Name: Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer de zuivering en uitbreiding van muis-iNKT-cellen voor immunologisch onderzoek. Dit protocol realiseert een 30-voudige expansie binnen twee weken voor in vitro en in vivo studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Paolo Dellabona en Giulia Casorati voor de wetenschappelijke ondersteuning en kritische lezing van het manuscript. We bedanken ook de NIH Tetramer Core Facility voor muis CD1d tetrameer. De studie werd gefinancierd door Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (aan M.F.) en de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek (AIRC) fellowship 2019-22604 (aan G.D.).

De hier beschreven procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (nr. 1048) van het San Raffaele Scientific Institute.
OPMERKING: Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Alle gebruikte reagentia zijn opgenomen in de tabel met materialen.
1. Miltverwerking
<ol><li>Euthanaseer iVα14-Jα18 muizen door inademing van CO2 volgens het institutionele beleid. OPMERKING: iVα14-Jα18-muizen moeten 8 weken oud of ouder zijn. Om afstoting van de cellen door de in vivo overdracht van de cellen te voorkomen, moet u bedenken dat cellen geïsoleerd uit vrouwelijke muizen adoptief kunnen worden overgedragen, zowel bij mannelijke als vrouwelijke ontvangers, terwijl cellen geïsoleerd van mannelijke muizen alleen kunnen worden overgedragen bij mannelijke ontvangers. Voor in vitro experimenten moet geen rekening worden gehouden met genderbias. Meer muizen kunnen worden samengevoegd om meer cellen te verkrijgen.</li>
	<li>Ontleed de milt van de muis en sla deze door een 70 nm celzeef om een eencellige suspensie te verkrijgen in 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetaal runderserum (FBS).</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door inversie en proces met erytrocytenlysisbuffer. Resuspend de celkorrel met 1 ml steriele ACK (ammoniumchloride-kalium) ligbuffer, incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en blok met 5 ml PBS met 2% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. OPMERKING: ACK is in de handel verkrijgbaar; het bestaat uit een oplossing van 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3en 0,1 mM Na2 EDTA(ethyleendiaminetetra-azijnzuur) opgelost in gebidistilleerd H2O, pH 7,2-7,4. Indien zelfgemaakt, steriliseer door filtratie met een filter van 0,22 μm.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door inversie. Resuspend de celkorrel in 3 ml PBS met 2% FBS en verwijder vetresten door pipetteren. Bundel indien nodig de cellen afkomstig van verschillende muizen.</li>
	<li>Tel de cellen en houd 50 μL voor FACS-analyse.</li>
</ol>2. T-celverrijking
OPMERKING: Voor de verrijkingsstappen, werk snel, houd de cellen koud en gebruik oplossingen die 's nachts voorgekoeld zijn bij 4 °C en vervolgens op ijs worden bewaard
<ol><li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Resuspend alle cellen in de juiste hoeveelheid PBS met 2% FBS (500 μL voor 107 cellen) en Fc-blokker (2,5 μL x 107 cellen); incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Was met 1-2 ml MACS-scheidingsbuffer (MB) per 107 cellen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g. OPMERKING: MACS-buffer is in de handel verkrijgbaar. Het bestaat uit PBS pH 7,2, 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA. Indien zelfgemaakt, steriliseer door filtratie met een filter van 0,22 μm.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door inversie en kleur de cellen met CD19-FITC en H2(IA b)-FITC (gebruik 5 μL x 107 cellen in 100 μL MB). Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4-8 °C.</li>
	<li>Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.</li>
	<li>Pipetteer het supernatant volledig en resuspend de celkorrel in 90 μL MB per 107 totale cellen. Voeg 10 μL Anti-FITC MicroBeads toe per 107 cellen in totaal. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4-8 °C.</li>
	<li>Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.</li>
	<li>Pipetteer het supernatant volledig en resuspend tot 1,25 x 108 cel in 500 μL MB.</li>
	<li>Plaats een LD-kolom in het magnetisch veld van de MACS-separator om door te gaan naar de uitputting. Om verstopping te voorkomen, brengt u een voorscheidingsfilter aan op de LD-kolom en spoelt u af met 2 ml MB.</li>
	<li>Wanneer het kolomreservoir leeg is, brengt u de celsuspensie aan op het filter. Verzamel de niet-gelabelde cellen die door de kolom gaan.</li>
	<li>Was 3 keer met 1 ml MB, alleen als het kolomreservoir leeg is. Verzamel het totale effluent, dat wordt verrijkt in T-cellen, en tel de cellen. Houd altijd 50 μL voor FACS-analyse.</li>
</ol>3. iNKT celverrijking
<ol><li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant door inversie.</li>
	<li>Kleur de cellen met CD1d-tetrameer-PE (muis PBS57-CD1d-tetrameer), volgens de antilichaamtitratie in 50 μL MB per 106 cellen. Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten in het donker op ijs. OPMERKING: De procedure kan ook worden uitgevoerd met APC-gelabelde mCD1d-tetrameren en anti-APC-kralen; het dienovereenkomstig aanpassen van de fluorchromen die in de volgende kleuring worden gebruikt. In het huidige protocol gebruikten we muis PBS-57-CD1d-tetrameren geleverd door NIH. αgalactosylceramide (αGal-Cer) is het prototypische antigeen dat wordt herkend door iNKT-cellen; PBS-57 is een analoog van αGal-Cer met verbeterde oplosbaarheid9; de NIH Tetramer Facility levert PBS-57 ligand gecomplexeerd tot CD1d tetrameren. Andere CD1d-dimeren/tetrameren/dextrameren zijn echter in de handel verkrijgbaar en kunnen worden geladen met een lipidisch antigeen als αGal-Cer. We voorzien de mogelijkheid om het protocol aan te passen voor het gebruik ervan.</li>
	<li>Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.</li>
	<li>Pipetteer het supernatant volledig en resuspend de celkorrel in 80 μL MB per 107 totale cellen. Voeg 20 μL Anti-PE MicroBeads toe per 107 totale cellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4-8 °C.</li>
	<li>Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.</li>
	<li>Pipetteer het supernatant volledig en resuspend tot 108 cellen in 500 μL MB. Anders, als cellen groter zijn dan 108,past u het volume dienovereenkomstig aan.</li>
	<li>Plaats volgens het celgetal een LS (tot 108) of MS (tot 107) kolom in het magnetisch veld van de MACS-separator. Spoel de kolom af met MB (3 ml voor LS, 500 μL voor MS).</li>
	<li>Breng de celsuspensie aan op de kolom.</li>
	<li>Verzamel ongelabelde cellen die passeren. Was de kolom 3 keer door de juiste hoeveelheid MB toe te voegen (3 x 3 ml voor LS-kolom, 3 x 500 μL voor MS-kolom) alleen als het kolomreservoir leeg is. Het totale effluent is de negatieve fractie.</li>
	<li>Verwijder de kolom uit het magnetisch veld en plaats deze op een nieuwe opvangbuis.</li>
	<li>Pipetteer MB op de kolom (5 ml voor LS-kolom of 1 ml voor MS-kolom); duw de meegeleverde zuiger in de kolom en spoel de positieve fractie (verrijkt in iNKT-cellen) weg.</li>
	<li>Om de iNKT-celterugwinning verder te verhogen, centrifugeert u de negatieve fractie gedurende 10 minuten bij 300 x g en herhaalt u stap 3.6-3.7 met een nieuwe LS- of MS-kolom. Pool de positieve fracties en bepaal het celgetal. Bewaar 50 μL van zowel positieve als negatieve fracties voor FACS-analyse.</li>
	<li>Controleer de zuiveringsstappen door FACS-analyse. Monsters omvatten: milt ex-vivo, T-cel verrijkte fractie, iNKT positieve fractie en iNKT negatieve fractie. Kleur de cellen met: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC en DAPI. OPMERKING: Het verwachte herstel van één iVα14-Jα18-muis is 2x106 iNKT-cellen .</li>
</ol>4. iNKT cel activering en uitbreiding
<ol><li>Activeer gezuiverde iNKT-cellen met muis T-activator anti-CD3/CD28 magnetische kralen in een verhouding van 1:1.<ol>
<li>Centrifugeer de iNKT-celpositieve fractie bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Breng ondertussen het juiste volume anti-CD3/CD28 magnetische kralen over naar een buis en voeg een gelijk volume PBS, vortex toe gedurende 5 seconden. Plaats de buis gedurende 1 minuut op een magneet en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Verwijder de buis van de magneet en resuspend de gewassen magnetische kralen in het juiste volume van volledige RPMI (RPMI 1640 medium, 10% warmte-geïnactiveerde FCS, 1 mM natriumpyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 10 U / ml penicylline en streptomycine, 50 μM β-Mercaptoethanol) om 5 x 105 iNKT-cellen in 1 ml te hebben. Gebruik deze suspensie om de gecentrifugeerde iNKT-positieve fractie opnieuw te conditioneren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaat 1 ml van de celsuspensie (5 x 105 iNKT-cellen) en anti-CD3/CD28 magnetische kralen in een 48 putplaat met 20 U/ml IL-2 en incubeer bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg na 5 dagen 10 ng/ml IL-7 toe.</li>
	<li>Splits de cellen 1:2 wanneer ze 80-90% confluentie bereiken, voeg altijd 20U / ml IL-2 en 10 ng / ml IL-7 toe. In deze omstandigheden kunnen iNKT-cellen tot 15 dagen worden uitgebreid.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
<li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li>
<li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li>
<li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li>
<li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+CD40%2FFas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
<li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li>
<li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier tonen we een reproduceerbaar en haalbaar protocol om miljoenen kant-en-klare iNKT-cellen te verkrijgen. Vanwege het gebrek aan deze cellen in vivo, was een methode om ze uit te breiden hard nodig. Het protocol dat wij voorstellen vereist noch een bepaalde instrumentatie, noch een groot aantal muizen. We hebben iVα14-Jα18 transgene muizen met opzet gebruikt om het aantal muizen dat nodig is voor de procedure te verminderen.
Een ander succesvol protocol voor iNKT-celuitbreiding van iVα14-Jα...

Invariante Natural killer T-cellen (iNKT-cellen) zijn aangeboren T-lymfocyten die een semi-invariante αβ T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen, gevormd in muizen door een invariante Vα14-Jα18-keten in combinatie met een beperkte set van diverse Vβ-ketens1, die specifiek is voor lipide-antigenen gepresenteerd door het MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d2. iNKT-cellen ondergaan een agonistselectieprogramma dat resulteert in de verwerving van een geactiveerd / aangeboren effectorfenotype al in de thymus, dat optreedt door verschillende rijpingsstadia3,4, waardoor een CD4+ en een CD4- subset ontstaat. Via dit programma verwerven iNKT-cellen verschillende T-helper (TH)effectorfenotypen, namelijk TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) en TH17 (iNKT17), identificeerbaar door de expressie van de transcriptiefactoren T-bet, GATA3, PLZF en RORγt, respectievelijk5. iNKT-cellen herkennen een reeks microbiële lipiden, maar zijn ook zelfreactief tegen endogene lipiden die worden opgereguleerd in de context van pathologische situaties van celstress en weefselschade, zoals kanker en auto-immuniteit2. Na activering moduleren iNKT-cellen de functies van andere aangeboren en adaptieve immuuneffectorcellen via direct contact en cytokineproductie2.
Het onderzoek van iNKT-cellen is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of Jα18-deficiënte muizen, en door de productie van antigeen-geladen CD1d-tetrameren plus de generatie van monoklonale antilichamen (mAbs) specifiek voor de menselijke semi-invariante TCR. Het genereren van primaire muis iNKT-cellijn is echter moeilijk gebleken. Om de antitumorfuncties van iNKT-cellen beter te karakteriseren en te gebruiken voor adoptieve celtherapie, hebben we een protocol opgezet om milt iNKT-cellen van iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg)6te zuiveren en uit te breiden , waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen dan bij muizen van het wilde type.
Geëxpandeerde iNKT-cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro testen en in vivo bij overdracht terug naar muizen. In deze setting hebben we bijvoorbeeld hun krachtige anti-tumor effecten aangetoond7. Bovendien zijn in vitro geëxpandeerde iNKT-cellen vatbaar voor functionele modificatie via genoverdracht of bewerking voorafgaand aan hun injectie in vivo8, waardoor inzichtelijke functionele analyse van moleculaire routes mogelijk is en de weg wordt vrijgemaakt voor geavanceerde celtherapieën.

<table><tbody><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) oplossing</td><td>in huis</td><td></td><td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td></tr><tr><td>anti-FITC Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>anti-PE Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>clone 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetramer -PE</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>mouse PBS57-Cd1d-tetramers</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>100528</td><td>clone RM4-5</td></tr><tr><td>Fc blocker</td><td>BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0186L</td><td>heat-inactivated en gefilterd .22 voor gebruik</td></tr><tr><td>FOXP3 Transcriptiefactor staining buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer (MB)</td><td>in huis</td><td></td><td>0.5% bovijn serumalbumine (BSA; Sigma-Aldrich) en 2Mm EDTA</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline en streptomycine (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Separation Filters (30 &micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis IL-7</td><td>R&amp;D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 met glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>clone H57-597</td></tr><tr><td>&alpha;CD3CD28 muis T activator Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

zuivering en uitbreiding van muisinvariante natural killer t-cellen voor in vitro en in vivo studies

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariante Natural Killer T (iNKT) cellen zijn aangeboren T-lymfocyten die een geconserveerde semi-invariante T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen die specifiek is voor zelf- of microbiële lipide-antigenen gepresenteerd door het niet-polymorfe MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d. Preklinische en klinische studies ondersteunen een rol voor iNKT-cellen bij kanker, auto-immuniteit en infectieziekten. iNKT-cellen zijn zeer geconserveerd in alle soorten en hun onderzoek is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of iNKT-deficiënte muizen, en de mogelijkheid om ze ondubbelzinnig te detecteren bij muizen en mannen met CD1d-tetrameren of mAbs specifiek voor de semi-invariante TCR. iNKT-cellen zijn echter zeldzaam en ze moeten worden uitgebreid om beheersbare aantallen te bereiken voor elke studie. Omdat het genereren van primaire muis iNKT-cellijn in vitro moeilijk is gebleken, hebben we een robuust protocol opgezet om milt iNKT-cellen van de iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg) te zuiveren en uit te breiden, waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen. We laten hier zien dat primaire milt iVα14Tg iNKT-cellen kunnen worden verrijkt door middel van een immunomagnetisch scheidingsproces, wat ongeveer 95-98% pure iNKT-cellen oplevert. De gezuiverde iNKT-cellen worden gestimuleerd door anti-CD3/CD28 kralen plus IL-2 en IL-7, wat resulteert in een 30-voudige expansie op dag +14 van de cultuur met een zuiverheid van 85-99%. De uitgebreide iNKT-cellen kunnen gemakkelijk genetisch worden gemanipuleerd, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanismen van activering te ontleden en in vitro te functioneren en, nog belangrijker, ook bij adoptieve overdracht in vivo.

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, maakt het mogelijk om iNKT-cellen uit de milt van iVa14-Ja18 transgene muizen te verrijken via een immunomagnetisch scheidingsproces samengevat in figuur 1A. Totale milt T-cellen worden eerst negatief geselecteerd door B-cellen en monocyten uit te putten, gevolgd door iNKT-celpositieve immunomagnetische sortering met PBS-57 lipide-antigeen geladen CD1d-tetrameren, die het mogelijk maken om specifiek alleen iNKT-cellen te kleuren. Dit proto...

We beschrijven een snel en robuust protocol om invariante natural killer T (iNKT) cellen uit muizen milt te verrijken en in vitro uit te breiden tot geschikte aantallen voor in vitro en in vivo studies.

Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Dit protocol maakt de zuivering van INK T-cellen mogelijk, die zeer zeldzaam zijn, en maakt een 30-voudige uitbreiding in hun aantal mogelijk. De zuivering kan in één dag worden uitgevoerd en produceert in twee weken een groot aantal kant-en-klare INK T-cellen voor in vivo en in vitro studies. De procedure wordt gedemonstreerd door Gloria Delfanti, een post-doc in het lab.Nadat je de milt van de muis hebt ontleed, sla je hem door een celzeef van 70 nanometer om een eencellige suspensie te verkrijgen in 10 milliliter PBS met 2% FBS. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 keer G. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel met één milliliter steriele ammoniumchloride kaliumlysinebuffer.Incubeer de cellen gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en blok vervolgens met vijf milliliter PBS met 2% FBS. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 keer G. Na het verwijderen van het supernatant, resuspend de celkorrel in drie milliliter PBS met 2% FBS en verwijder vetresten door pipetteren.Houd voor de verrijkingsstappen de cellen koud en gebruik oplossingen die vooraf zijn afgekoeld bij vier graden Celsius en vervolgens op ijs worden gehouden. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 300 keer G. Resuspend alle cellen in de juiste hoeveelheid PBS met 2% FPS en Fc-blokker en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Was met één tot twee milliliter MACS-scheidingsbuffer per 10 miljoen cellen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 maal G. Na het verwijderen van het supernatant, kleur de cellen met CD19-FITC en H2-IAb-FITC en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij vier tot acht graden Celsius. Was cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 maal G.Verwijder supernatant en resuspend de celkorrel in 90 microliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen. Voeg 10 microliter anti-FITC microbeads per 10 miljoen cellen toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij vier tot acht graden Celsius.Was de cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 maal G. Verwijder het supernatant en resuspend tot 125 miljoen cellen in 500 microliter MACS-buffer. Plaats een LD-kolom in het magnetisch veld van de MACS-scheidings separator.Om verstopping te voorkomen, brengt u een voorscheidingsfilter aan op de LD-kolom en spoelt u deze af met twee milliliter MACS-buffer. Breng de celsuspensie aan op het filter en verzamel de niet-gelabelde cellen die door de kolom gaan. Was het lege kolomreservoir driemaal met één milliliter MACS-buffer.Verzamel het met T-cel verrijkte effluent en tel de cellen, waarbij 50 microliter overblijft voor FACS-analyse. Na het centrifugeren op 300 keer G gedurende vijf minuten, verwijder het supernatant en kleur de cellen met CD1d tetrameer-PE. Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten in het donker op ijs.Was de cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen. Na centrifugeren op 300 maal G gedurende 10 minuten, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de celkorrel in 80 microliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen. Voeg 20 microliter anti-PE microbeads per 10 miljoen cellen toe.Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij vier tot acht graden Celsius. Was cellen door één tot twee milliliter MACS-buffer per 10 miljoen cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 maal G. Verwijder het supernatant en resuspend tot 100 miljoen cellen in 500 microliter MACS-buffer.Plaats volgens het celgetal de LS- of MS-kolom in het magnetisch veld van de MACS-separator en spoel de kolom met MACS-buffer. Breng de celsuspensie aan op de kolom, verzamel niet-gelabelde cellen die er doorheen gaan en was de kolom drie keer zoals eerder beschreven. Dit is de negatieve fractie.Verwijder de kolom uit het magnetisch veld en plaats deze op een nieuwe opvangbuis. Pipetteer MACS-buffer op de kolom en duw de meegeleverde zuiger in de kolom om de positieve fractie verrijkt met INK T-cellen weg te spoelen. Om het herstel van de INK T-cel verder te verhogen, centrifugeert u de negatieve fractie gedurende 10 minuten bij 300 maal G en herhaalt u de vorige stappen met een nieuwe LS- of MS-kolom.Trek de positieve fracties en bepaal het celgetal. Bewaar 50 microliter van zowel positieve als negatieve fracties voor FACS-analyse om de zuiverheid te controleren. Om INK T-cellen in een één-op-één-verhouding te activeren, brengt u het juiste volume anti-CD3- en CD28-magnetische kralen over naar een buis en met een gelijk volume PBS en vervolgens gedurende vijf seconden vortex.Plaats de buis gedurende één minuut op een magneet en gooi het supernatant weg. Verwijder de buis van de magneet en resuspend de gewassen magnetische kralen in het juiste volume RPMI. Centrifugeer gezuiverde INK T-cellen op 300 keer G gedurende vijf minuten en meng ze met muis T-activator anti-CD3 of CD28 magnetische kralen.Plaat één milliliter van de celsuspensie, anti-CD23 en CD28 magnetische kralen in een 48-well plaat met 20 eenheden per milliliter IL-2, dan incuberen bij 37 graden Celsius. Voeg na vijf dagen 10 nanogram per milliliter IL-7 toe. Splits de cellen in tweeën wanneer ze 80 tot 90% confluentie bereiken, waarbij altijd 20 eenheden per milliliter IL-2 en 10 nanogram per milliliter IL-7 worden toegevoegd.Onder deze omstandigheden kunnen INK T-cellen tot 15 dagen worden uitgebreid. Met behulp van dit protocol worden INK T-cellen verrijkt uit de milt van transgene muizen via een immunomagnetisch scheidingsproces. Na verrijking kunnen de cellen worden uitgebreid met anti-CD3- en CD28-kralen, wat resulteert in een 30-voudige expansie gemiddeld op dag 14 van de cultuur.De sterke activering met anti-CD3 en anti-CD kralen veroorzaakte de downregulatie van de IMK T-cel TCR expressie op het celoppervlak en een dubbele negatieve populatie verscheen. De meeste geëxpandeerde INK T-cellen zijn CD4-negatief. Karakterisering van de afstammingsspecifieke transcriptiefactoren PLZF en ROR gamma T maakte het mogelijk om de NKT1-, NKT2- en NKT17-fenotypen te identificeren op verrijkte INK T-cellen op dag nul en 14.De verrijkte INK T-cellen vertonen een T80-achtig effectorfenotype, dat na 14 dagen expansie wordt geconserveerd, zoals bevestigd door de secretie van zowel interferon gamma als IL-4 na PMA- en ionomycinestimulatie. Vergeet tijdens de zuiveringsstappen niet om snel te werken met voorgekoelde oplossingen en verwijder eventuele vetresten die tijdens het pipetteren kunnen worden gezien. Geëxpandeerde INK T-cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro assays en in vivo overdrachten in muizen, zelfs na functionele modificaties via genoverdracht of bewerking.In vitro expansie van INK T-cellen overwint de beperking die wordt gegeven door de schaarste, waardoor ze exploiteerbaar zijn in preklinische studies op het gebied van tumorimmuunsurveillance, infectieziekten en auto-immuniteit.

purification-expansion-mouse-invariant-natural-killer-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

This video demonstrates the isolation of lymphocytes, including natural killer cells or NK cells, from human liver tissue for selective expansion. Enzymatic and mechanical digestion, followed by density gradient separation, promotes lymphocyte isolation, including NK cells. The collected lymphocytes can be further used for the selective expansion of NK cells.

Natural Killer Cell Isolation from Liver Tissue for Selective Expansion

This video illustrates a method for isolating invariant natural killer T cells, also known as iNKT cells. The procedure begins with injecting a synthetic glycolipid into a mouse to stimulate the activation and proliferation of iNKT cells in the spleen. Subsequently, single-cell suspensions are prepared from the spleen and incubated with iNKT-cell-recognizing complexes labeled with fluorophores, followed by magnetic bead-based separation, to isolate the iNKT cells.

Isolating Invariant Natural Killer T Cells from a Mouse Model

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Hier presenteren we een aangepast protocol dat kan worden gebruikt om een groot aantal muisinvariante natuurlijke killer-T-cellen uit de muizenmilt te genereren. Het protocol schetst een benadering waarmee splenkachtige iNKT-cellen kunnen worden verrijkt, geïsoleerd en in vitro uitgebreid met behulp van een beperkt aantal dieren en reagentia.

Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Hier presenteren we een protocol voor de in vivo bepaling van naïeve CD4 T cel (T-cel) activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door GM-CSF beenmerg (BM)-afgeleide dendritische cellen (DC's). Dit protocol beschrijft Daarnaast BM en T-cel isolatie, DC generatie en DC en T-cel adoptief overdracht.

Een muismodel In Vivo maatregel naïef CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door het beenmerg-afgeleide dendritische cellen

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Dit is een methode om baarmoederlymfecellen te isoleren van zowel zwangere als niet-zwangere muizen. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen zoals FACS-fenotypering, celsortering, functionele assays, RNA-seq en proteomics. Het protocol hier laat zien hoe groep 1 uteriene aangeboren lymfoïde cellen kunnen worden gefenotypeerd door flowcytometrie.

Isolatie van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder voor analyse door flowcytometrie

Leer de zuivering en uitbreiding van muis-iNKT-cellen voor immunologisch onderzoek. Dit protocol realiseert een 30-voudige expansie binnen twee weken voor in vitro en in vivo studies.

Zuivering en uitbreiding van muisinvariante Natural Killer T-cellen voor in vitro en in vivo studies

Meer video's verkennen