Name: Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer hoe je neutrale lipiden kwantificeert in Saccharomyces cerevisiae via metabole etikettering met 14C-azijnzuur en dunne laagchromatografie. Deze methode analyseert lipidenmetabolisme in diverse genetische achtergronden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de leden van het Henne lab bedanken voor hulp en conceptueel advies bij de afronding van dit onderzoek. W.M.H. wordt ondersteund door fondsen van de Welch Foundation (I-1873), het NIH NIGMS (GM119768), het Ara Paresghian Medical Research Fund en het UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R. is ondersteund door een T32-programmasubsidie (5T32GM008297).

1. Groei en etikettering van gistcellen met 14C-azijnzuur
<ol><li>Ent een gistcultuur in door een kolonie uit een bord te plukken en deze te doseren in 20 ml synthetische complete (SC) media die 2% dextrose bevatten (zie Aanvullend bestand voor het recept van SC-media). Incubeer bij 30 °C voor een nacht met schudden bij 200 tpm. OPMERKING: Groeiconditie, monstervolume en behandeling zullen verschillen op basis van de lipide(en) van belang. Voorafgaand aan volledige experimenten moeten optimale groeiomstandigheden en cultuurvolumes empirisch worden bepaald. Dit protocol bespreekt radiolabeling van gistculturen die in stationaire fase zijn gegroeid, een groeifase waarin de groei van biomembraan en cellen vertraagt en de NL-synthese zeer actief is.</li>
	<li>Meet de OD600 van de nachtcultuur met behulp van een spectrofotometer en verdun de gistcelkweek tot een uiteindelijke OD600 van 0,2 in 50 ml verse SC-media die 2% dextrose bevatten. Laat de cellen 24 uur groeien, of totdat ze de stationaire fase hebben bereikt (wat meestal wordt gedefinieerd door een vlakke voering van de celverdubbeling van OD600-meting).</li>
	<li>Voordat u de cellen verzamelt, maakt u de blusbuffer (zie Aanvullend bestand voor meer informatie). Maak voor elk monster twee 20 ml voedingsbuffer (d.w.z. 40 ml blusbuffer voor elk monster) en verdeel gelijkmatig in twee conische buizen van 50 ml). Bewaar de blusbuffer aliquots bij -80 °C voor toekomstig gebruik.</li>
	<li>Zodra de culturen de gewenste OD of groeifase hebben bereikt, verzamelt u de cellen door gedurende 10 minuten bij 4.100 x g te centrifugeren. Terwijl de monsters zich in de centrifuge bevinden, bereidt u radiolabelingmedia voor door[1-14C] azijnzuurnatriumzout toe te voegen aan dextrosevrije SC-media bij een eindconcentratie van 10 μCi/ml. LET OP: Bij het werken met radioactieve stoffen dient u altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) te dragen. Volg altijd de lokale richtlijnen voor de juiste opslag, gebruik en verwijdering van radioactieve materialen. OPMERKING: Zowel de concentratie van 14C-azijnzuur in de etiketteermedia als de radiolabel incubatietijd moeten worden aangepast aan de metaboliet(en) van belang. Hier wordt een 20 min radiolabeling pulse incubatie gebruikt, wat voldoende is om NL soorten met een scala aan overvloed te labelen.</li>
	<li>Verwijder het supernatant uit de geplet cellen en was de celkorrel eenmaal met 20 ml dextrosevrije SC-media door de pellet opnieuw te gebruiken met een pipet. Verzamel de cellen opnieuw door gedurende 5 minuten op 4.100 x g te centrifugeren.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 ml dextrosevrije SC-media en breng de cellen over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 2 ml. Verzamel de cellen opnieuw door gedurende 2 minuten op 4.100 x g te centrifugeren.</li>
	<li>Resuspend de cellen opnieuw in 500 μL dextrosevrije SC-media. Koel een centrifuge die is uitgerust voor 50 ml conische buizen voor tot -10 °C of op de laagste temperatuurinstelling.</li>
	<li>Begin de radiolabelperiode door snel 500 μL radiolabelingmedia toe te voegen aan elke 500 μL celsuspensie (uiteindelijke concentratie 14C-azijnzuur = 5 μCi/ml). Incubeer de buizen in een roterende incubator bij 30 °C gedurende 20 min. 2 min voor het einde van de etiketteringsperiode, breng één 20 ml voedingsbuffer voor elk monster over van de vriezer van -80 °C naar een emmer ijs</li>
	<li>Zodra de radiolabelperiode is afgelopen, gebruikt u een pipet om het hele monster van 1 ml in 20 ml koude blusbuffer te dompelen. Draai de conische buizen 5-10 s om ervoor te zorgen dat het monster grondig is gemengd met de blusbuffer. Incubeer de monsters in de blusbuffer gedurende 2 minuten op ijs.</li>
	<li>Verzamel de celkorrel door in een centrifuge van 5.000 x g te draaien gedurende 3 minuten ingesteld op -10 °C of op de laagste temperatuurinstelling. Terwijl de monsterbuizen draaien, breng u nog een set blusbuffer aliquot van de -80 °C vriezer over in een emmer gevuld met ijs (d.w.z. één 20 ml buis blusbuffer per monster).</li>
	<li>Verwijder het blusbuffer supernatans uit celkorrels en vervang het door 20 ml verse, koude, blusbuffer. Draai de monsters en schud de monsters totdat de pellet van de bodem van de conische buis is losgeraakt en volledig in de blusbuffer is geresuspendeerd. Centrifugeer de monsters opnieuw op 5.000 x g gedurende 3 minuten bij -10 °C om de cellen te verzamelen.</li>
	<li>Zodra de cellen zijn geplet, verwijdert u alle blusbuffer grondig uit de monsters door het supernatant af te gieten en het overtollige met een pipet te verwijderen. Bewaar buizen bij -80 °C voor verdere verwerking.</li>
</ol>2. Isolatie van totale lipiden uit gist
OPMERKING: Het volgende protocol voor lipidenisolatie is gebaseerd op een gevestigde en veelgebruikte methode die efficiënt de meest neutrale lipidensoorten17,18extraheert . LET OP: Draag bij het gebruik van organisch oplosmiddel altijd de juiste PBM en werk indien mogelijk in een zuurkast. Vermijd tijdens lipidenextractie het gebruik van kunststoffen die onverenigbaar zijn met organische oplosmiddelen. Polypropyleen buizen zijn geschikt voor het volgende protocol.
<ol><li>Weeg 0,3 g zuurgekalkte glasparels voor elk monster en bewaar ze in microcentrifugebuizen van 2 ml op ijs. Haal de celkorrels uit de vriezer van -80 °C en houd ze op ijs. Voeg 350 μL methanol en 700 μL chloroform toe aan elk monster, resuspend, en breng over in microcentrifugebuizen met voorgewogen glasparels.</li>
	<li>Lyse cellen door het roeren van buizen op een vortex 3x gedurende 1 min, met 30 s incubaties op ijs tussen agitaties. Als alternatief kunnen cellen gedurende drie cycli van 1 minuut worden gelyseerd met behulp van een mini-kraalklopper. Bewaar 25-30 μL hele cellysaat in een aparte buis voor het tellen van scintillatie. OPMERKING: Het opgeslagen lysaat wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheid radio-isotoop te bepalen die door elk monster tijdens de pulsperiode wordt opgenomen, wat van invloed is op de hoeveelheid van elk monster dat op de TLC-plaat wordt geladen. Dit wordt verder besproken in stap 3.2.</li>
	<li>Giet de volledige inhoud van de 2 ml microcentrifugebuis in een glazen centrifugebuis van 15 ml [buis A]. Was de 2 ml microcentrifugebuizen door 1 ml methanol toe te voegen en 10-15 s te vortexen. Breng de 1 ml methanolwas over naar buis A en voeg 2 ml chloroform toe aan buis A, gevolgd door 400 μL water voor een eindmonstervolume van 4,45 ml.</li>
	<li>Vortexmonsters gedurende 1 min gevolgd door een 5 min centrifugeren bij 1.000 x g. Na centrifugeren moeten de waterige (bovenste) en organische (onderste) fasen duidelijk visueel worden gescheiden met celresten die op de interface liggen.</li>
	<li>Verzamel met behulp van een glazen Pasteur pipet de organische fase van buis A en ga naar een nieuwe glazen centrifugebuis van 15 ml (buis B). Voeg 1 ml 1 ML 1 M KCl toe aan buis B. Voeg aan buis A 1 ml methanol en 2 ml chloroform en 200 μL MiliQ-water toe. Herhaal de vortex- en centrifugeerstappen op buis A.</li>
	<li>Verzamel nogmaals de organische fase van buis A en voeg deze toe aan buis B. Gooi buis A weg in een geschikte container. Vortexbuis B gedurende 1 min gevolgd door een 5 min centrifugeren bij 1.000 x g.</li>
	<li>Verwijder de bovenste waterige laag van buis B en gooi deze weg. Voeg 1 ml verse 1 M KCl terug toe aan buis B en herhaal de vortexing/centrifugatiestap. Zodra de lagen zijn gescheiden, verzamelt u voorzichtig de hele organische onderste laag in een gelabelde glazen flacon van 4 ml. OPMERKING: Bij deze stap kunnen lipide-extracten worden opgeslagen bij -80 °C, of het protocol kan worden voortgezet voor TLC-scheiding van lipiden.</li>
</ol>3. Scheiding en kwantificering van radio-isotoop-gelabelde NLs door dunnelaagchromatografie
<ol><li>Als lipideextracten op -80 °C worden geplaatst, breng dan langzaam op kamertemperatuur door op ijs te broeden en vervolgens op een bankje. Verdampt het oplosmiddel volledig uit lipideextracten door vacuüm te drogen of een zachte stroom inert gas (bijv. argon of stikstof) te gebruiken. Verwarm ondertussen een oven voor op 145 °C voor het verwarmen van de TLC-plaat.</li>
	<li>Voordat monsters op de TLC-plaat kunnen worden geladen, moet u de relatieve hoeveelheden radiolabel bepalen die door de cellen worden opgenomen. Pipet 10 μL van het hele cellysaat vanaf stap 2.2 in een glazen scintillatieflacon van 6 ml, voeg 6 ml scintillatievloeistof toe en plaats flacons in een rek. Gebruik een scintillatieteller om de cpm of dpm van elk monster te meten met behulp van de teloptie single rack ingesteld op een teltijd van 1 min. Meet elke hele cellysaat in tweevoud om een gemiddelde voor elk monster te verkrijgen. Pas de laadhoeveelheid aan op basis van een wild type of referentiemonster OPMERKING: De hoeveelheid van elk monster dat op de TLC-plaat moet worden geladen, kan worden bepaald met behulp van de volgende vergelijking: (gemiddelde steekproeftellingen)/(gemiddelde referentietellingen) x het gewenste laadvolume. Als bijvoorbeeld 20 μL van het referentiemonster op de TLC-plaat moet worden geladen en een gemiddeld aantal van 1.000 heeft, wordt een experimenteel monster met een gemiddelde telling van 2.000 10 μL op de TLC-plaat geladen.</li>
	<li>Reconstitueert de monsterlipiden in 40-50 μL van 1:1 (v/v%) chloroform:methanol door 5 minuten vortexen. Bereid 101 ml van het mobiele fase-oplosmiddel voor in een glazen gegradueerde cilinder (zie de sectie Representatieve resultaten voor een voorbeeld van grote NL-soortscheiding door een 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexaan:Petroleumether:Diethylether:Azijnzuuroplosmiddel).</li>
	<li>Giet het oplosmiddel in een glazen TLC-kamer met een 20 x 20 TLC verzadigingskussen en een nauwsluitend deksel. Bereid een gekanaliseerde plaat van 20 x 20 silicagel 60 G voor door voorzichtig een lijn 1,5 cm boven de bodem van de plaat te markeren met een potlood. De lijn geeft de oorsprong aan en waar de lipiden worden geladen. Label onder de lijn voorzichtig het monster dat in elke rijstrook wordt geladen. Zodra de TLC-plaat is voorbereid, incubeer de plaat in een oven van 145 °C gedurende ten minste 30 minuten om de plaat voor te verwarmen en overtollig vocht te verwijderen.</li>
	<li>Zodra de plaat voldoende is verwarmd en het TLC-verzadigingskussen verzadigd is met oplosmiddel, verwijdert u de TLC-plaat uit de oven en gaat u onmiddellijk verder met het laden van de TLC-plaat. Het laden van de plaat terwijl deze warm is, zorgt voor een snelle verdamping van oplosmiddelen. Laad voor elke lipidesoort van belang 5-20 μg van een gezuiverde lipidenstandaard op een rijstrook van de TLC-plaat om de scheiding en de verwachte migratieafstand te volgen. Plaats met behulp van een pipet 5 μL monster op de oorsprong van elke baan die zich 1,5 cm boven de bodem van de TLC-plaat bevindt. Herhaal het laden van 5 μL-vlekken totdat 20-40 μL monster in elke rijstrook is geladen. OPMERKING: 5-20 μg ongelabelde gezuiverde lipiden kunnen aan elke monsterstrook worden toegevoegd als tracers die kunnen worden gekleurd en gevisualiseerd na TLC-scheiding van lipiden. De aanwezigheid van een bevlekte standaard maakt het mogelijk om radioactief gelabelde lipidenbanden eenvoudig te volgen en te excisie voor daaropvolgende scintillatietelling. Welke gezuiverde normen op de plaat worden geladen, wordt bepaald door de NL-interessesoort. Zie de sectie Representatief resultaat voor voorbeelden van het scheiden van oliezuur (FFA), 1,2 dioleoyl-glycerol (DG), trioleïne (TG), cholesterol (Chol), cholesteryl-linoleaat (SE) en squaleen in rijstroken naast de monsterbanen.</li>
	<li>Zodra de standaard en de experimentele monsters zijn geladen, plaatst u de plaat in de ontwikkelkamer en wacht u tot het oplosmiddel de bovenkant van de plaat heeft bereikt (40-60 min). Zodra de plaat volledig is ontwikkeld, verwijdert u deze uit de kamer en laat u deze 20 minuten drogen in de zuurkast.</li>
	<li>Nadat de plaat is gedroogd, bedek je deze met plastic folie en plaats je deze in een ontwikkelende cassette met een autoradiografiescherm. Laat de plaat zich 24-48 uur met het scherm ontwikkelen.</li>
</ol>4. Visualisatie en kwantificering van TLC gescheiden lipiden
<ol><li>Verwijder het scherm van de zich ontwikkelende cassette en plaats het in een fosforbeeld. Selecteer de optie Fosfor imaging en ontwikkel bij 800-1000 V. OPMERKING: Fosforbeeldvorming geeft een kwalitatief beeld van radioactief gelabelde lipiden op de TLC-plaat. Kwantificering van radioactief gelabelde lipiden kan echter het beste worden bereikt door scintillatietelling, die vervolgens wordt beschreven.</li>
	<li>Meng 100 ml p-anisaldehydereagens (zie Aanvullend bestand)en deponeer in een glazen spuitfles. Besproei de TLC-plaat met p-anisaldehydereagens totdat het silica verzadigd is. Bak de plaat 5 minuten in een oven van 145 °C of totdat er banden zijn verschenen.</li>
	<li>Om individuele lipidensoorten te kwantificeren met behulp van radiolabel scintillatietelling, gebruikt u een scheermesje om de silicagel van de glazen TLC-plaat te schrapen. Breng elke silicagelband die overeenkomt met een enkele radioactief gelabelde lipidesoort over in een glazen scintillatieflacon en voeg 6 ml scintillatievloeistof toe. Vortex krachtig totdat de silicaband tot kleine stukjes is gereduceerd.<ol>
<li>Als alternatief kunnen lipiden worden geëxtraheerd uit de silicagelband met behulp van het lipidenextractieprotocol in sectie 3. Als lipiden uit de silicagel worden geëxtraheerd, verdampt u het oplosmiddel volledig zoals in stap 3.1 en voegt u 6 ml scintillatievloeistof toe aan de gedroogde lipiden. Plaats het rek met scintillatiefons in een scintillatieteller. Selecteer de optie Tellen enkel rack en stel de teltijd in op 2 min per flacon. Resultaten van de scintillatieteller worden afgedrukt en kunnen worden gevisualiseerd als een staafdiagram.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li>
<li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li>
<li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li>
<li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+atherosclerosis%3A+A+perspective+for+the+1990s%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li>
<li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet%3A+A+conserved+cellular+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li>
<li>Wältermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes%3A+How+bacteria+fatten+up%3A+Lipid-body+formation+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li>
<li>Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li>
<li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).</li>
<li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li>
<li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li>
<li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+%5BRNQ%2B%5D+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Separations%22%5BJournal%5D)">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006(2018).</li>
<li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).</li>
<li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li>
<li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Bligh+and+Dyer%22+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn bij de voorbereiding van dit manuscript.

Hier wordt een veelzijdig radiolabeling protocol gepresenteerd om de synthese van NL soorten in gist kwantitatief te monitoren. Dit protocol is zeer modulair, waardoor de procedure binnen 3-6 dagen kan worden voltooid. Bovendien bestaat er een schat aan literatuur over het gebruik van TLC om lipidesoorten en metabolieten te scheiden, waardoor de gebruiker verschillende soorten lipiden van belang zou moeten kunnen detecteren met een eenvoudige wijziging van TLC-oplosmiddelsystemen16,<sup...

Acetyl-CoA is de fundamentele bouwsteen van diverse biomoleculen, waaronder neutrale lipiden (NLs), die dienen als een veelzijdige biomoleculaire valuta voor het bouwen van membranen, het genereren van ATP en het reguleren van celsignalering1,2. De beschikbaarheid van NLs die in een van deze respectieve trajecten moeten worden gemeden, wordt gedeeltelijk gereguleerd door hun opslag. Lipidedruppels (LDs), cytoplasmatische organellen bestaande uit hydrofobe kernen van triglyceriden (TGs) en sterolesters (SE's), zijn de belangrijkste opslagcompartimenten van de meeste cellulaire NLs. Als zodanig, LDs sequester en reguleren NLs, die kunnen worden afgebroken en vervolgens worden gebruikt voor biochemische en metabolische processen3,4. Het is bekend dat de verkeerde regulatie van NL- en LD-geassocieerde eiwitten gecorreleerd is met het begin van pathologieën waaronder lipodystrofie en metabool syndromen5,6. Hierdoor is het huidige LD-onderzoek intensief gericht op hoe NL-synthese ruimtelijk, tijdelijk en over verschillende weefsels van multicellulaire organismen wordt gereguleerd. Vanwege de alomtegenwoordige cellulaire rollen voor NLs, worden veel enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese en regulering van NLs bewaard in eukaryoten7. Inderdaad, zelfs sommige prokaryoten slaan NLs op in LDs8. Daarom zijn genetisch trekbare modelorganismen zoals Saccharomyces cerevisiae (ontluikende gist) nuttig geweest voor de studie van NL-synthese en -regulatie.
De scheiding en kwantificering van NLs uit celextracten kan op talloze manieren worden bereikt, waaronder gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS)9,10,11. Misschien is de eenvoudigste methode voor het scheiden van NLs via dunnelaagchromatografie (TLC), die latere densitometrische kwantificering mogelijk maakt van een standaardcurve12,13. Hoewel TLC slechts een koerskorrelige scheiding van NLs biedt, blijft het een krachtige techniek omdat het goedkoop is en het zorgt voor een snelle scheiding van NLs van meerdere monsters tegelijkertijd. Twee van de belangrijkste uitdagingen voor de studie van NLs via TLC zijn: 1) het brede scala aan cellulaire overvloed aan NL-soorten en hun tussenproducten, en 2) het bereik van hydrofielheid/hydrofobiciteit van lipide-tussenproducten binnen NL-syntheseroutes. Bijgevolg is de kwantificering van NL-soorten via TLC doorgaans beperkt tot de meest voorkomende soorten; de introductie van een 14C-azijnzuur radiolabel kan echter de detectie van tussenproducten met een lage overvloed binnen NL-trajecten aanzienlijk verbeteren. Azijnzuur wordt snel omgezet in acetyl-CoA door de acetyl-CoA synthetase ACS214, waardoor 14C-azijnzuur een geschikt radiolabeling substraat in gist15. Bovendien kan TLC zowel hydrofobe NLs als hydrofiele tussenproducten van NLs scheiden door het gebruik van meerdere oplosmiddelsystemen16. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de scheiding van NLs met behulp van 14C-azijnzuur metabolische etikettering in gist. Lipiden die tijdens de pulsperiode worden geëtiketteerd, worden vervolgens geïsoleerd door een goed vastgesteld totaal lipidenisolatieprotocol17, gevolgd door de scheiding van NL-soorten door TLC. Het ontwikkelen van TLC-platen door zowel autoradiografie om gelabelde lipiden te visualiseren, als een chemische spray om totale lipiden te visualiseren, maakt meerdere kwantificeringsmethoden mogelijk. Individuele lipidenbanden kunnen ook gemakkelijk uit de TLC-plaat worden gehaald met behulp van een scheermesje en scintillatietelling kan worden gebruikt om de hoeveelheid radioactief gelabeld materiaal in de band te kwantificeren.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 proof absolute ethanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Acid washed glass beads 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Amber bulbs voor Pastuer pipettes</td><td>Fisher</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate >99%</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 scintillatieteller</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (HPLC grade)</td><td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol >99%</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl-linoleate >98%</td><td>Sigma</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>Concentrated sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL conische buizen, polypropyleen met centristar-dop</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose, anhydrous grade</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether anhydrous grade</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Droogkast</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>EcoLume scintillatievloeistof</td><td>VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R centrifuge</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage phosphor screen</td><td>Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE Typhoon FLA9500 imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid, ACS grade</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Glas 6mL scintillatieviooltjes</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>Glas centrifugebuisjes doppen</td><td>Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>Glas centrifugebuizen</td><td>Fisher</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>Glas Pasteur-pipet</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, anhydrous grade</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-Adenine >99%</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine >98%</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine >99%</td><td>Sigma</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine >98%</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartaat >98%</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine >97%</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98%</td><td>Sigma</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine >99%</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine >99%</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine >99%</td><td>Sigma</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine >98%</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine >98%</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine >98%</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine, HPLC grade</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine, reagent grade</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline >99%</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine >99%</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Theronine, reagent grade</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophan >98%</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine >98%</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracil >99%</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine >98%</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, ACS grade</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid >99%</td><td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-anisaldehyde</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum ether, ACS grade</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99%</td><td>Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, ACS grade</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide pellets, gecertificeerd ACS</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Squaleen >98%</td><td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>Succinic Acid kristallijn/gecertificeerd</td><td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC verzadigingspad</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLC silicagel 60G glas gekanaliseerde plaat</td><td>Fisher</td><td>NC9825743</td><td>Geen fluorescente indicatoren</td></tr><tr><td>Transparante plastic film</td><td>Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Triolein >99%</td><td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Whatman belichtingskastje</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>Gist stikstofbasis zonder ammoniumsulfaat en aminozuren</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van neutrale lipidesynthese in saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Neutrale lipiden (NLs) zijn een klasse van hydrofobe, chargeless biomoleculen die een sleutelrol spelen in energie en lipide homeostase. NLs worden gesynthetiseerd de novo van acetyl-CoA en zijn voornamelijk aanwezig in eukaryoten in de vorm van triglyceriden (TGs) en sterol-esters (SEs). De enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van NLs zijn sterk geconserveerd van Saccharomyces cerevisiae (gist) op de mens, waardoor gist een nuttig modelorganisme is om de functie en regulering van NL-metabolismeenzymen te ontleden. Hoewel er veel bekend is over hoe acetyl-CoA wordt omgezet in een diverse set NL-soorten, worden er nog steeds mechanismen ontdekt voor het reguleren van NL-metabolismeenzymen en hoe verkeerde regulatie kan bijdragen aan cellulaire pathologieën. Gedurende tientallen jaren van onderzoek zijn tal van methoden voor de isolatie en karakterisering van NL-soorten ontwikkeld en gebruikt; een kwantitatief en eenvoudig protocol voor de alomvattende karakterisering van grote NL-soorten is echter niet besproken. Hier wordt een eenvoudige en aanpasbare methode gepresenteerd om de de novo synthese van belangrijke NL-soorten in gist te kwantificeren. We passen 14C-azijnzuur metabolische etikettering in combinatie met dunne laagchromatografie toe om een divers scala aan fysiologisch belangrijke NLs te scheiden en te kwantificeren. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast om in vivo reactiesnelheden van NL-enzymen of afbraak van NL-soorten in de loop van de tijd te bestuderen.

In dit protocol hebben we aangetoond dat het labelen, detecteren en kwantificeren van NL-soorten kan worden bereikt door 14C-azijnzuur metabolische etikettering. Grote NL-soorten kunnen worden gescheiden in een oplosmiddelsysteem van 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexaan:Petroleumether:Diethylether:Azijnzuur (Figuur 1A,B). Fosforbeeldvorming maakt visualisatie mogelijk van gelabeld vrij vetzuur (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), cholesterol (Chol) en squalee...

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Deze techniek maakt gebruik van instrumenten die vaak in de meeste laboratoriumomgevingen worden aangetroffen en maakt het mogelijk om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren. Deze methode kan belangrijke inzichten bieden in hoe lipidenmetabolisme enzymen worden gereguleerd in een cellulaire context en in verschillende genetische achtergronden. Ent een kolonie van een gistkweekplaat in 20 milliliter SC-media met 2% dextrose en incubeer bij 30 graden Celsius voor een nacht met schudden bij 200 tpm.Verdun de volgende dag de cultuur in 50 milliliter verse media tot een laatste OD van 0,2 en laat het 24 uur groeien totdat de stationaire fase is bereikt. Bereid twee 20 milliliter aliquots blusbuffer voor elk monster en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Bereid tegelijkertijd radiolabelmedia voor door azijnzuurnatriumzout toe te voegen aan dextrosevrije SC-media in een uiteindelijke concentratie van 10 microcurie per milliliter.Verzamel de cellen door gedurende 10 minuten op 4, 100 x g te centrifugeren. Verwijder het supernatant en was de celkorrel eenmaal met 20 milliliter dextrosevrije SC-media. Verzamel de cellen opnieuw door gedurende vijf minuten op 4, 100 x g te centrifugeren en breng ze over op een gelabelde microcentrifugebuis van twee milliliter met behulp van dextrous vrije media.Centrifugeer de cellen nog twee minuten. Resuspendeer de cellen in 500 microliters dextrosevrije SC-media en begin de radiolabelperiode door snel 500 microliters radiolabelingmedia toe te voegen aan elke celsuspensie. Incubeer de buizen gedurende 20 minuten in een roterende incubator op 30 graden Celsius.Koel ondertussen de centrifuge uitgerust voor 50 milliliter conische buizen tot min 10 graden Celsius en ontdooi een 20 milliliter aliquots blusbuffer. Zodra de radiolabelperiode is afgelopen, gebruikt u een pipet om het hele monster van één milliliter in ontdooide blusbuffer op ijs te dompelen. Verzamel de celkorrel door gedurende drie minuten in een voorgekoelde centrifuge op 5.000 x g te draaien en voeg 20 milliliter verse koude blusbuffer toe.Vortex en schud de monsters om ze volledig te resuspend in het doven van buffer en centrifugeer de monsters opnieuw om de cellen te verzamelen. Zodra de cellen zijn geplet, verwijdert u alle blusbuffer grondig uit de monsters door het supernatant af te gieten en het overtollige met een pipet te verwijderen. Bewaar de buizen op min 80 graden Celsius voor verdere verwerking.Weeg 0,3 gram zuur gewassen glazen kralen voor elk monster en bewaar ze in twee milliliter microcentrifugebuizen op ijs. Haal de celkorrels uit de min 80 graden vriezer en leg ze op ijs. Voeg vervolgens 350 microliter methanol en 700 microliter chloroform toe aan elk monster en geef de cellen opnieuw op.Breng ze over in microcentrifugebuizen met voorgewogen glasparels. Lyse de cellen door driemaal gedurende één minuut te vortexen, met 30 seconden incubatie op ijs tussen agitaties. Giet de cellen in een glazen centrifugebuis van 15 milliliter en label de buis als buis A.Was de microcentrifugebuis met één milliliter methanol, draai deze om en giet de methanol in buis A.Voeg twee milliliter chloroform toe gevolgd door 400 microliter water aan buis A voor een eindmonstervolume van 4,45 milliliter.Draai de monsters gedurende één minuut, gevolgd door een centrifugeren van vijf minuten bij 1000 x g om de waterige en organische fasen duidelijk te scheiden met celresten die op de interface liggen. Verzamel met behulp van een glazen weidepipet de organische fase in een nieuwe glazen centrifugebuis met het label B en voeg een milliliter van één molair kaliumchloride toe. Voeg een milliliter methanol en twee milliliter chloroform toe aan buis A en herhaal de vortex- en centrifugeerstappen.Vortex en centrifugebuis B om de waterige en organische fase te scheiden. Verwijder de bovenste waterige laag en verzamel de hele organische onderste laag in een glazen flacon van vier milliliter. Verdampt het oplosmiddel volledig uit de lipideextracten door te drogen onder inert gas en verwarm een oven voor op 145 graden Celsius voor het verwarmen van de TLC-plaat.Bepaal de relatieve hoeveelheden radiolabel die door de cellen worden opgenomen voordat u ze op de TLC-plaat laadt. Reconstitueren van de monsterlipiden in 40 tot 50 microliter chloroform en methanol gemengd in een één-op-één verhouding door vortexen gedurende vijf minuten. Bereid 101 milliliter van het mobiele fase-oplosmiddel in een glazen gegradueerde cilinder.Giet vervolgens het oplosmiddel in een glazen TLC-kamer met een 20 bij 20 TLC verzadigingskussen en een nauwsluitend deksel. Bereid een gekanaliseerde 20 bij 20 silicagel 60G plaat voor en markeer een lijn 1,5 centimeter boven de bodem van de plaat met een potlood. Zodra de plaat voldoende is verwarmd en het TLC-verzadigingskussen verzadigd is met oplosmiddel, verwijdert u de TLC-plaat uit de oven en gaat u onmiddellijk verder met het laden ervan.Plaats met behulp van een pipet vijf microliters monster op de oorsprong van elke rijstrook die zich 1,5 centimeter boven de bodem van de TLC-plaat bevindt en herhaal de belasting totdat in elke rijstrook 20 tot 40 microliter monster is geladen. Zodra de standaard en de monsters zijn geladen, plaatst u de plaat in de ontwikkelkamer en wacht u tot het oplosmiddel de bovenkant van de plaat heeft bereikt. Wanneer de plaat volledig is ontwikkeld, verwijdert u deze uit de kamer en laat u deze 20 minuten drogen in de zuurkast.Nadat de plaat is gedroogd, bedek je deze met plastic folie en plaats je deze in een ontwikkelende cassette met een autoradiografiescherm. Verwijder het scherm van de zich ontwikkelende cassette en plaats het in een fosforbeeld. Besproei de TLC-plaat met p-Anisaldehyde-reagens totdat het silica verzadigd is en bak het vervolgens vijf minuten in een oven van 145 graden of totdat er banden zijn verschenen.Om lipidesoorten te kwantificeren, schraapt u de silicagel die individuele lipidesoorten bevat en draagt u deze over naar glazen scintillatieflacons. Voeg zes milliliter scintillatievloeistof en vortex krachtig toe totdat de silicaband tot kleine stukjes is gereduceerd. Plaats het rek met de scintillatiefons in een scintillatieteller en tel door de teltijd aan te passen aan twee minuten per flacon.Fosfor beeldvorming maakt visualisatie van autoradiogram van label-vrij vetzuur, triacylglycerol, diacylglycerol, cholesterol en squalaan mogelijk. Er werd aangetoond dat gezuiverde lipidensoorten in deze methode kunnen worden gescheiden en vervolgens kunnen worden gevisualiseerd door de TLC-plaat te besproeien met p-Anisaldehydereagens. Gevisualiseerde soorten omvatten alle eerder genoemde lipiden naast steriele esters.Door het toepassen van een 10 minuten chase periode in radiolabel-vrije media na de pols, werd het waargenomen bij de grote pool van squalaan verdwenen en totale cholesterol werd verhoogd. Evenzo correleerde het verschijnen van diacylglycerol in de achtervolgingsperiode met een afname van het signaal van vrije vetzuren. Voorafgaand aan het uitvoeren van het volledige protocol, is het belangrijk om te bepalen of de cellen het azijnzuur radiolabel zullen opnemen in de groeiconditie en genetische achtergrond van belang.

analysis-neutral-lipid-synthesis-saccharomyces-cerevisiae-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Beschrijven we een nieuwe kwantitatieve lipidomics methode voor het identificeren van een groot aantal soorten lipiden in gist met behulp van survey-scan electrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI / MS). Deze methode dan op dit moment beschikbare methoden voor lipide identificatie en kwantificering in de mogelijkheid om verschillende moleculaire vormen van lipiden, gevoeligheid en snelheid op te lossen.

Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

13 C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.

Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Hier beschrijven we een protocol om te verkrijgen van de lipide druppel index (LD index) om te bestuderen van de dynamiek van triacylglycerolen in cellen gekweekt in high-throughput experimenten. De LD index bepaling is een gemakkelijke en betrouwbare methode die gebruikmaakt van BODIPY 493/503. Deze test hoeft niet dispendious lipide extractie of microscopie analyse.

Lipide Index bepaling door vloeibare fluorescentie herstel in de schimmel pathogeen Ustilago Maydis

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Leer hoe je neutrale lipiden kwantificeert in Saccharomyces cerevisiae via metabole etikettering met 14C-azijnzuur en dunne laagchromatografie. Deze methode analyseert lipidenmetabolisme in diverse genetische achtergronden.

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Meer video's verkennen