Productie van membraangefilterde faseverschuivingsdecafluorbutaan nanodruppels uit voorgevormde microbubbels

Dit protocol is een eenvoudige methode om polydispersiteit van verdampbare druppels met een laag kookpunt te verminderen voor gebruik in biomedische toepassingen. Deze techniek condenseert voorgevormde gasmicrobubbels en filtert de resulterende vloeistofdruppels op grootte op een manier die controleerbaar, schaalbaar en relatief kosteneffectief is. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan lipide microbubbels met verschillende schaal- en gasmateriaal met behulp van verschillende filters om de uiteindelijke druppelgrootte te regelen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Darrah Merillat, een niet-gegradueerde onderzoeker uit het laboratorium van Dr. Sirsi. Schakel de aan/uit-schakelaar voor de sonicator in en stel de amplitude in op het maximaal toegestane met behulp van de microtipbevestiging en zorg ervoor dat de ultrasoonapparaattijd is ingesteld op 10 seconden. Plaats de warme gehydrateerde lipide-oplossing in de geluidsbehuizing met de microtip net onder het oppervlak.

Bevestig een geschikte lengte van de slang aan de hals van de injectieflacon om het gas uit de DFB-tankuitlaat naar de warme lipide-oplossing in de behuizing te leiden. Open de tankklep langzaam totdat het gas over de lipide-oplossing kan stromen, waardoor lichte rimpelingen op het oppervlak van de vloeistof ontstaan. Als de gasstroom te hoog is, zal de oplossing overlopen tijdens de vorming van microbubbels.

Start de sonicator en laat deze 10 seconden continu draaien om microbubbels te genereren. Nadat de ultrasoonapparaat is voltooid, sluit u onmiddellijk de DFB-tankklep. Sluit de microbubbeloplossing snel af en dompel de injectieflacon onder in een ijsbad om het monster af te koelen tot onder de 55 graden Celsius.

Gebruik een keramisch filter van 200 nanometer om de hogedrukextruder volgens de gebruikershandleiding te monteren en plaats deze in het midden van een waterdichte container, zodat de uitlaatbuis van het monster niet tegen de zijkant wordt gedrukt of gekrompen. Koppel de extruder aan de stikstofgastank met behulp van de adapter die door de fabrikant is geleverd. Plaats het uiteinde van de uitlaatbuis in een scintillatieflacon om het geëxtrudeerde monster te verzamelen en bevestig de buis met tape aan de container om in de injectieflacon te blijven.

Open en sluit de uitlaatklep om ervoor te zorgen dat er geen druk in de extruder is. Verwijder het deksel van de kamer. En voeg vijf milliliter PBS toe aan de extruderkamer.

Plaats het deksel terug en zorg ervoor dat het goed terug op zijn plaats klikt. Open de stikstofgastank, zodat de manometer 250 PSI aangeeft en zorg ervoor dat de drukregelklep in de gesloten stand staat. Sluit de gastank en open de inlaatklep van de extruderkamer, waardoor de PBS-oplossing door het systeem wordt geduwd en de monsteruitlaatbuis in de scintillatieflacon wordt geduwd.

Wanneer alleen gas de slang verlaat, opent u de uitlaatklep en laat u de druk dalen tot nul PSI. Verwijder vervolgens de injectieflacon met scintillatie. Open en sluit de uitlaatklep om er zeker van te zijn dat er geen druk in de extruder is en plaats een nieuwe scintillatieflacon aan het einde van de uitlaatbuis.

Vul een stalen container met 2-methylbutaan en voeg droogijs toe om de temperatuur terug te brengen tot min 18 graden Celsius. Breng de microbubbeloplossing in het gekoelde 2-methylbutaan en dompel het monster gedurende twee minuten onder. Beweeg de scintillatieflacon gedurende de twee minuten om de bubbels voorzichtig te mengen.

Voeg indien nodig droogijs toe om de temperatuur tussen min 15 en min 18 graden Celsius te houden. Verwijder na twee minuten de microbubbels uit het gekoelde 2-methylbutaan. Draai de injectieflacon voorzichtig om de microbubbels te mengen en breng de bubbels over in een gekoelde spuit van 10 milliliter.

Verwijder het deksel van de extruderkamer en voeg de microbubbeloplossing toe aan de kamer door de zuiger langzaam op de spuit te duwen. Vervang de extruderdop en zorg ervoor dat deze goed op zijn plaats klikt. Controleer of de drukregelklep en de uitlaatklep van de extruder zich in de gesloten stand bevinden.

Open de stikstofgastank totdat de manometer 250 PSI aangeeft. Sluit de gastank en draai de drukregelklep in de open stand. Wanneer de oplossing de scintillatieflacon bij de uitgangsslang heeft gevuld en alleen gas de buis verlaat, opent u langzaam de drukafsluiter en laat u de druk dalen tot nul PSI.

Breng 10 milliliter van de geëxtrudeerde druppeloplossing over in een centrifugebuis van 15 milliliter. Centrifugeer het geëxtrudeerde monster op 1,500 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het bovennatuurlijke en de spontaan verdampte druppels die aan de bovenkant van de oplossing verschijnen weg.

Suspensie van de pellet bestaande uit DFP-nanodruppels in 10 milliliter PBS met 20% glycerol en 20% propyleenglycol. De grootteverdeling van gecondenseerde bellenoplossingen met en zonder extrusie laat zien dat het gecondenseerde monster een veel bredere distributie heeft gecentreerd in de buurt van 400 nanometer, terwijl het geëxtrudeerde monster een smallere distributie heeft gecentreerd op 200 nanometer. Afstembare weerstandspulsdetectieanalyse die wordt gebruikt om faseverschuivingsdruppels te analyseren terwijl ze zijn gewassen door centrifugatie om overtollige liposomen te verwijderen, toont aan dat de druppelgroottes in de buurt van 200 nanometer liggen.

De microscopiegegevens van nanodruppelverdamping bij verhitting laten zien dat sommige spontaan verdampte microbubbels zichtbaar zijn in het gezichtsveld vóór verwarming, en een groter aantal gasmicrobubbels worden waargenomen na verwarming. De microscopiebeelden van nanodruppels die direct zonder voorkoeling in de extruder zijn ingebracht, gecondenseerd bij nul graden Celsius en bij min 18 graden Celsius worden hier weergegeven. Representatieve beelden van gecondenseerde octafluorpropaandruppels voor en na verdamping tonen ook een groter aantal gasmicrobubbels na verhitting, vergelijkbaar met de DFB-druppels.

Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat de druppelopbrengst sterk afhankelijk is van de temperatuur en druk tijdens condensatie, en kleine variaties zullen de resultaten beïnvloeden. Na het genereren van verdampbare druppels, kunnen ze worden gebruikt om in vivo beeldvorming en medicijnafgifte te optimaliseren met behulp van echografie, evenals andere in vivo en ex vivo toepassingen. Na de ontwikkeling van deze techniek zijn de effecten van nanodruppelgrootte en gaskerninhoud op in vivo verdampingsdrempels onderzocht met behulp van kleine wijzigingen in dit protocol.