Name: In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer calciumbeeldvorming in vivo in de inferieure olijf van muizen met GRIN-lenzen. Deze methode maakt real-time monitoring van neuronale activiteit mogelijk zonder vitale hersenstamstructuren te beschadigen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Andrew Scott van het mediacentrum van OIST voor zijn hulp bij het opnemen en bewerken van video's. Ook bedanken we Hugo Hoedemaker voor zijn hulp bij het ontwikkelen van de operatie om de hersenstam bloot te leggen en Dr. Kevin Dorgans voor zijn hulp bij het tekenen van diagrammen voor figuren. Daarnaast grote dank aan Salvatore Lacava voor zijn voice-over verhaal, evenals alle nRIM-leden en huisdieren voor voortdurende ondersteuning voor welzijn in de moeilijke tijden van COVID-19.

<ol><li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+signals+in+vivo%3A+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+brain+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice.</a> Nature Methods. , (2019).</li>
<li>Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).</li>
<li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+In+vivo+Calcium+Imaging+with+a+Head-Mount+Miniaturized+Microscope+in+the+Amygdala+of+Freely+Behaving+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse.</a> Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).</li>
<li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+the+light+that+we+can+see%3A+a+new+era+in+miniaturized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li>
<li>Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li>
<li>Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li>
<li>Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+L+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , e61023(2020).</li>
<li>Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+alone+and+combined+with+diazepam+or+xylazine+in+laboratory+animals%3A+A+10+year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience.</a> Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+andn+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li>
<li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).</li>
<li>Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+nucleus+MdV+mediates+skilled+forelimb+motor+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine%2FXylazine%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ketamine/Xylazine.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIN1PIPE%3A+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li>
<li>Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li>
<li>Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/zhoupc/CNMF_E">https://github.com/zhoupc/CNMF_E</a> (2020).</li>
<li>De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+olive%3A+All+ins+and+outs%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+the+Cerebellum+and+Cerebellar+Disorders%22%5BJournal%5D)">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li>
<li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Aangezien de chirurgische procedure operaties omvat die worden uitgevoerd in het keelgebied met tal van vitale structuren (slagaders, zenuwen), is het essentieel dat het wordt uitgevoerd door een onderzoeker met chirurgische vaardigheden op hoog niveau. In het volgende belichten en becommentariëren we een aantal belangrijke punten van de procedure; er moet echter aan worden herinnerd dat geen enkele hoeveelheid schriftelijk advies de ervaring, vaardigheid en intuïtie van de onderzoeker kan vervangen.
De meest kritieke stap in de operatie is tracheotomie. Het gaat om het snijden van de luchtpijp, het wisselen van isofluraan van de neuskegel naar de intubatiebuis, het vastzetten van de luchtpijp aan de borsthuid en het aan elkaar vastzetten van de luchtpijp en de intubatiebuis. Al deze operaties moeten op een soepele en snelle manier worden uitgevoerd om ongelukken te voorkomen, zoals onvoldoende anesthesie, instroom van vloeistof in de luchtpijp of intubatiebuis slip-off. Men moet het protocol in gedachten houden voordat u de luchtpijp doorsnijdt.
Bloeding is een van de belangrijkste oorzaken van dierensterfte in deze operatie. Omdat het nekgebied dicht is met bloedvaten, mag de snede alleen worden uitgevoerd als de gezichtslijn duidelijk is om te voorkomen dat ongeziene aderen en slagaders worden doorgesneden. Daarom moeten spieren en bindweefsels die het gezichtsvermogen verduisteren, worden verwijderd en moet bloed uit gebroken haarvaten worden gereinigd voordat het oprukt.
Dier kan vanaf het begin van de operatie lang (meer dan 8 uur) in leven worden gehouden. Het is echter belangrijk om de chirurgische procedure snel af te ronden, zodat er meer tijd is om hersenstamneuronen te onderzoeken wanneer de fysiologische conditie van dieren goed is. Een ervaren onderzoeker kan de hele procedure in 70 minuten voltooien.
Hoewel de methode een schoon beeld biedt van ventrale hersenoppervlakken, is het helaas onmogelijk om dit te doen zonder een tracheotomie uit te voeren en een aanzienlijke hoeveelheid weefsel in het keelgebied te verwijderen. Daarom mag het dier niet wakker worden van anesthesie. Bovendien, hoewel het mogelijk is om het dier vele uren in leven te houden met zorgvuldige aanpassing van de verdoving, het handhaven van de lichaamstemperatuur en hydratatie, is het onvermijdelijk dat langdurig experimenteren uiteindelijk zal leiden tot verzwakking van de conditie van het dier. Het is aan de expertise van de onderzoeker om de maximale duur van stabiele opnames te overwegen.
Een andere mogelijke beperking van de methode zoals hier beschreven is dat omdat de GRIN-lens niet in het parenchym van de hersenen wordt ingebracht, alleen relatief oppervlakkige neuronen (~ 150-200 μm) kunnen worden onderzocht. Hoewel chirurgische implantatie van grin-lens technisch mogelijk is, geeft de acute operatiemethode niet voldoende tijd voor neuronen om te herstellen van oxidatieve stress en de aanwezigheid van bloed na implantatie zal waarschijnlijk de beeldkwaliteit verder verslechteren dan acceptabel.
Ondanks de bovenstaande zorgen geloven we dat dit de eerste keer is dat een methode voor in vivo beeldvorming van IO-neuronen wordt gepresenteerd. Het maakt onderzoek van spatiotemporale activiteit in de IO-neuronen in de context in vivo mogelijk in aanwezigheid van intacte afferente-ingangen van sensorische systemen, evenals de signalen van de cerebellaire kernen en de mesodiencephalische verbinding22, een prestatie die tot nu toe niet mogelijk was. Met deze methode kan de functie van de IO nu dieper worden onderzocht met een combinatie van sensorische en optogenetische stimulatie. Met name met de evolutie van spanningsbeeldvorming (zoals onze recente methode voor spanningsbeeldvorming in de IO 23),hopen we dat de gepresenteerde chirurgische methode tal van onderzoekers zal inspireren om de uitdaging aan te gaan om te onderzoeken hoe het IO bijdraagt aan het genereren van cerebellaire complexe spikes.

Het belangrijkste doel van systeemneurowetenschappen is om te begrijpen hoe spatiotemporale activiteitspatronen van neuronale netwerken bijdragen aan het genereren van dierlijk gedrag. Zo is fluorescerende beeldvormingsmethodologie met behulp van calciumgevoelige sondes in het afgelopen decennium een belangrijk hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van neuronale netwerkactiviteit bij levende dieren1,2, omdat het visualisatie van dergelijke dynamiek mogelijk maakt op ruimtelijke schalen variërend van enkele cellen tot mesoschaalcircuits. In de afgelopen jaren is de gemeenschappelijke benadering waarbij neurale circuits in oppervlakkige hersenstructuren (zoals cerebrale of cerebellaire cortices) worden afgebeeld door middel van een transparant schedelvenster3 aangevuld met het gebruik van gradiënt-brekingsindex (GRIN)lenzen 4 die onderzoek van netwerkdynamiek in diepe hersenstructuren mogelijk maken. Momenteel beschikbare GRIN-lenzen maken het mogelijk om enkele millimeters diep in structuren te reiken, zoals de muis amygdala, hippocampus en basale ganglia5. Veel interessegebieden, zoals verschillende kernen in de ventrale medulla, liggen echter aanzienlijk dieper, waardoor ze zich in het uiterste van het GRIN-lensbereik plaatsen.
Hier beschrijven we hoe we deze moeilijkheid kunnen overwinnen door te profiteren van de relatief gemakkelijke toegankelijkheid van medulla door het ventrale aspect van de hersenen. Met behulp van volwassen muizen waarbij de inferieure olijf (IO), een kern in de ventrale medulla, viraal is getransfecteerd met een calciumsensor GCaMP6s, beschrijven we de chirurgische stappen (aangepast van de methode die oorspronkelijk werd beschreven in Khosrovani et al. 20076) om een GRIN-lens op het ventrale oppervlak van de hersenen van een verdoofde muis te plaatsen. Met behulp van een miniatuurmicroscoop tonen we de haalbaarheid aan van het registreren van neuronale activiteit in zulke extreem ventrale hersengebieden. Hoewel de procedure noodzakelijkerwijs een niet-overlevingsoperatie is en er niet kan worden geëxperimenteerd bij wakkere dieren, maakt de methode het mogelijk om intacte netwerkdynamiek te onderzoeken in de context van sensorische of andere afferente pathway-stimulatie, wat duidelijke voordelen biedt ten opzichte van ex vivo-benaderingen zoals het gebruik van acute slice-preparaten.

<table><tbody><tr><td>AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, USA</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable suture with 6 mm half circle needle</td><td>Natume, Japan</td><td>L6-60N2</td><td>hook needle with thread</td></tr><tr><td>Absorption triangles</td><td>FST, Germany</td><td>18105-03</td><td>Chirurgische sponzen</td></tr><tr><td>Stereo microscopes</td><td>Leica, Germany</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo curved tip needle holder with lock</td><td>FST, Germany</td><td>12061-01</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>Sanyo, Japan</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Delicate suture tying forceps</td><td>FST, Germany</td><td>11063-07</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Delicate Suture Tying Forceps</td><td>FST, Germany</td><td>11063-07</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>FST, Germany</td><td>11251-35</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Fine Iris scissors</td><td>FST, Germany</td><td>14060-09</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur curved tip</td><td>FST, Germany</td><td>16221-14</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Gelfoam absorbable gelatin sponge</td><td>Pfizer, USA</td><td>0315-08</td><td>Hemostatic gelatin sponge</td></tr><tr><td>Glass-Capillary Nanoinjection</td><td>Neurostar, Germany</td><td>n/a</td><td>Voor injectie van virusvector</td></tr><tr><td>Graefe Forceps with serrated tip</td><td>FST, Germany</td><td>11052-10</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Implantation rod</td><td>Inscopix, USA</td><td>n/a</td><td>Het maakt deel uit van het nVoke2-systeem. Het is ontworpen voor de nVoke2-miniatuurmicroscoop en GRIN-lens kan erop worden gemonteerd</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis, UK</td><td>n/a</td><td>Isofluran</td></tr><tr><td>KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION</td><td>Daiichi Sankyo, Japan</td><td>n/a</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark, USA</td><td></td><td>Reinigingsdoekje</td></tr><tr><td>Laser-Based Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Beveler</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900</td><td>Neurostar, Germany</td><td>n/a</td><td>Stereotaxische frame</td></tr><tr><td>mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter</td><td>Starr Life Sciences, PA, USA</td><td>MouseOxPlus</td><td>Meet dierlijke hartslag, arteriële zuurstofverzadiging (SpO2), ademhalingsfrequentie en temperatuur</td></tr><tr><td>nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system</td><td>Inscopix, USA</td><td>1000-003026</td><td>Miniatuurmicroscoop</td></tr><tr><td>Ohaus Compact Scales</td><td>Ohaus, USA</td><td>CS 200</td><td>Weegschaal gebruikt om dieren te wegen</td></tr><tr><td>Otsuka Normal Saline</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Physiological-biological temperature controller system</td><td>SuperTech Instruments, Hungary</td><td>TMP-5b</td><td>Thermische pad voor muis</td></tr><tr><td>ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length</td><td>Inscopix, USA</td><td>1050-002214</td><td>Gradient-brekingsindex (GRIN) lens</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP glass capillaries</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>112017</td><td>Aangepaste kwartsglas capillaire</td></tr><tr><td>Safety IV Catheter 20G</td><td>B. Braun, Germany</td><td>4251652-03</td><td>20 gauage katheter gebruikt om een intubatiebuis voor te bereiden</td></tr><tr><td>Sand paper</td><td>ESCO, Japan</td><td>EA366MC</td><td>Wordt gebruikt om de punt van een 25G-naald te polijsten om een gebogen en stompe naald voor te bereiden</td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Muromachi Kikai, Japan</td><td>10010-00</td><td>Wordt gebruikt om de punt van een kwartsglaspijpje af te snijden</td></tr><tr><td>SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system</td><td>Kent Scientific, USA</td><td>SOMNO</td><td>Biedt nauwkeurige controle van isofluran-stroom</td></tr><tr><td>Surgic XT Plus drill</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>Voor injectie van virusvector</td></tr><tr><td>Syringe 1 ml</td><td>Terumo, Japan</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needle 25G</td><td>Top, Japan</td><td>00819</td><td>Wordt gebruikt om een stompe en gebogen naald te maken</td></tr><tr><td>Syringe needle 26G</td><td>Terumo, Japan</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Professional Trimmer</td><td>Thrive, Japan</td><td>n/a</td><td>Scheerapparaat</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingen spring scissors</td><td>FST, Germany</td><td>15004-08</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Hayashi Pure Chemical, Japan</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet sensitive skin</td><td>Veet, Canada</td><td>n/a</td><td>Haarverwijderingscrème</td></tr><tr><td>Xylocaine Jelly 2 % 30ml</td><td>Aspen Japan, Japan</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferieure olijf (IO), een kern in de ventrale medulla, is de enige bron van klimvezels die een van de twee ingangsroutes vormen die het cerebellum binnenkomen. IO is al lang voorgesteld om cruciaal te zijn voor motorische controle en de activiteit ervan wordt momenteel beschouwd als het centrum van vele hypothesen van zowel motorische als cognitieve functies van het cerebellum. Hoewel de fysiologie en functie ervan relatief goed zijn bestudeerd op eencellig niveau in vitro,zijn er momenteel geen rapporten over de organisatie van de IO-netwerkactiviteit bij levende dieren. Dit is grotendeels te wijten aan de uiterst uitdagende anatomische locatie van de IO, waardoor het moeilijk is om te worden onderworpen aan conventionele fluorescerende beeldvormingsmethoden, waarbij een optisch pad moet worden gecreëerd door de hele hersenen die zich dorsaal naar de interesseregio bevinden.
Hier beschrijven we een alternatieve methode voor het verkrijgen van state-of-the-art calcium imaging data uit het IO-netwerk. De methode maakt gebruik van de extreme ventrale locatie van de IO en omvat een chirurgische procedure voor het inbrengen van een gradiënt-brekingsindex (GRIN) lens door de nek ingewanden om in contact te komen met het ventrale oppervlak van de calciumsensor GCaMP6s-expresserende IO bij verdoofde muizen. Een representatieve calciumbeeldvormingsopname toont de haalbaarheid aan om IO-neuronactiviteit na de operatie vast te leggen. Hoewel dit een niet-overlevingsoperatie is en de opnames onder anesthesie moeten worden uitgevoerd, voorkomt het schade aan levenskritische hersenstamkernen en maakt het mogelijk om een grote verscheidenheid aan experimenten uit te voeren die spatiotemporale activiteitspatronen en inputintegratie in de IO onderzoeken. Deze procedure met modificaties kan worden gebruikt voor opnames in andere, aangrenzende gebieden van de ventrale hersenstam.

Hier presenteren we een representatieve opname verkregen met de methode zoals beschreven. Figuur 6a toont de locatie van helder gelabelde IO-cellen die tijdens het experiment zijn gevisualiseerd. De donkere diagonale strepen zijn bloedvaten. Let op de variabele helderheid van individuele cellen, als gevolg van variabele transfectie-werkzaamheid. In paneel figuur 6b tonen we de gemiddelde genormaliseerde fluorescentie-intensiteit (deltaF/F) sporen verkregen uit de somata aangegeven met kleuren en getallen in paneel a. Opwaartse doorbuigingen vertegenwoordigen voorbijgaande verhogingen van intracellulair calcium. Merk op hoe verschillende niveaus van GCaMP6s-expressie (weerspiegeld in celhelderheid in paneel a) leiden tot variabele signaal-ruisverhoudingen (SNR).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Figuur 6: Voorbeeldregistratie van activiteit van IO-neuronen in verdoofde muis. (a) Representatief voorbeeldframe van een opname na ruimtelijke filtering. Heldere vlekken zijn IO neuronale somata, waarvan er verschillende zijn geïndiceerd als interessegebieden (ROIs, gekleurde getallen). Donkere strepen zijn bloedvaten. (b) Voorbeeld deltaF/F-sporen verkregen uit de ROI's vermeld in paneel a. Opwaartse afbuigingen reflecteren een toename van het calciumsignaal. Schaalbalk in a=10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Inferieure olijf is het meest ventrale deel van de medulla en is dus extreem moeilijk te bereiken bij een levend dier. Hier introduceren we een protocol om de volwassen muishersenen aan de ventrale kant bloot te leggen en gebruiken we GRIN-lenzen om neuronale activiteit in de inferieure olijfneuronen op te nemen die calciumsensoren uitdrukken. Deze methode voorkomt schade aan levenskritische hersenstam en maakt onderzoek mogelijk naar ruimtelijk-temporele activiteitspatronen en inputintegratie in de inferieure olijf.Omdat de operatie wordt uitgevoerd in het complexe keelgebied met veel vitale structuren, is het essentieel dat het wordt uitgevoerd door een onderzoeker met chirurgische vaardigheden op hoog niveau. Bereid een intubatiebuis voor door een 5 tot 6 millimeter lange en 0,8 millimeter brede spleet vanaf de punt van een katheter van 20 gauge te snijden. Bereid een stompe en gebogen naald voor door de punt af te snijden, het breukoppervlak te schuren en te buigen met de tang.Dit wordt gebruikt om een luchtpijp te ondersteunen tijdens de tracheotomie. Verdun 15 milligram per milliliter ketamine met zoutoplossing tot 15%Assembleer operatiegereedschappen en verbruiksartikelen. Stel het verwarmingskussen in op 38 graden Celsius.Draai de nosecone 180 graden horizontaal in stereotaxic frame. Weeg de muis waarvan de inferieure olijf eerder werd getransfecteerd door virusdragende GCaMP6's en bereken de hoeveelheid verdunde ketamine voor injectie. Vul de inductiebox voor met 5%isofluraan en verdoof de muis.Monteer de muis in het stereotaxic frame, ventrale kant naar boven. Scheer de keel en het dijbeen van de muis. Verwijder het resterende haar met ontharingscrème.Breng xylocaïnegelei aan op de keelhuid. Bewaak de muistemperatuur met een rectale thermische sensor. Injecteer een milliliter voorverwarmde zoutoplossing intraperitoneaal.Beoordeel de diepte van anesthesie door sterk knijpen op achterhand tenen. Er mag geen detecteerbare reactie worden opgeroepen. Maak een verticale incisie in de keelhuid langs de middellijn.Scheid de nekhuid van de ingewanden eronder met behulp van een stompe dissectiemethode en snijd de huid af. Bevrijd speekselklieren uit bindweefsel en draai ze zijdelings om om de met sternothyroidspier bedekte luchtpijp bloot te leggen. Injecteer intraperitoneaal de eerste dosis verdunde ketamine met vijf milliliter per kilogram dierlijk gewicht.Splits de sternothyroid spier voorzichtig langs de middellijn met de punt van een fijne tang om de luchtpijp bloot te leggen. Maak de luchtpijp los van bloedvaten en slokdarm met een tang met behulp van een stompe dissectiemethode. Injecteer een tweede dosis verdunde ketamine met 2,5 milliliter per kilogram dierlijk gewicht.Steek kruislings een stompe naald onder de luchtpijp. Til de luchtpijp op met de stompe naald. Laat de hechtdraad rond de derde luchtpijpring gaan, de schildklier caudale, met een halve cirkelnaald.Maak vier instrumentbanden op deze ring. Doorboor de borsthuid met dezelfde halve cirkelnaald en leid de draad door de huid. Til de luchtpijp voorzichtig op met de draad en snijd de luchtpijp cauaudaal naar de schildklier.Trek de luchtpijp naar de borsthuid. Verhoog de opening van de luchtpijp door er een klein stukje chirurgische spons onder toe te voegen. Verwijder de resterende vloeistof in de openingstip van de luchtpijp met een dunne strook reinigingsweefsel.Schakel de isofluraanstroom van stereotaxic nosecone naar de intubatiebuis. Steek de intubatiebuis in de luchtpijp. Zorg ervoor dat een deel van de spleet in de buis buiten de luchtpijp blijft om te ademen.Bevestig de luchtpijp aan de borsthuid van de muis door drie tot vier instrumentbanden te maken. Bind de luchtpijp vast met de hechtdraad om de intubatiebuis vast te maken. Snijd de sternothyroid spier langs de spiervezels met de fijne tang.Knip het geïsoleerde deel af met de veerschaar. Bevrijd zorgvuldig overgebleven luchtpijp en strottenhoofd van de spier om de schade aan bloedvaten in de spier te minimaliseren. Verwijder overgebleven luchtpijp en strottenhoofd.Bevrijd de slokdarm van bevestigd weefsel met een tang en snijd deze af met een veerschaar. Verwijder de longitudinale spier die de hersenstam en de ventrale boog van de atlas bedekt. Verwijder de spier die de atlasventerale boog en de voorste knol bedekt.Knip de ventrale bogen van atlas met de rongeur. Verwijder de voorste knol van de atlas. Verwijder het bloed en de vloeistof om het foramen magnum en de hersenstam te bekijken.Breid het foramen magnum uit door het achterhoofdsbeen te verwijderen met de rongeur. Verwijder het kraakbeen en pel voorzichtig de periosteale laag van de dura mater met de fijne tang om een duidelijk zicht op de ventrale hersenstam te hebben. Klem de SpO2-sensor op de dij van de muis om vitale functies zoals hartslag, zuurstofverzadiging en ademfrequentie te controleren.Monteer de GRIN-lens op de implantatiestaaf. Reinig de lens zorgvuldig met 70% met ethanol doordrenkt reinigingsweefsel. Bevestig de implantatiestaaf op het stereotaxic frame en monteer de miniatuurmicroscoop op de implantatiestaaf.Voeg enkele druppels zoutoplossing toe in het hersenstamgebied voor onderdompeling van de GRIN-lens. Benader de hersenstam met de GRIN lens. GCaMP6's die inferieure olijfneuronen in het oppervlakkige gebied uitdrukken, zijn te vinden in een rechthoekvormig gebied, ongeveer 0,5 tot 1,7 millimeter rostral tot de resterende atlas en ongeveer 2,6 tot 1,1 millimeter lateraal tot de middellijn.Schakel de excitatie blauwe LED in miniatuurmicroscoop in om GCaMP6s getransfecteerde inferieure olijfneuronen te lokaliseren. De neuronen vertonen verschillende basislijn fluorescentie intensiteit als gevolg van verschillende GCaMP6s expressie niveau. De verandering van het calciumgehalte van omcirkelde inferieure olijfneuron somata in de video aan de linkerkant zal ons delta F laten zien, gedeeld door F-sporen aan de rechterkant.Hoewel de muis warm en gehydrateerd wordt gehouden, zal deze onvermijdelijk worden verzwakt door langdurige anesthesie en chirurgie. Het is essentieel om de duur van de operatie kort te houden, zodat de fysieke conditie van de muis goed is voor het opnemen. Een ervaren onderzoeker kan de operatie in 70 minuten afmaken.Deze methode, met modificaties, kan worden gebruikt om andere aangrenzende gebieden van de ventrale hersenstam te bestuderen.

in-vivo-calcium-imaging-in-mouse-inferior-olive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Source: Shannonhouse, J., et al.In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (2023).The video demonstrates an in vivo calcium imaging technique to monitor neuronal activity in the dorsal root ganglia (DRG) of a transgenic mouse. DRG neurons express a calcium indicator that increases fluorescence intensity upon binding to calcium. Mechanical or thermal stimuli applied to a hind paw generate action potentials that...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse

Source: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates in vivo calcium imaging in a mouse using a gradient refractive index, or GRIN lens, and a miniaturized microscope. The setup combines head fixation within a frictionless mobile cage system, stimulating neurons and triggering calcium ion influx. The GRIN lens captures calcium signaling in the brain, enabling...

Real-Time Microendoscopic Calcium Imaging in a Freely Moving Mouse

Dit protocol presenteert stappen om fluorescerende calciumbeelden van hersenverwarmende pericyten en bloedstroomgegevens van nabijgelegen bloedvaten in verdoofde muizen te verkrijgen en te analyseren. Deze technieken zijn nuttig voor studies van de fysiologie van muurschilderingscellen en kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype te onderzoeken.

Pericytencalcium en hemodynamische beeldvorming in de hersenen bij transgene muizen in vivo

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

De gyrus dentatus van de hippocampus vervult essentiële en verschillende functies bij het leren en het geheugen. Dit protocol beschrijft een reeks robuuste en efficiënte procedures voor in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de gyrus dentatus bij vrij bewegende muizen.

In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen 

Dit protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming van hypothalamische neuronen met behulp van een miniaturiseerde microscoop (miniscoop) bij vrij handelende muizen tijdens sociale toestandmanipulatie (sociale isolatie en sociale hereniging). Deze methode maakt beeldvorming mogelijk met enkelneuronresolutie van de hypothalamische activiteit die sociale behoefte en sociale verzadiging vertegenwoordigt, waardoor mechanistische studies van sociale homeostase mogelijk zijn.

In Vivo Calciumbeeldvorming met een miniaturiseerde microscoop in de hypothalamus om sociale gedragingen bij muizen te begrijpen

Leer calciumbeeldvorming in vivo in de inferieure olijf van muizen met GRIN-lenzen. Deze methode maakt real-time monitoring van neuronale activiteit mogelijk zonder vitale hersenstamstructuren te beschadigen.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Meer video's verkennen