Generatie en uitbreiding van menselijke cardiomyocyten uit mononucleaire bloedcellen van de patiënt

Dit zijn uitgebreide protocolfaciliteiten, ruwe stimuleert de generatie en het gebruik van pouncing van patiëntspecifieke culturen uit perifere mononucleaire bloedcellen. Deze tactiek is reproduceerbaar en gemakkelijk te volgen, speciaal voor beginners. En niet nodig, speciaal expertiseren in stamcel ballads, of cardiovasculaire geneeskunde.

Ons protocol kan worden gebruikt om patiëntspecifieke cardiomyocyten te genereren uit een enkele bloedafname die kan worden gebruikt voor het modelleren van hart- en vaatziekten en het testen van de cardiale toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Dit protocol vereist een lange tijd inzet voor het behoud van stamcelherprogrammering en gerichte differentiatie. Je waardeert je inspanningen echter echt.

Wanneer je kloppende cardiomyocyten in het gerecht ziet. Wanneer de menselijke iPSC-kolonies meer dan 90% confluentie bereiken, spoelt u elke put met drie milliliter DPBS voordat u de cellen behandelt met één milliliter van 0,5 millimolaire EDTA in DPBS per put bij 37 graden Celsius. Voeg na vijf tot acht minuten een milliliter iPSC-passageermedium toe aan elke put en maak de cellen handmatig los.

Breng 600 tot 900 microliter van de cellen over naar individuele Putten hebben een keldermembraan gecoat met zes putplaten voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verfris vervolgens de culturen met twee milliliter compleet E8-medium elke dag gedurende drie tot vier dagen. Wanneer de cultuur samenvloeiing heeft bereikt, vervangt u het medium door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatiemedium, twee per put.

Vervang op dag twee de supernatanten door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium één. Vervang op dag drie de supernatanten door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatiemedium drie. Op dag vijf.

Vervang het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium één. Vervang op dag zeven tot en met 10 het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium vier. Op dag 11 en 13.

Wanneer samentrekkende cellen worden waargenomen, vervangt u het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatiemedium vijf. Op dag 15, 17, 19 en 21. Vervang het supernatant door twee milliliter cardiomyocytendifferentiatie medium vier.

Na prekweek met volledig bloedmedium per zeven dagen worden PBMC's groot met zichtbare kernen en cytoplasma die aangeven dat ze klaar zijn voor transfectie met Sendai Virus herprogrammeringsfactoren. Bij introductie tot complete E8 medium. De volledig geherprogrammeerde cellen zullen zich hechten en kolonies gaan vormen.

Na vier tot vijf passages zullen zeer zuivere iPSC-kolonies zich vormen uit de geherprogrammeerde cellen met zeer weinig gedifferentieerde cellen waargenomen. In dit stadium zijn de meeste cellen OCT4- en NANOG-positief indicatief voor hun pluripotentie. Kloppende cardiomyocyten worden meestal waargenomen na 12 dagen differentiatie.

Na glucose-uithongering en het afstoten van iPSC vertonen cardiomyocyten, spontane slagen en een uitgelijnde sarcomeerstructuur met geïncaleerde cardiale troponine T- en alfa-actinine-expressie. De kolonies behouden hun zuiverheid zoals blijkt uit hun Troponin T-expressie. Hoewel iPSC-cardiomyocyten relatief onvolgroeid zijn in vergelijking met volwassen cardiomyocyten.

Ze demonstreren ventriculaire en atriale achtige actiepotentialen zoals gemeten door groothandel patch, klem. Ventriculaire cardiomyocyten drukken myosine lichte keten twee uit, terwijl atriale iPSC-cardiomyocyten worden gekenmerkt door NR2F2-expressie. Wnt-activering stimuleert de celdeling en bevordert de expressie van celcyclusregulatoren.

Interessant is dat Wnt-activering ook de robuuste proliferatie van vroege iPSC-cardiomyocyten induceert voor twee passages in vergelijking met controles, hoewel dit proliferatieve vermogen in de loop van de tijd afneemt. Zorg ervoor dat de PBMS worden vergroot met het heldere nucleaire en cytoplasma voordat de iPSC-herprogrammeringsvectoren worden geïntroduceerd, aangezien de toestand van de PBM's van cruciaal belang is voor iPSC-herprogrammering. Patiëntspecifieke cardiomyocyten zijn waardevol voor het modelleren van hart- en vaatziekten in vitro en voor het leveren van een heleboel donorcellen voor hartstamceltherapie.