Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen
10 februari 2021
Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.
Dit protocol maakt de efficiënte isolatie en cultuur van rpe-cellen van muizen mogelijk. Gezonde primaire muis RPE-culturen zijn waardevolle modellen om de mechanismen van onderliggende oogziekten te begrijpen. Samenvloeibare en levensvatbare RPE-culturen verkrijgen binnen drie dagen en kunnen weken worden gekweekt.
Dit protocol is met succes gebruikt om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan maculadegeneratie op jonge leeftijd, wat de belangrijkste oorzaak is van blindheid bij ouderen in ontwikkelde landen. Het is belangrijk om de ontledingsstappen te visualiseren. Details zijn van cruciaal belang voor het succes van het protocol, bijvoorbeeld hoe om te gaan met de oogbollen, zodat de sclera niet wordt geponst, waar precies sneden moeten worden uitgevoerd en hoe de oogbekers in trypsine kunnen worden ingesloten zodat ze open blijven.
Begin met het voorbereiden van alle benodigde reagentia voor het protocol. Begin vervolgens met het reinigen van de oogbol door zorgvuldig alle bindweefsel, bloed en spieren te verwijderen, met behulp van Dumont nummer vijf tang en schuine schaar, zonder snijwonden in de sclera te maken. Breng de oogbol regelmatig over in een verse schaal met drie milliliter HEPES-vrije HBSS-buffer om het oog fris en schoon te houden en besmetting te voorkomen.
Gebruik de oogzenuw als handvat om de oogbol vast te houden en maak een gat in het midden van het hoornvlies met een scherp koolstofstaal nummer 11 mes. Maak drie incisies in het hoornvlies door het gat met Dumont nummer vijf schaar, zodat er voldoende ruimte is om de lens te verwijderen. Houd de oogzenuw vast en oefen lichte druk uit op de ora serrata met de basis van de schuine schaar, totdat de lens er volledig uitkomt.
Houd het irisepitheel intact om te voorkomen dat het neurale netvlies en RPE tijdens de incubatie losraken. Plaats het oog in hepes-vrije HBSS buffer. Incubeer de ogen zonder lenzen in hyaluronidase-oplossing bij 37 graden Celsius gedurende 45 minuten in een incubator met 5% koolstofdioxide om het neurale netvlies van de RPE los te maken.
Plaats elk oog in een nieuwe put met 1,5 milliliter koude HBSS HEPES buffer per put en incubeer het gedurende 30 minuten op ijs. Plaats na het wassen elk oog in een 35 millimeter kweekschaal met verse HBSS HEPES-buffer. Snijd het hoornvlies door de oorspronkelijke incisies met een Vannas-schaar van acht centimeter totdat de ora serrata is bereikt en snijd vervolgens onder de ora serrata om het irisepitheel en het hoornvlies te verwijderen.
Houd de ora serrata vast met gebogen pincet en gebruik een schuine micro-tang, trek het neurale netvlies weg en zorg ervoor dat de RPE-laag niet wordt doorgesneden. Snijd vervolgens de interne gehechtheid aan de oogzenuw door. Snijd de oogzenuw door en breng elke oogkop over naar een andere 12 putplaat met 1,5 milliliter verse trypsine-EDTA per put.
Zorg ervoor dat de oogbekers geopend en volledig ondergedompeld blijven in de trypsine. Incubeer de oogbekers gedurende 45 minuten op 37 graden Celsius in een incubator van 5%kooldioxide. Verzamel elke oogbeker samen met alle RPE-vellen die tijdens de trypsine-incubatie zijn losgemaakt en breng ze over in een 12-putplaat met 1,5 milliliter FBS-oplossing per put.
Als RPE-vellen in de trypsineoplossing blijven zitten, gebruik dan een micropipet om ze met FBS-oplossing naar de put over te brengen. Houd elke oogkop bij de oogzenuw en schud deze met de voorkant naar beneden in de 12 putplaat met 1,5 milliliter 20% FBS in HBSS HEPES-buffer totdat volledige ontkoppeling van de RPE-vellen is bereikt. Verzamel rpe-vellen en RPE-clusters met een micropipet, vermijd witte stukjes sclera of choroïde, die de culturen kunnen besmetten, en plaats ze in een buis van 15 milliliter.
Trek twee ogen van dezelfde muis in één buis. Centrifugeer vervolgens het RPE-mengsel gedurende twee minuten op 340 x g bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de RPE-pellet voorzichtig in een mengsel van 0,25% trypsine-EDTA en incubeer het gedurende één minuut in een waterbad bij 37 graden Celsius om de RPE-vellen op te splitsen in afzonderlijke cellen.
Pipetteer vervolgens voorzichtig 10 keer op en neer, vermijd bubbelvorming. Voeg negen milliliter vers bereid RPE-medium toe om de trypsine te verdunnen en te inactiveren en centrifugeer het mengsel gedurende twee minuten op kamertemperatuur op 340 x g. Aspireer het supernatant en resuspend de celkorrel zorgvuldig in 150 microliters RPE-medium met 5%FBS.
Verwijder vervolgens PBS uit de onderste kamer van het eerder voorbereide laminine gecoate membraaninzetstuk en voeg er 700 microliter RPE-medium aan toe. Verwijder de lag uit de bovenste kamer van het membraaninzetstuk en verdeel de RPE-celsuspensie druppelgewijs en gelijkmatig naar het midden van de kamer. Plaats de membraaninzet gedurende ten minste 24 uur ongestoord in een incubator van 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius.
Controleer vervolgens de membraaninzet onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de meeste RPE-cellen aan de insert zijn bevestigd en dat de samenvloeiing ten minste 50% is Verander de media de eerste 72 uur niet. RPE-cellen die met dit protocol werden geïsoleerd, vertoonden de typische RPE-grootte, morfologie en pigmentatie. Een sterk gepolariseerde RPE-monolaag met twee kernen verbonden door nauwe verbindingen, samen met de aanwezigheid van apicale microvilli en basale inplooien, werd na een week waargenomen.
Polarisatie van de RPE monolayer werd bevestigd door TER-waarden, met het gemiddelde hoger dan 200 ohm centimeter in het kwadraat, dat in de loop van de tijd stabiel bleef. Bij fagocytosetesten uitgevoerd op FITC-gelabelde boviene POS werd overspoeling en vertering van POS waargenomen, wat wijst op de vorming van een functionele samenvloeiingsmonolaag van RPE-cellen. Levensvatbare culturen vereisen korte ontledingstijd, wat wordt bereikt met ervaring.
Sommige RPE-cellen kunnen aan het neurale netvlies blijven zitten, maar als er meerdere RPE-vellen aan vast blijven zitten, zal het protocol niet slagen. Verse hyaluronidase moet elke keer worden gebruikt om dit probleem te voorkomen. Deze functionele primaire muis RPE celculturen zijn een waardevol hulpmiddel om de pathobiologie van de RPE bij veel oogziekten te bestuderen.
Dit protocol maakte het bijvoorbeeld mogelijk om de pathobiologie van de RPE te bestuderen in een muismodel van maculadegeneratie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een bijgewerkt, gedetailleerd protocol voor de efficiënte isolatie en kweek van primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) van muizen. De methode maakt de generatie mogelijk van robuuste, sterk gepolariseerde en gepigmenteerde RPE-monolagen, wat een waardevol in vitro-model biedt voor het bestuderen van mechanismen van oogziekten en het testen van therapeutische strategieën.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Oogheelkunde
- Celbiologie
- Experimentele modellen
Achtergrond
- Oogziekten komen wereldwijd veel voor, maar onderzoek wordt beperkt door de schaarste aan menselijk oogweefsel.
- Muismodellen worden veelvuldig gebruikt vanwege de anatomische en fysiologische overeenkomsten met mensen.
- Veranderingen in de morfologie en functie van het RPE komen vaak voor bij vele oogziekten, waaronder maculadegeneratie.
- Het isoleren en kweken van primaire RPE-cellen van muizen is technisch uitdagend, maar essentieel voor ziektemodellering.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol te bieden voor het isoleren en kweken van primaire muis-RPE-cellen.
- Om de studie naar moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan oogziekten mogelijk te maken.
- Om een platform te creëren voor het testen van potentiële therapieën voor netbeelaandoeningen.
Gebruikte methoden
- Zorgvuldige dissectie en reiniging van muisogen om de integriteit van het RPE te behouden.
- Enzymatische behandelingen (hyaluronidase en trypsine-EDTA) om RPE-vliezen los te maken en te dissociëren.
- Centrifugatie en voorzichtig pipetteren om enkelvoudige RPE-cellen te verkrijgen.
- Het uitzaaien van cellen op met laminine gecoate Transwell-membraaninserts om monolaagvorming te bevorderen.
- Beoordeling van de RPE-polarisatie, morfologie en functie (bijv. TER-meting, fagocytose-assay).
Belangrijkste resultaten
- Confluente, levensvatbare RPE-culturen worden binnen drie dagen verkregen en kunnen gedurende weken worden onderhouden.
- RPE-monolagen vertonen een typische morfologie, pigmentatie en polarisatie, wat wordt bevestigd door hoge TER-waarden (>200 Ω·cm²).
- Functionele assays tonen fagocytische activiteit aan, wat wijst op gezonde, confluente RPE-monolagen.
- Het protocol is succesvol toegepast bij de studie naar vroege leeftijdgerelateerde maculadegeneratie in muismodellen.
Conclusies
- Dit protocol maakt de reproduceerbare isolatie en kweek van functionele primaire RPE-cellen van muizen mogelijk.
- De resulterende kweken zijn geschikt voor het onderzoek naar de pathobiologie van RPE bij diverse oogziekten.
- Het model biedt een platform voor preklinisch testen van therapeutische interventies voor netvliesaandoeningen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Efficiënte isolatie en kweek van primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) van muizen pakt een kritieke flessenhals aan in de modellering van oogziekten en therapeutische screening. Dit reproduceerbare protocol maakt de generatie van sterk gepolariseerde, functionele RPE-monolagen mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie en targetvalidatie in preklinische ophthalmologie-pipelines. Het platform verhoogt het voorspellend vertrouwen voor translationeel onderzoek en portfolio-triage bij de ontdekking van geneesmiddelen voor retinale aandoeningen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar RPE-gestuurde ziektemechanismen die relevant zijn voor erfelijke en degeneratieve netvliesaandoeningen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het bieden van een fysiologisch relevant systeem op basis van primaire cellen.
- Faciliteert functionele targetvalidatie via kwantitatieve beoordeling van RPE-polarisatie en fagocytische activiteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt robuuste, reproduceerbare RPE-monolagen die geschikt zijn voor downstream compound-screening en mechanistische assays.
- Standaardiseert assaycondities met kwantitatieve outputs zoals transepitheliale resistentie (TER) en fagocytose-readouts.
- Maakt schaalbare preparatie mogelijk van gevalideerde RPE-culturen voor high-content screening workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stelt in vitro RPE-modellen in overeenstemming met ziekte-relevante fenotypes die worden waargenomen bij maculadegeneratie en andere retinale pathologieën.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door mechanistische studies en therapeutisch testen mogelijk te maken.
- Vermindert het translationele risico door menselijk relevante RPE-functies in een gecontroleerd systeem te modelleren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol positioneert de primaire muis RPE-cultuur als een fundamenteel instrument dat de brug slaat tussen vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinische validatie bij de ontwikkeling van oogmedicatie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesting en mechanistische verduidelijking van RPE-dysfunctie in ziektemodellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve assayplatforms voor de evaluatie van verbindingen en fenotypische screening.
- Analytica: Biedt gestandaardiseerde metingen, zoals TER en fagocytosesnelheden, voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Maakt afstemming van in vitro bevindingen met in vivo ziektemodellen en biomarkerontwikkeling mogelijk.
- Herbruik binnen de Organisatie: Vestigt een herbruikbare, gevalideerde workflow voor diverse okulair onderzoek en therapeutische programma's.
Operationele en bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar ziekten gerelateerd aan het RPE.
- Operationele waarde: Verbeteren van de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor primaire celculturen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door een robuuste preklinische evaluatie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van oogtherapeutische kandidaat-medicijnen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist technische expertise in microdissectie en technieken voor primaire celkweek.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie zoals laminaire flow-kappen, incubatoren en analytische instrumenten voor TER- en fagocytose-assays.
- Necessiteert een strikte standaardisatie tussen teams om reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens te garanderen.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende muizenstammen of ziektemodellen, afhankelijk van de experimentele doelen.
- Levensvatbaarheid en opbrengst zijn gevoelig voor de dissectietijd, de versheid van reagentia en contaminatiebeheersing.
