurnatriumzout toe te voegen aan dextrosevrije SC-media in een uiteindelijke concentratie van 10 microcurie per milliliter.

Verzamel de cellen door gedurende 10 minuten op 4, 100 x g te centrifugeren. Verwijder het supernatant en was de celkorrel eenmaal met 20 milliliter dextrosevrije SC-media. Verzamel de cellen opnieuw door gedurende vijf minuten op 4, 100 x g te centrifugeren en breng ze over op een gelabelde microcentrifugebuis van twee milliliter met behulp van dextrous vrije media.

Centrifugeer de cellen nog twee minuten. Resuspendeer de cellen in 500 microliters dextrosevrije SC-media en begin de radiolabelperiode door snel 500 microliters radiolabelingmedia toe te voegen aan elke celsuspensie. Incubeer de buizen gedurende 20 minuten in een roterende incubator op 30 graden Celsius.

Koel ondertussen de centrifuge uitgerust voor 50 milliliter conische buizen tot min 10 graden Celsius en ontdooi een 20 milliliter aliquots blusbuffer. Zodra de radiolabelperiode is afgelopen, gebruikt u een pipet om het hele monster van één milliliter in ontdooide blusbuffer op ijs te dompelen. Verzamel de celkorrel door gedurende drie minuten in een voorgekoelde centrifuge op 5.000 x g te draaien en voeg 20 milliliter verse koude blusbuffer toe.

Vortex en schud de monsters om ze volledig te resuspend in het doven van buffer en centrifugeer de monsters opnieuw om de cellen te verzamelen. Zodra de cellen zijn geplet, verwijdert u alle blusbuffer grondig uit de monsters door het supernatant af te gieten en het overtollige met een pipet te verwijderen. Bewaar de buizen op min 80 graden Celsius voor verdere verwerking.

Weeg 0,3 gram zuur gewassen glazen kralen voor elk monster en bewaar ze in twee milliliter microcentrifugebuizen op ijs. Haal de celkorrels uit de min 80 graden vriezer en leg ze op ijs. Voeg vervolgens 350 microliter methanol en 700 microliter chloroform toe aan elk monster en geef de cellen opnieuw op.

Breng ze over in microcentrifugebuizen met voorgewogen glasparels. Lyse de cellen door driemaal gedurende één minuut te vortexen, met 30 seconden incubatie op ijs tussen agitaties. Giet de cellen in een glazen centrifugebuis van 15 milliliter en label de buis als buis A.Was de microcentrifugebuis met één milliliter methanol, draai deze om en giet de methanol in buis A.Voeg twee milliliter chloroform toe gevolgd door 400 microliter water aan buis A voor een eindmonstervolume van 4,45 milliliter.

Draai de monsters gedurende één minuut, gevolgd door een centrifugeren van vijf minuten bij 1000 x g om de waterige en organische fasen duidelijk te scheiden met celresten die op de interface liggen. Verzamel met behulp van een glazen weidepipet de organische fase in een nieuwe glazen centrifugebuis met het label B en voeg een milliliter van één molair kaliumchloride toe. Voeg een milliliter methanol en twee milliliter chloroform toe aan buis A en herhaal de vortex- en centrifugeerstappen.

Vortex en centrifugebuis B om de waterige en organische fase te scheiden. Verwijder de bovenste waterige laag en verzamel de hele organische onderste laag in een glazen flacon van vier milliliter. Verdampt het oplosmiddel volledig uit de lipideextracten door te drogen onder inert gas en verwarm een oven voor op 145 graden Celsius voor het verwarmen van de TLC-plaat.

Bepaal de relatieve hoeveelheden radiolabel die door de cellen worden opgenomen voordat u ze op de TLC-plaat laadt. Reconstitueren van de monsterlipiden in 40 tot 50 microliter chloroform en methanol gemengd in een één-op-één verhouding door vortexen gedurende vijf minuten. Bereid 101 milliliter van het mobiele fase-oplosmiddel in een glazen gegradueerde cilinder.

Giet vervolgens het oplosmiddel in een glazen TLC-kamer met een 20 bij 20 TLC verzadigingskussen en een nauwsluitend deksel. Bereid een gekanaliseerde 20 bij 20 silicagel 60G plaat voor en markeer een lijn 1,5 centimeter boven de bodem van de plaat met een potlood. Zodra de plaat voldoende is verwarmd en het TLC-verzadigingskussen verzadigd is met oplosmiddel, verwijdert u de TLC-plaat uit de oven en gaat u onmiddellijk verder met het laden ervan.

Plaats met behulp van een pipet vijf microliters monster op de oorsprong van elke rijstrook die zich 1,5 centimeter boven de bodem van de TLC-plaat bevindt en herhaal de belasting totdat in elke rijstrook 20 tot 40 microliter monster is geladen. Zodra de standaard en de monsters zijn geladen, plaatst u de plaat in de ontwikkelkamer en wacht u tot het oplosmiddel de bovenkant van de plaat heeft bereikt. Wanneer de plaat volledig is ontwikkeld, verwijdert u deze uit de kamer en laat u deze 20 minuten drogen in de zuurkast.

Nadat de plaat is gedroogd, bedek je deze met plastic folie en plaats je deze in een ontwikkelende cassette met een autoradiografiescherm. Verwijder het scherm van de zich ontwikkelende cassette en plaats het in een fosforbeeld. Besproei de TLC-plaat met p-Anisaldehyde-reagens totdat het silica verzadigd is en bak het vervolgens vijf minuten in een oven van 145 graden of totdat er banden zijn verschenen.

Om lipidesoorten te kwantificeren, schraapt u de silicagel die individuele lipidesoorten bevat en draagt u deze over naar glazen scintillatieflacons. Voeg zes milliliter scintillatievloeistof en vortex krachtig toe totdat de silicaband tot kleine stukjes is gereduceerd. Plaats het rek met de scintillatiefons in een scintillatieteller en tel door de teltijd aan te passen aan twee minuten per flacon.

Fosfor beeldvorming maakt visualisatie van autoradiogram van label-vrij vetzuur, triacylglycerol, diacylglycerol, cholesterol en squalaan mogelijk. Er werd aangetoond dat gezuiverde lipidensoorten in deze methode kunnen worden gescheiden en vervolgens kunnen worden gevisualiseerd door de TLC-plaat te besproeien met p-Anisaldehydereagens. Gevisualiseerde soorten omvatten alle eerder genoemde lipiden naast steriele esters.

Door het toepassen van een 10 minuten chase periode in radiolabel-vrije media na de pols, werd het waargenomen bij de grote pool van squalaan verdwenen en totale cholesterol werd verhoogd. Evenzo correleerde het verschijnen van diacylglycerol in de achtervolgingsperiode met een afname van het signaal van vrije vetzuren. Voorafgaand aan het uitvoeren van het volledige protocol, is het belangrijk om te bepalen of de cellen het azijnzuur radiolabel zullen opnemen in de groeiconditie en genetische achtergrond van belang.