Name: Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Leer een co-cultuursysteem voor het bestuderen van glioblastoommigratie op gepatenteerde neuronen. Deze methode kwantificeert invasief gedrag en definieert een klinische index voor patiëntuitkomsten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole wordt ondersteund door Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon is een ontvanger van fellowship van het Universitair Ziekenhuis Toulouse (CHU Toulouse).

Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten (van het Haukeland Hospital, Bergen, Noorwegen, volgens de voorschriften van de lokale ethische commissie). Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissies voor menselijke en dierlijke onderzoeksethiek van de Universiteit van Bordeaux. Zwangere ratten werden gehuisvest en behandeld in de dierenfaciliteit van de universiteit van Bordeaux. Euthanasie van een E18-getijde drachtige rat werd uitgevoerd met behulp van CO2. Alle dierprocedures zijn uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de lokale ethische commissie. Alle commerciële producten worden genoemd in de tabel met materialen.
1. Voorbereiding van de dia's met patroon
<ol><li>Substraatvoorbereiding voor micropatterning<ol>
<li>Behandel 18 mm ronde glasafdekkingen gedurende 5 minuten door middel van lucht-/plasmaactivering. Plaats de deklips in een gesloten kamer met 100 μL (3-aminopropyl) triethoxysilane gedurende 1 uur in een desiccator.</li>
		<li>Incubeer met 100 mg/ml poly (ethyleenglycol)-succinimidyl valeraat (molecuulgewicht 5.000 (Peg-SVA)) in 10 mM carbonaatbuffer, pH > 8, gedurende 1 uur. Spoel uitgebreid af met ultrapure water en droog onder een chemische kap. OPMERKING: In dit stadium kan het monster in het donker bij 4 °C worden bewaard voor verder gebruik.</li>
		<li>Voeg de foto-initiator, 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchloride (PLPP), toe aan 14,7 mg/ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). OPMERKING: Een geconcentreerde vorm van PLPP, een PLPP-gel, kan ook worden gebruikt. Het resulteert in een kortere ultraviolette (UV) verlichtingstijd die nodig is om de PEG-borstel (100 mJ/mm2) af te zetten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Photoinitiator gel depositie<ol>
<li>Bereid een mengsel van 3 μL PLPP-gel en 50 μL absolute ethanol om zich in het midden van de dia te deponeren. Plaats het monster onder een chemische kap tot volledige verdamping van de absolute ethanol. OPMERKING: In dit stadium kan het monster in het donker bij 4 °C worden bewaard voor verder gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glazen dia micropatterning<ol>
<li>Monteer de afdeklip in een Ludin-kamer en plaats deze op het gemotoriseerde podium van een microscoop die is uitgerust met een automatisch scherpstelsysteem.</li>
		<li>Laad afbeeldingen die overeenkomen met de beoogde micropatterns in de software. Pas deze parameters toe: replicatie 4 x 4 keer, afstand van 200 μm, UV-dosis van 1.000 mJ/mm2. Spoel de PLPP na de automatische UV-verlichtingsvolgorde weg met meerdere PBS-wasbeurten. OPMERKING: Als PLPP-gel is gebruikt, verwijder deze dan door uitgebreide wasbeurten met gedeioneerd water, droog in een stroom van N2en bewaar bij 4 °C.</li>
		<li>Incubeer met lag (50 μg/ml in PBS) gedurende 30 min. Was uitgebreid met PBS. OPMERKING: Een fluorescerende oplossing van gezuiverd groen fluorescerend eiwit (GFP, 10 μg/ml in PBS) kan worden gemengd met lag om de micropatterns te visualiseren door fluorescentiemicroscopie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van neuronen en GBM-cellen voor co-cultuur
<ol><li>Cultuur van embryonale rat hippocampale neuronen<ol>
<li>Ontleed de hippocampus van embryonale (E18) ratten en breng het weefsel over in een Hank's balanced salt solution (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES)/penicilline-streptomycine oplossing in een buis van 15 ml. Verwijder overtollige oplossing zonder de hippocampus te drogen.</li>
		<li>Voeg 5 ml trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) aangevuld met penicilline (10.000 eenheden/ml)/streptomycine (10.000 μg/ml) en 1 mM HEPES toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Was 2x met de HBSS/HEPES/penicilline-streptomycine oplossing en laat het weefsel 2-3 minuten in deze oplossing blijven.</li>
		<li>Dissocieer het weefsel met behulp van twee vlamgepolijste Pasteur-pipetten, door 10x op en neer te pipetten met elk weefsel, waarbij u ervoor zorgt dat schuimvorming tot een minimum wordt beperkt. Tel de cellen en evalueer de levensvatbaarheid van de celsuspensie. Plaat de neuronen op micropatterned coverslips zoals hieronder aangegeven. OPMERKING: Cel levensvatbaarheid is 85-90% na extractie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Celkweek voor neuronen op micropatterned coverslips<ol>
<li>Rehydrateer micropatterned glazen dia's met PBS en incubeer het volledige neuronale celkweekmedium.</li>
		<li>Zaai de hippocampale neuronen verkregen uit E18 Sprague-Dawley ratten direct over de micropatterned glas coverslip met een dichtheid van 50.000 cellen per cm2 in neurobasaal medium (NBM) verrijkt met 3% paardenserum. Plaats de micropatterned neuronen in de incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 48 uur. OPMERKING: Na ~ 6 uur kunnen primaire hippocampale neuronen worden gezien die zich aan de lamininemicropatterns houden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Co-cultuur van menselijke GBM-stamcellen op neuronen OPMERKING: Voor deze studie werden membraan GFP-positieve en nucleaire-tomaat patiënt-afgeleide GBM cellen gekweekt volgens eerder gepubliceerde protocollen10.<ol>
<li>Terwijl de bolvormige cellen in suspensie groeien, centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 200 × g. Was de sferoïden met 5 ml PBS en incubeer de cellen met 0,5 ml van het celdissociatiereagens (zie de tabel met materialen)gedurende 5 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Voeg 4,5 ml volledige NBM toe (aangevuld met B27-supplement, heparine, fibroblastgroeifactor 2, penicilline en streptomycine, zoals eerder beschreven8), en tel de cellen met behulp van een automatische teltechniek.</li>
		<li>Zaai 1.000 GBM-cellen over de micropatterned neuronale cultuur in NBM verrijkt met 3% paardenserum. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2en 95% vochtigheid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Live celbeeldvorming
<ol><li>Plaats het monster onmiddellijk na het zaaien van GBM-cellen op het podium van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een thermostaatkamer. Voer live-cell imaging uit op de microscoop uitgerust met een gemotoriseerd podium voor het opnemen van meerdere posities met behulp van een multidimensionale acquisitietoolbox in de software. Verkrijg elke 5 minuten brightfield- en epifluorescentie GFP/Tomato-beelden gedurende 12 uur met een doelstelling van 20x in een temperatuur (37 °C) en een gasgestuurde (5% CO2)omgeving.</li>
</ol>4. Beeldanalyse
OPMERKING: Met fiji werden tweedimensionale (2D) beeldstapels semi-automatisch voorbewerkt of verwerkt met behulp van een zelfgemaakte en gebruiksvriendelijke tool (beschikbaar op dit adres: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), die is geschreven in IJ1-macrotaal (Figuur 2A). De geautomatiseerde workflow en procedures zijn samengevat in figuur 2B.
<ol><li>Neuronale netwerkanalyse (Figuur 2Bi)<ol>
<li>Selecteer één afbeelding van de stapel. Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Netwerk om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en de instellingen aan te passen (bijv. Threshold = Triangle, Li, Huang..., Gaussian Bluren Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.</li>
		<li>Klik met de linkermuisknop op de tool Netwerk om automatisch de volgende procedure te activeren.<ol>
<li>Dupliceer de geselecteerde afbeelding en splits deze op in drie kleurkanalen (Rood-Grijs-Groen).</li>
			<li>Selecteer het grijze kanaal (brightfield) en voer contrast stretch enhancement (CSE) uit om de scheiding tussen verschillende gebieden te verbeteren. Gebruik de Sobel edge detector (SED) om de 2D signaalverwerkingsconvolutie bewerking uit te voeren die al is gegroepeerd onder de opdracht Find Edge.</li>
			<li>Voor dubbelfilteren (F) past u een Gaussiaans vervagings- en mediaanfilter toe om ruis te verminderen en het objectsignaal vloeiend te maken. Converteer naar masker (CM) door aangepaste drempelalgoritmen uit te voeren om een binair beeld (BIN-grijs) te verkrijgen met zwarte pixels (celgebied) en witte pixels (achtergrond). Skeletoniseer (Sk) het celgebied in een eenvoudig netwerk (NET) en filter deeltjes (EP) in een NET-afbeelding door kleine deeltjes zonder netwerk te verwijderen.</li>
			<li>Voer voor rode en groene kanalen (kern en membraan) dubbelfilteringuit, converteer naar masker met behulp van de aangepaste drempelmethode en laat BIN-groen celmorfologie bepalen met de opdracht Deeltjes analyseren.</li>
			<li>Voeg alle kanalen samen met hun regio van belang (ROI) met de OPERATOR OR (combineren) en pas hun oorspronkelijke kleur aan in een eenvoudige RGB-afbeelding.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Eencellige motiliteitsanalyse (Figuur 2Bii)<ol>
<li>Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Single Cell Tracking om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en pas de instellingen aan (bijv. Trailtype = Nucleus of Membraan, Threshold = Triangle, Li, Huang..., Z-projectie = Max intensity, Sum Slices..., Gaussian Blur en Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.</li>
		<li>Klik met de linkermuisknop op het hulpprogramma Voor het volgen van één cel om automatisch de volgende procedure te activeren.<ol>
<li>Verwijder het grijze kanaal. Pas een Z-projectie toe op de stapel, die een afbeelding genereert die overeenkomt met een afbeeldingsstapel op basis van de tijd (T-stack). Dubbelfilteren en converteren naar Maskeren van de paden die door cellen zijn achtergelaten. Verwijder kleine deeltjes in de BIN-rood/groene afbeelding.</li>
			<li>Door ROI te gebruiken, selecteert u elke contour van de celtracering en schakelt u het selectievakje Randdetectie overslaan in het dialoogvenster Opties in om deze voorverwerkingsstap over te slaan voor volgende stappen.</li>
			<li>
Isoleer het rode kanaal(Trail type = Nucleus) op de originele stack. Selecteer één ROI en verwijder het buitengebied. Filter alle afbeeldingen dubbel en converteer naar masker (BIN-rood). Bepaal de centroide X/Y-positie van elke binariseerde kern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereken met behulp van een reeds gepubliceerde macro voor spreadsheetsoftware13de gemiddelde vierkante verplaatsing, directionaliteitsverhouding en gemiddelde snelheid voor deze cel.</li>
	</ol></li>
	<li>Meercellige trackinganalyse (Figuur 2Biii)<ol>
<li>Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Bijhouden om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en de instellingen aan te passen (bijv. Threshold = Triangle, Li, Huang..., Gaussian Blur en Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.</li>
		<li>Klik met de linkermuisknop op de trackingtool om automatisch de volgende procedure te activeren.<ol>
<li>Verwijder het grijze kanaal.</li>
			<li>
Splits de rode en groene kanalen, dubbelfilteren converteer naar Masker.</li>
			<li>Voeg de kanalen samen met Image Calculator... met de AND-operator, waardoor alleen het kernsignaal in de membranen achterblijft. OPMERKING: Verschillende plug-ins in Fiji kunnen worden gebruikt om de X/Y-positie van meerdere cellen in deze binaire voorbewerkte afbeelding tegelijkertijd te bepalen (zie de tabel met materialen).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereken met behulp van een eerder beschreven macro13het trajectplot, de gemiddelde vierkante verplaatsing, de richtingsverhouding en de gemiddelde snelheid voor deze cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sferoïde migratie op de neurale mat (Figuur 2Biv)<ol>
<li>Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Migratie om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en de instellingen aan te passen (bijv. Threshold = Triangle, Li, Huang..., Gaussian Blur en Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.</li>
		<li>Klik met de linkermuisknop op de migratietool om automatisch de volgende procedure te activeren.<ol>
<li>Verwijder het rode kanaal.</li>
			<li>
Splits de groene en grijze kanalen.</li>
			<li>Teken voor het grijze kanaal handmatig de contour van de neuronale mat en meet het gebied.</li>
			<li>Voor het groene kanaal filtert u de stapel dubbel en converteert u naar Masker. Verwijder het gebied buiten het patroon (BIN) en bepaal het binarized celgebied voor elke afbeelding. OPMERKING: De hierboven beschreven parameters worden gekalibreerd door hun waarden te wijzigen door met de linkerklik op het pictogram van belang te klikken. Deze verwerking kan handmatig worden uitgevoerd. Voor een groot aantal afbeeldingen (ongeveer honderd per acquisitie), kanalen (over het algemeen 3 kanalen) en verwerkingsstappen verdient een geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde tool echter de voorkeur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li>
<li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li>
<li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2FCXCR4+expression+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li>
<li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li>
<li>Boyé, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li>
<li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li>
<li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiprotein+Printing+by+Light%3FInduced+Molecular+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li>
<li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li>
<li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li>
<li>Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li>
<li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Glioblastomen dringen het parenchym uitgebreid binnen door verschillende modi te gebruiken: co-optie van omliggende bloedvaten, interstitiële invasie of invasie op WMTs18. Deze laatste modus wordt niet goed gekarakteriseerd in de literatuur vanwege de moeilijkheid om geschikte in vitro of in vivo modellen te vinden met betrekking tot WMT-invasie. Hier is een vereenvoudigd model voorgesteld waarin gekweekte knaagdierneuronen werden gevormd op met lag bedekte oppervlakken en fluore...

Primaire kwaadaardige gliomen, waaronder GBM's, zijn verwoestende tumoren, met een gemiddelde overlevingskans van 12 tot 15 maanden gerapporteerd voor GBM-patiënten. De huidige therapie is gebaseerd op grote tumormassaresectie en chemotherapie in combinatie met radiotherapie, die de overlevingskans slechts met enkele maanden verlengt. Therapeutische mislukkingen zijn nauw verbonden met slechte medicijnafgifte over de bloed - hersenbarrière (BBB) en met invasieve groei in perivasculaire ruimten, hersenvliezen en langsMGT's 1. Perivasculaire invasie, ook wel vasculaire co-optie genoemd, is een goed bestudeerd proces en de moleculaire mechanismen beginnen te worden opgehelderd; het proces van GBM-celinvasie langs MVW's is echter niet goed begrepen. Tumorcellen migreren naar de gezonde hersenen langs de secundaire structuren van Scherer2. Bijna een eeuw geleden beschreef Hans-Joachim Scherer de invasieve routes van GBM, die nu worden aangeduid als perineuronale satellitose, perivasculaire satellitose, subpiale verspreiding en invasie langs de WMT (figuur 1A).
Sommige chemokinen en hun receptoren, zoals stromale cel-afgeleide factor-1α (SDF1α) en C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4), maar niet vasculaire endotheel groeifactor (VEGF), lijken betrokken te zijn bij WMT invasie3. Meer recentelijk is aangetoond dat een transcellulaire NOTCH1-SOX2-as een belangrijke route is in WMT-invasie van GBM-cellen4. De auteurs beschreven hoe GBM-stamachtige cellen het hersenparenchym binnendringen op gedeeltelijk ongemyelineeerde neuronen, wat wijst op de vernietiging van myelinescheden door GBM-cellen. Een mijlpaal werd bereikt in 2019 toen drie artikelenconsecutief werden gepubliceerd in het tijdschrift Nature , waarin de rol van elektrische activiteit in de ontwikkeling van glioom werd onderstreept5,6. Baanbrekend werk van Monje en medewerkers werpt licht op de centrale rol van elektrische activiteit in de afscheiding van neuroligine-3, die de ontwikkeling van glioom bevordert.
Winkler en medewerkers beschreven dat verbindingen tussen GBM-cellen (microtubes) cruciaal zijn in invasieve stappen, en de laatste tijd interacties tussen GBM-cellen en neuronen via nieuw beschreven neuroglioomsynapsen. Die structuren bevorderen glutamatergische stimulatie van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropioninezuur (AMPA) receptoren gelegen op het GBM celmembraan, die tumorontwikkeling en invasie bevordert. Tumorcelinvasie is een centraal proces in de verspreiding van uitzaaiingen of verre secundaire foci, zoals waargenomen bij GBM-patiënten. Verschillende factoren zijn geïdentificeerd om belangrijk te zijn in GBM invasie zoals trombospondin-1, een transformerende groeifactor bèta (TGFβ-gereguleerd matricellulair eiwit, of de chemokine receptor CXCR3)7,8.
Hier is een vereenvoudigd biomimetisch model beschreven voor het bestuderen van GBM-invasie, waarbij neuronen worden gevormd op sporen van lagmijn en GBM-cellen erop worden gezaaid, als enkele cellen of als sferoïden (Figuur 1B). De twee experimentele instellingen zijn gericht op het samenvatten van invasie op neuronen, die wordt waargenomen in GBM9,10,11. Dergelijke modellen zijn in het verleden ontwikkeld als uitgelijnde nanovezelbiomaterialen (core-shell electrospinning) die het bestuderen van celmigratie mogelijk maken door mechanische of chemische eigenschappen te moduleren12. Het co-cultuurmodel dat in dit artikel wordt beschreven, maakt een beter begrip mogelijk van hoe GBM-cellen ontsnappen op neuronen door nieuwe moleculaire paden te definiëren die bij dit proces betrokken zijn.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropyl) triethoxysilaan</td><td>Sigma</td><td>440140-100ML</td><td>De aminogroep is nuttig voor de bioconjugatie van mPEG-SVA</td></tr><tr><td>96-well ronde bodemplaat</td><td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>Wordt gebruikt voor het bereiden van sferoïden</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Opgeslagen bij -20 °C (langdurig) of 4 °C (kortdurend), enzym voor sferoïde dissociatie</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Opgeslagen bij -20 °C, ontdooi voor gebruik</td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Opgeslagen bij -20 °C, ontdooi voor gebruik</td></tr><tr><td>Countess Celtelling Kamer Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Wordt gebruikt voor celtelling</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>Celkweek substraat</td></tr><tr><td>Desiccator cartridges</td><td>Sigma</td><td>Z363456-6EA</td><td>Wordt gebruikt om vocht te verminderen tijdens (3-aminopropyl) triethoxysilaan behandeling</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Opgeslagen bij 4 °C</td></tr><tr><td>Fiji software, MTrack2 macro</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Wordt gebruikt om foto's te analyseren</td></tr><tr><td>Kolf 75 cm²</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparine natrium</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>Opgeslagen bij 4 °C</td></tr><tr><td>Laminine</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>Beschikbaar voor neuronale adhesie</td></tr><tr><td>Leonardo software</td><td></td><td></td><td>laden van beoogde micropatronen</td></tr><tr><td>MetaMorph Software</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA</td><td>Microscopie automatiseringssoftware</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Verdund in NBM voor een uiteindelijke concentratie van 2%</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Opgeslagen bij 4 °C</td></tr><tr><td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td><td></td><td></td><td>Inverteer microscoop uitgerust met een gemotoriseerde stage</td></tr><tr><td>Penicilline - Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Opgeslagen bij 4 °C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveole</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>Foto-initiator gebruikt om de PEG borstel te degraderen</td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol)-Succinimidyl Valeraat (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>Wordt gebruikt als een anti-fouling coating</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>Digitaal microspiegel apparaat (DMD) gebaseerde UV projectie apparaat</td></tr><tr><td>Trypan blauw 0,4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Wordt gebruikt voor celtelling</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td>Wordt gebruikt om aanhechtende cellen los te maken</td></tr></tbody></table>

co-cultuur van glioblastoom stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glioblastomen (GBM's), graad IV kwaadaardige gliomen, zijn een van de dodelijkste soorten menselijke kanker vanwege hun agressieve kenmerken. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de genetica van deze tumoren, is hoe GBM-cellen het gezonde hersenparenchym binnendringen niet goed begrepen. Met name is aangetoond dat GBM-cellen via verschillende routes de peritumorale ruimte binnendringen; het belangrijkste belang van dit document is de route langs witte stof traktaten (WMT's). De interacties van tumorcellen met de peritumorale zenuwcelcomponenten worden niet goed gekarakteriseerd. Hierin is een methode beschreven die de impact van neuronen op GBM-celinvasie evalueert. Dit artikel presenteert een geavanceerde co-cultuur in vitro assay die WMT invasie nabootst door de migratie van GBM stam-achtige cellen op neuronen te analyseren. Het gedrag van GBM-cellen in aanwezigheid van neuronen wordt gemonitord met behulp van een geautomatiseerde trackingprocedure met open-source en free-access software. Deze methode is nuttig voor veel toepassingen, met name voor functionele en mechanistische studies en voor het analyseren van de effecten van farmacologische middelen die GBM-celmigratie op neuronen kunnen blokkeren.

Neuronen met patronen die samen met fluorescerende GBM-cellen werden gekweekt, werden voorbereid zoals beschreven in de protocolsectie en er werden trackingexperimenten uitgevoerd. GBM-cellen veranderden snel hun vorm tijdens het migreren op de neuronen (Figuur 1B: paneel 6 en Video 1). Cellen migreerden langs de neuronale extensies, in een willekeurige beweging (Video 1). Fluorescerende GBM-cellen en niet-fluorescerende neuronen kunnen gema...

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Glioblastomen zijn verwoestende hersentumoren met een hoog invasief profiel. Dit co-kweeksysteem bootst de migratie van glioblastoomcellen op neuronen na om een van de invasieve routes die bij patiënten worden waargenomen, samen te vatten. De geometrie en samenstelling van ons co-cultuurmodel wordt nauwkeurig gecontroleerd.Het vergemakkelijkt een betere reproduceerbaarheid en ook een eenvoudige kwantificering van complexe biologische processen. Deze methode kan worden aangepast aan de klinische diagnose door vers gedissocieerde glioblastoomcellen en neuronen te co-cultiveren. Het definieert een klinische index, die erg belangrijk is als klinische uitkomst.Onze methode kan ook worden gebruikt om andere migrerende cellen te kwantificeren, zoals fibroblasten of immuuncellen. Joris Guyon, een promovendus uit mijn team, demonstreert de procedure. Om een substraat voor de micropatterning te maken, behandelt u 18 millimeter ronde glasafdekkingslips gedurende vijf minuten door de lucht of plasmaactivering voordat u de afdeklips gedurende een uur in een desiccator met 100 microliter triethoxysilane plaatst en vervolgens een oplossing van PEG-SVA incubeert met 100 milligram per milliliter ge

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

This video describes a co-culture assay of glioblastoma cells on micropatterned neurons, which mimic the myelinated neuronal tracts invasion by the glioblastoma stem-like cells as they migrate on neurons in the peritumoral spaces. This assay can help analyze the effects of pharmacological drugs that inhibit glioblastoma cells' migration on neurons in a glioma.

Co-Culturing Glioblastoma Cells on Patterned Neurons: A Technique to Monitor the Migration of Glioblastoma Cells on Rat Hippocampal Neurons In Vitro

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Huidige ex vivo modellen van glioblastoom (GBM) zijn niet geoptimaliseerd voor fysiologisch relevant onderzoek naar menselijke tumorinval. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en onderhouden van organotypische plakculturen uit vers menselijk GBM-weefsel. Een beschrijving van time-lapse microscopie en kwantitatieve cel migratie analyse technieken wordt verschaft.

Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen

Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

We presenteren een 3D-glioblastoommigratiemodel met behulp van door patiënten afgeleide magnetische gliomasferen, gegenereerd uit nieuw gediagnosticeerde en terugkerende tumoren. Dit platform maakt het mogelijk om patiëntspecifieke migratiedynamiek te visualiseren en de therapeutische effectiviteit te beoordelen. De assay kan na migratie worden gemultiplexed om eiwitlokalisatie en expressiepatronen te evalueren.

Reproducerbare 3D glioblastoom migratietest met magnetische nanodeeltjesgemedieerde sferoidlokalisatie onder hypoxische omstandigheden

Leer een co-cultuursysteem voor het bestuderen van glioblastoommigratie op gepatenteerde neuronen. Deze methode kwantificeert invasief gedrag en definieert een klinische index voor patiëntuitkomsten.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

Meer video's verkennen