Grootschalige bereiding van synoviale vloeistof Mesenchymale stamcel-afgeleide exosomen door 3D Bioreactor Cultuur

We presenteren een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van onze 3D-bioreactor. Deze exosomen kunnen worden gebruikt in exosoombiologisch onderzoek en klinische artritisbehandeling. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Yujie Liang.

Begin met het verzamelen van de menselijke mesenchymale cellen, of MSC's, door de synoviale vloeistof te centrifugeren op 1, 500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspenseer de celpellet met 10 milliliter PBS. Centrifugeer de geresuspendeerde cellen op 1.500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en gooi PBS weg voordat u de pellet resuspendeert met 10 milliliter menselijk MSC-kweekmedium bij een celdichtheid van vijf keer 10 tot de vierde cellen per milliliter en plaats de suspensie vervolgens in een schaal van 100 millimeter.

Incubeer het gerecht bij 37 graden Celsius in een atmosfeer die 5% koolstofdioxide bevat. Verzamel na twee weken het celkweeksupernatant om synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen of SF-MSC's te identificeren met behulp van flowcytometrie. Om dit te doen, verteer de derde generatie passage drie van SF-MSC's door centrifugatie op 1.000 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Gooi vervolgens het supernatant weg voordat u de celpellet verzamelt. Voeg vervolgens 400 microliter van de blokkerende buffer toe aan de celpellet in de concentratie van vijf keer 10 tot de vierde en laat de pellet 15 minuten op kamertemperatuur staan. Na 15 minuten centrifugeert u de celsuspensie zoals eerder beschreven en resuspendeert u de gescheiden pellet vervolgens in 100 microliter 1X PBS.

Voeg één microliter van het monoklonale fluorescerende antilichaam toe met een verdunningsverhouding van 1:100 per buis zoals beschreven in het manuscript en plaats de buis voor incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was de cellen na incubatie tweemaal met 1X PBS en resuspenseer de cellen in 100 microliter 1X PBS. Detecteer vervolgens de fluoroforen in maximaal 10.000 cellen op een flowcytometer met behulp van rode en FITC-kanalen.

Om de microdragers te bereiden, zwellen en hydrateren droog 0,75 gram van de microdragers in 1X DPBS in de concentratie van 50 milligram per gram gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur. Decanteer vervolgens het supernatant om de microdragers gedurende vijf minuten in verse DPBS te wassen. Na het medium te hebben vervangen door verse 1X DPBS bij 50 milligram van de microdragers per gram, steriliseer de microdragers door 15 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius bij 15 pond per vierkante inch.

Laat vervolgens de gesteriliseerde microdragers bezinken voordat u het supernatant decanteert. Spoel de microdragers in het kweekmedium in de concentratie van 50 milligram van de microdragers per gram bij kamertemperatuur. Wanneer de microdragers zijn bezonken, gooit u het supernatant weg.

Om perfusiebioreactor voor te bereiden, steriliseert u de bioreactor door autoclaveren zoals eerder beschreven. Als u klaar bent, telt u het aantal SF-MSC's om 2,5 keer 10 toe te wijzen aan de zevende SF-MSC's en microcarriers aan de bioreactor doordrenkt met 250 milliliter van het GMP-grade MSC-kweekmedium. Plaats de bioreactor in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius met een snelheid van 15 rotaties per minuut.

Verander het cultuurmedium om de zes dagen. Verzamel na 14 dagen de celkweeksupernatanten en microdragers voor verdere analyse. Centrifugeer het celkweeksupernatant op 300 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant terwijl het cellulaire vuil wordt weggegooid.

Bij vier graden Celsius centrifugeer je het supernatant achtereenvolgens op 2.000 keer G gedurende 10 minuten en vervolgens op 10.000 keer G gedurende 30 minuten om de grotere blaasjes weg te gooien en de pellet te verzamelen. Na het resuspenderen van de pellet in 40 milliliter PBS, centrifugeert u de celsuspensie op 120.000 maal G gedurende 70 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer vervolgens de verzamelde pellet met exosomen in 500 microliter PBS.

Verdun de vers geïsoleerde exosoommonsters met steriele PBS tot de concentratie van 10 tot de zevende tot 10 tot de negende deeltjes per milliliter en injecteer 500 microliter van het monster voor elke run in de nanodeeltjesvolganalyse, of NTA-systeem, met 30 microliter per minuut en 24,4 tot 24,5 graden Celsius. Stel het opname- en analysesysteem handmatig in volgens het protocol van de fabrikant. Visualiseer de deeltjes door laserlichtverstrooiing en leg hun Brownse beweging vast op digitale video.

Analyseer vervolgens de opgenomen videobanden met behulp van software en volg ten minste 200 individuele deeltjes per run. Voeg voor Western blotting 300 microliter van de lysisbuffer en proteaseremmerscocktail toe aan de exosomen met mengen door op en neer te pipetteren. Laat het vervolgens 20 minuten op ijs staan.

Na centrifugeren van het mengsel op 9, 391 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, meet u de eiwitconcentratie in het supernatant met behulp van een eiwittestkit. Verwarm het monster na de test met 100 microliter 4X eiwitbelastingsbuffer bij 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Laad vervolgens 15 microliter eiwitten in een concentratie van 10 milligram per milliliter om gedurende 70 minuten te draaien door gel-elektroforese op 120 volt en elektro-blotting op 100 volt gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius.

Detecteer de niet-exosoomspecifieke markers, zoals calnexin en de exosomale biomarkers zoals CD9, CD63 en CD81 door fluorescerende Western blotting. In de studie werd flowcytometrie gebruikt om de oppervlaktemarkers van SF-MSC's te identificeren. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat de gekweekte SF-MSC's negatief waren voor CD34, CD45 en HLA-DR, en positief voor CD73, CD90 en CD105, die voldeden aan de identificatiecriteria van MSC's.

Onder omgekeerde microscopie werd opgemerkt dat de SF-MSC's zich verspreiden op microdragers. De SF-MSC verspreidde zich vanaf zes dagen sneller in de 3D-cultuur in vergelijking met de 2D-cultuur. De exosomen van SF-MSC's van 2D- en 3D-cultuur werden geïdentificeerd met behulp van Western blotting en de exosomen bleken CD63, CD9 en CD81 tot expressie te brengen terwijl ze negatief waren voor calnexin.

De nanocytenanalyse toonde aan dat de diameter van 2D- en 3D-exosomen ongeveer 120 nanometer was. De microscopische analyse van transmissie-elektronen onthulde de morfologie van 2D- en 3D-exosomen, die ruwweg bolvormige blaasjes vertonen. Met behulp van NTA-analyse werd de concentratie van deeltjes van 30 tot 160 nanometer geanalyseerd.

Na 3D-cultuur was de deeltjesconcentratie 4,0 keer 10 tot de zes per milliliter. Na de 2D-cultuur was de concentratie van deeltjes van dezelfde grootte echter 2,5 keer 10 tot de zes per milliliter. Bovendien produceerde 3D-cultuur meer exosoomeiwit dan 2D-cultuur.

De representatieve analyse toont de internalisatie van Dil-gelabelde exosomen door primaire chondrocyten. Dil-gelabelde exosomen die primaire chondrocyten binnendrongen, zijn te zien met een piek van drie uur. In vitro leveringsstudie toonde aan dat exosomen sulfo-cyanine3-gelabeld microRNA-140 aan chondrocyten konden leveren.

Het plating van de cellen, het starten van de reactie in de bioreactor en het supernatant zijn de belangrijkste stappen in dit protocol. 3D-cultuur wordt vaak gebruikt voor grootschalige kweek van aanhangende cellen. Andere methoden zoals spin flex kunnen ook worden gebruikt voor grootschalige productie van exosomen.

Onze methode verbetert de opbrengst van exosomen, waardoor msc exosoom-gebaseerde preklinische toepassing mogelijk wordt.