Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin
3 maart 2021
Kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin wordt uitgevoerd met behulp van een workflow met speciale samengestelde bibliotheken, tools voor kristalverwerking, snelle faciliteiten voor het verzamelen van gegevens en grotendeels geautomatiseerde gegevensanalyse. Het gepresenteerde protocol is bedoeld om de output van dergelijke experimenten te maximaliseren om veelbelovende uitgangspunten te bieden voor downstream structuurgebaseerd ligandontwerp.
De screening van kleinere organische verbindingen genaamd fragmenten met behulp van röntgenkristallografie is een efficiënte methode voor het identificeren van moleculen die uitgangspunten zijn voor de ontdekking van geneesmiddelen of de ontwikkeling van biochemische gereedschapsverbindingen. Kristallografische fragmentscreening onthulde niet alleen de identiteit, maar ook waar en hoe de fragmenten zich binden aan het oppervlak van het onderzochte eiwit. Deze techniek kan worden gebruikt op elk biochemisch of medisch relevant eiwitdoel waarvoor geschikte eiwitkristallen kunnen worden gekweekt.
De kwaliteit van de resultaten is nauw verbonden met de kwaliteit van de monsterbehandeling. Wij geloven dat de volgende visuele demonstratie onderzoekers zal helpen om experimenten van hoge kwaliteit uit te voeren. Tatjana Barthel, promovenda en promovenda in mijn laboratorium, demonstreert de procedure.
Snijd om te beginnen de zak van de zeefplaat open die is voorverwarmd tot kamertemperatuur en verwijder vervolgens het deksel en de folie van de zeefplaat. Decanteer de vijf milliliter weekoplossing in het reagensreservoir. Vul vervolgens elk van de 96 reservoirs van de plaat met 40 microliter weekoplossing met een 12-kanaals pipet.
Plaats het gemakkelijk toegankelijke frame bovenop de zeefplaat en zet het vast met de meegeleverde klemmen door ze op de linker- en rechterkant van het apparaat te schuiven. Plaats de zeefplaat en het gemakkelijk toegankelijke frame onder de microscoop en schuif de eerste put open door de betreffende acrylglastegel van het frame te verplaatsen. Voeg 0,4 microliter weekoplossing uit het reservoir toe aan het fragment dat goed bevat met behulp van een verse pipetpunt.
Zorg ervoor dat de druppel het opgedroogde fragment bedekt. Plaats de kristallisatieplaat met de grootste kristallen onder de tweede microscoop en snijd de afdichtingsfolie open bij een van de putten. Breng met behulp van een lus van de juiste grootte een kristal over naar de put van de zeefplaat onder de eerste microscoop.
Was de lus in de voorbereide glazen spotplaat en droog deze vervolgens door deze voorzichtig op het weefsel aan te raken. Doe dit na elke overdracht om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik de microscoop om er zeker van te zijn dat het kristal goed geplaatst is.
Herhaal de procedure voor het tweede kristal. Ga verder met de volgende put en herhaal de procedure voor alle resterende putten. Nadat kristallen zijn overgebracht naar alle 96 putten in de zeefplaat, verwijdert u de zeefplaat samen met het gemakkelijk toegankelijke frame onder de microscoop en plaatst u deze op de bank of tafel.
Verwijder vervolgens het easy access frame van de zeefplaat, sluit de zeefplaat af met afdichtingsfolie en plaats deze in de kristallisatie-incubator of kast om te incuberen voor de eerder geoptimaliseerde weektijd. Twee uur incubatie is voldoende, maar 's nachts kan handiger zijn. Bereid het Unipuck-schuim Dewar voor met drie Unipuck-deksels en vul het half met vloeibare stikstof, zodat het op de grond blijft.
Verplaats de halfgevulde Dewar naar de bank en vul hem volledig tot aan de rand. Houd het tijdens het hele experiment tot aan de bovenrand gevuld en vervang de vloeibare stikstof regelmatig. Haal de zeefplaat uit de incubator en verwijder de folie.
Plaats het gemakkelijk toegankelijke frame bovenop. Schuif de eerste put open. Oogst een kristal uit de druppel en flits koel het af in vloeibare stikstof door te plonsen met een snelle verticale beweging.
Plaats het monster in de juiste puckpositie en maak relevante notities op het voorbeeldvolgblad. Herhaal de procedure voor het tweede kristal. Ga naar de volgende put en herhaal de positionering van andere kristallen totdat alle drie de pucks vol zijn.
Koel de Unipuck-basissen voor in vloeibare stikstof en voeg ze toe aan de deksels. Berg de Unipucks op in een opslagrek in een transport dewar of opslag Dewar. Bewaar ze in vloeibare stikstof bij cryogene temperaturen tot de meting.
Herhaal dezelfde procedure voor het oogsten en opslaan van de kristallen in Unipucks voor de resterende monsters in de zeefplaat. De variabiliteit van de kristalmorfologieën na het uitvoeren van het fragment weken en kristal oogsten wordt hier getoond. Zelfs kristallen die er enigszins verslechterd uitzien, werden opgenomen, omdat ze nog steeds resulteren in nuttige gegevens.
Gegevens werden verzameld op de balklijnen 14.1 en 14.2 van de BESSY II synchrotron. Diffractiegegevensverzameling is uitgevoerd voor elk monster. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van FragMAXapp, gericht op de combinatie van XDSAPP voor verwerking, fspipeline voor structuur verfijning en PenDA voor hit finding.
Dit resulteerde in 15 hits op het AR-eiwitcomplex met behulp van een DMSO-vrije weekconditie. In een eerdere campagne van het F2X-instapscherm tegen hetzelfde doel, inclusief DMSO in de wekende toestand, werden 20 hits gevonden. Dit betekent dat 75% van de hits kan worden geïdentificeerd als DMSO wordt weggelaten.
Voor het succes van het experiment is het cruciaal dat de kristallen tijdens elke stap van de procedure goed en zorgvuldig worden behandeld. Kristallografische fragmentscreening is uitgegroeid tot een veelgebruikte techniek, die vaak wordt toegepast in de academische wereld en in de farmaceutische industrie.
Overzicht
Dit artikel bespreekt kristallografische fragmentscreening als methode voor het identificeren van potentiële drugskandidaten via röntgenkristallografie. Het protocol is erop gericht de efficiëntie van experimenten te verhogen door gebruik te maken van geautomatiseerde data-analyse en geoptimaliseerde monsterbehandeling.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Kristallografie
- Geneesmiddelenontdekking
- Biochemie
Achtergrond
- Fragment screening is een techniek die wordt gebruikt om kleine organische verbindingen te identificeren die aan eiwitten kunnen binden.
- De kwaliteit van de resultaten is sterk afhankelijk van de monsterbehandeling en de crystallisatietechnieken.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse biochemisch relevante eiwitdoelen.
- Een juiste behandeling van de kristallen is cruciaal voor een succesvolle gegevensverzameling.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te demonstreren voor crystallografische fragment screening.
- Om inzicht te verschaffen in de bindingskenmerken van fragmenten op eiwitoppervlakken.
- Om de resultaten van experimenten voor structure-based ligand design te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van screeningsplaten met weekoplossingen.
- Overdracht van proteïnekristallen naar screeningwells.
- Incubatie van kristallen onder geoptimaliseerde omstandigheden.
- Gegevensverzameling en analyse met behulp van gespecialiseerde software.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van 15 hits op het AR-proteïnecomplex onder DMSO-vrije omstandigheden.
- Vergelijking met eerdere experimenten toonde aan dat het weglaten van DMSO nog steeds significante hits kan opleveren.
- Aantoonbare variabiliteit in kristalmorfologieën en de impact daarvan op de datakwaliteit.
Conclusies
- Kristallografische fragmentscreening is een waardevolle techniek bij de ontdekking van geneesmiddelen.
- Zorgvuldige behandeling van kristallen is essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens.
- Het protocol kan dienen als leidraad voor onderzoekers in de academische wereld en de industrie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Crystallografische fragment-screening maakt vroege identificatie van ligand-bindingsmodi met atomaire resolutie mogelijk, wat target-validatie en lead-optimalisatie in structuurgebaseerde geneesmiddelenontwikkeling ondersteunt. De workflow die bij HZB wordt gepresenteerd, integreert geautomatiseerde gegevensverwerking en gestandaardiseerde kristalbehandeling om de reproduceerbaarheid en doorvoer bij het vinden van fragment-hits te verbeteren. Deze benadering vermindert mechanistische onzekerheid in de vroege ontdekkingsfase door direct structureel inzicht te verschaffen in fragment-eiwitinteracties, wat go/no-go-beslissingen voor daaropvolgende medicinal-chemische inspanningen onderbouwt.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt directe 3D-visualisatie van fragmentbindingsplaatsen, wat mechanistische risicoreductie van hypothesen over het target mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle screening van fragmentbibliotheken met 96 leden tegen proteïnekristallen om de plasticiteit van de bindingsplaats te onderzoeken.
- Voorspellende waarde: Identificeert fragment hits die dienen als startpunten voor structuurgestuurde optimalisatie van potente binders.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve elektronendichtheidskaarten om de bezettingsgraad van fragmenten en de bindingsconformatie te bevestigen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van robotgestuurde monsterwisseling bij synchrotron-beamlines voor geautomatiseerde gegevensverzameling over honderden kristallen.
- Assay-gereedheid: Maakt gebruik van gestandaardiseerde protocollen voor het weken en flash-koelen om reproduceerbare gegevens van diffractiekwaliteit te garanderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Fragment-hits die via CFS zijn geïdentificeerd, kunnen worden ontwikkeld tot leads met verbeterde farmacologische eigenschappen voor preklinische evaluatie.
- Mechanistische risicoreductie: Structurele gegevens over fragmentbinding informeren de SAR-ontwikkeling en verminderen het risico op uitval tijdens de lead-optimalisatie.
- Preklinische relevantie: Maakt beoordeling van fragment-efficiëntie en ligand-efficiëntie-metrieken mogelijk om chemotypes met een gunstige ontwikkelbaarheid te prioriteren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De CFS-workflow past binnen het vroege stadium van het discovery-continuüm, waarbij targetvalidatie wordt ondersteund door structurele karakterisering en lead-identificatie wordt mogelijk gemaakt via fragment-growing- of linking-strategieën.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetesten door te onthullen waar en hoe kleine moleculen binden aan de eiwitdoelen van belang.
- Screening: Maakt parallelle screening van fragmentbibliotheken mogelijk met behulp van geautomatiseerde kristalverwerking en synchrotron-gebaseerde datacollectie.
- Analytiek: Integreert XDSAPP, fspipeline en PenDA voor geautomatiseerde verwerking, verfijning en hit-identificatie op basis van diffractie-datasets.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt structuurgebaseerd ligandontwerp door bindingsmodi op atomair niveau te leveren voor fragmentoptimalisatie.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerd, herbruikbaar platform voor fragment-screening over meerdere eiwitdoelen in een ontdekkingsportfolio.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-ligandinteracties door direct experimenteel bewijs van de bindingsmodus.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde procedures voor het weken van kristallen, het oogsten en cryobewaring.
- Strategische waarde: Verbetert de hit-to-lead-efficiëntie door fragmenten met gunstige bindingsinteracties te prioriteren voor medicinale chemie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van resultaten uit fragmentscreening en structurele hanteerbaarheid.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in proteïnekristallisatie, het hanteren van kristallen en synchrotron-gebaseerde datacollectie.
- Afhankelijk van toegang tot beamlines met een hoge helderheid en geautomatiseerde monsterwisselaars voor high-throughput screening.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor de preparatie van fragmentbibliotheken, soakingscondities en data-analysepipelines.
- Omvat coördinatie tussen teams van structurele biologie, medicinale chemie en data-analysegroepen.
- Beperkt tot targets waarvoor reproduceerbare, hoogwaardige kristallen kunnen worden verkregen en behouden onder screeningcondities.
