Name: Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Leer tumorallotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare autoinjector. Deze methode verhoogt de efficiëntie, snelheid en opbrengst van tumoronderzoek voor kankerstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de voormalige lableden Dr. Sheng-An Yang en de heer Juan-Martin Portilla voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van dit protocol. We zijn dankbaar voor het laboratorium van Dr. Yan Song aan de Peking University School of Life Sciences voor het delen van hun protocol over handmatige allotransplantatie. We bedanken ook de heer Calder Ellsworth en de heer Everest Shapiro voor het kritisch lezen van het manuscript.
WMD ontving financiering (GM072562, CA224381, CA227789) voor dit werk van het National Institute of Health (https://www.nih.gov/) en financiering (IOS-155790) van de National Science Foundation (htps://nsf.gov/). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

1. Voorbereiding van SG imaginaire ringtumor
<ol><li>Kruis volwassen vliegen met genotypen van UAS-NICD (Mannetje: 10-15 vliegen) en Act-Gal4, UAS-GFP / CyO; tub-Gal80ts (Virgin female: 10-15 vliegen) en laat ze 1 dag broeden bij 18 ° C. De geselecteerde volwassen vliegen moeten 5-9 dagen oud zijn om een hoge vruchtbaarheid te garanderen.</li>
	<li>Laat de volwassen vliegen eieren leggen in het vliegenvoer in injectieflacons gedurende 24 uur bij 18 °C en verwijder vervolgens de volwassen vliegen. OPMERKING: Vliegenvoer wordt bereid met behulp van het standaard maïsmeelvoedselrecept van Drosophila Stock Center8. Elke injectieflacon moet ongeveer 10 ml vliegenvoer bevatten.</li>
	<li>Laat de eieren 6 dagen uitbroeden bij 18 °C. Tijdens deze periode zullen de larven uitkomen.</li>
	<li>Breng de injectieflacons met larven over naar een incubator van 29 °C en incubeer nog eens 7 dagen. OPMERKING: Deze incubatiestap is optioneel, afhankelijk van het specifieke experimentele ontwerp.</li>
</ol>2. Bereiding van volwassen wild type Drosophila voor allotransplantatie
<ol><li>Verdoof wilde of geschikte gemuteerde volwassen vliegen met 100% CO2 en sorteer vliegen op basis van geslachten. Zowel mannelijke als vrouwelijke vliegen kunnen worden gebruikt als tumorgastheren.</li>
	<li>Bevestig een 5 cm lang stuk vliegentape aan een microscoopglaasje met de kleverige kant naar boven door het te bevestigen met twee kleinere stukjes tape, één aan elk uiteinde.</li>
	<li>Immobiliseer de vliegen door hun vleugels aan de tape te hechten. Gebruik een tang tijdens het manoeuvreren van de vliegen.<ol>
<li>Herhaal de bovenstaande stap voor 60-80 volwassen vliegen die worden gebruikt als allograft-acceptanten. OPMERKING: Het is het beste om vliegen in nette rijen te organiseren, met hun lichaamsas parallel aan elkaar uitgelijnd voor een tijdsefficiënter injectieproces later. Figuur 1 toont rijen gastheervliegen die op deze manier zijn afgeplakt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montage van het auto-injectorapparaat
<ol><li>Sluit zowel het autoinjectorapparaat als het netsnoer aan op de controllerbox.<ol>
<li>Stel het injectievolume in op 59,8 nL. Dit zal helpen om de juiste hoeveelheid zuig- en injectiekrachten te behouden tijdens allotransplantatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de controllerbox en de autoinjector aan weerszijden van de lichtmicroscoop. OPMERKING: Voor rechtshandige operators moet de besturingskast aan de linkerkant van de microscoop worden geplaatst met de injector aan de rechterkant. Andersom voor linkshandige operators.</li>
	<li>Bereid het 3,5'' glazen capillair voor gebruik voor door het gesloten uiteinde met een tang af te knippen.<ol>
<li>Verwerk het ene uiteinde van het glazen capillair met behulp van een viertraps micropipettetrekker en verwarm tot een smal, gesloten uiteinde met behulp van de volgende specificaties in het instrument: Warmte = 650, Kracht = 200 en Afstand = 8. Plaats de haarvaten netjes in het trekkerapparaat en voer het programma uit na het invoeren van de bovenstaande instellingen.</li>
		<li>Gebruik een tang om het capillair in een hoek van ongeveer 60° te klikken om een scherper uiteinde te maken voor gemakkelijke toegang tot de buikvan de volwassen vlieg 1. Zie figuur 2 voor een voorbeeld van een goed geknipt capillair.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schroef de dop van de injector lichtjes los. Houd de knop Leeg ingedrukt om de injectornaald vooruit te helpen totdat 70% -80% van de totale lengte wordt weergegeven. Om de capillaire vooruitgang te versnellen, drukt u eenmaal op de knop Vullen terwijl u tegelijkertijd de knop Leeg ingedrukt houdt.</li>
	<li>Gebruik een spuit om het glazen capillair te vullen met minerale olie. Steek vervolgens voorzichtig het glazen capillair op de injectornaald totdat de eerste stevig is bevestigd aan de rubberen stop van de injector. Schroef nu de injectordop strak.<ol>
<li>Veeg de minerale olieresten op het buitenoppervlak van de glazen capillaire afdekking om besmetting van het medium tijdens allotransplantatie te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Dissectie van de SG imaginaire ringtumor
<ol><li>Selecteer een van de larven en breng deze over naar een dissectieplaat gevuld met 100 μL Schneider's Medium om zich voor te bereiden op SG imaginaire ringtumordissectie. OPMERKING: Alleen de exemplaren die de tumor herbergen, blijven als larven over. Dit komt omdat tumorgroei de ontwikkeling en progressie van larven vertraagt9. Tweederde van de exemplaren zal de tumor niet herbergen en zal dus geëvolueerd zijn tot poppen/volwassenen.<ol>
<li>Gebruik voor dissectie- en allotransplantatiedoeleinden een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van 10x-20x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik een tang om het middengedeelte van het larvale lichaam vast te houden, knijp de larvale kop met behulp van een ander paar tangen en oefen een rekkracht in de lengte aan.</li>
	<li>Lokaliseer de Y-vormige SG van de larven en isoleer deze van de rest van het larvale weefsel10.</li>
	<li>Ontleed en isoleer de SG imaginaire ringtumor door het aangrenzende weefsel te verwijderen. Zie figuur 3 voor een weergave van dit dissectieproces.</li>
	<li>Herhaal stap 4.1-4.4 voor nog eens 10 tot 20 SG imaginaire ringtumoren op basis van onderzoeksbehoeften.</li>
</ol>5. Allograft van primaire SG imaginaire ringtumor
<ol><li>Dompel het capillair onder in het Schneider's Medium met de primaire SG imaginaire ringtumoren. Houd de vulknop ingedrukt om het glazen capillair te vullen met Schneider's Medium helemaal tot aan het bovenste segment van 0,5 cm. Dit topsegment moet gevuld blijven met minerale olie. OPMERKING: Versnel dit proces door eenmaal op de knop Leeg te drukken en tegelijkertijd de knop Vullen ingedrukt te houden.</li>
	<li>Lokaliseer een primaire tumor en druk op de vulknop totdat de tumor in het capillair wordt gezogen.<ol>
<li>Zorg ervoor dat de tumor zich aan de punt van het capillair bevindt of enkele millimeters verwijderd van de punt van het capillair. Dit helpt voorkomen dat de tumor afdrijft en verloren gaat in de oplossing in het capillair. Zie figuur 4A voor een demonstratie van de juiste tumorlocatie zoals deze zich in het capillair bevindt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lokaliseer een volwassen vlieg die is geïmmobiliseerd op de tape op de microscoopglaasje. Gebruik een tang om de onderbuik voorzichtig vast te houden. Doorboort vervolgens de onderste laterale cuticula van de buik met het capillair. Druk op de knop Leeg totdat de tumor de nieuwe buik van de gastheer binnendringt. Zie figuur 4B voor een demonstratie van deze techniek.</li>
	<li>Knijp met behulp van een tang voorzichtig de vleugels van de gastheer omhoog om deze van de tape te verwijderen. Plaats de hostie in een nieuwe injectieflacon met vers voedsel. Het is het beste om de injectieflacon zijwaarts te plaatsen gedurende de eerste 24 uur na injectie. Elke injectieflacon mag maximaal 20 vliegen bevatten. OPMERKING: Sommige gastheervliegen hebben ontbrekende vleugels en andere wonden op hun lichaam na injectie en kunnen aan het vliegenvoedsel blijven plakken als de injectieflacon rechtop wordt geplaatst.</li>
	<li>Herhaal stap 5.2 tot en met 5.4 om de resterende primaire tumoren te transplanteren in hun nieuwe volwassengastheren.
</li>
	<li>Gooi haarvaten in de container van de scherpe voorwerpen en reinig de minerale olieresten van de buitenkant van de autoinjector voordat u het apparaat terug in de doos vervangt.</li>
	<li>Bewaar de injectieflacon met gastheren gedurende 1 dag bij kamertemperatuur en breng de injectieflacon vervolgens over naar een incubatiekamer bij 29 °C. Breng vlieghosts elke 2-3 dagen over naar nieuwe injectieflacons.</li>
	<li>Monitor de vlieghosts dagelijks en bereken overlevingskansen. Na een week moeten tumoren zichtbaar zijn onder een stereomicroscoop met fluorescentieadapter en kunnen ze voortdurend worden gecontroleerd op hun grootte en progressie.</li>
</ol>6. Re-allograft van getransplanteerde tumoren
<ol><li>Ongeveer 10-14 dagen na allograft, screenen op tumoren die in de buik van de gastheer zijn gegroeid met behulp van een fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Verdoof een gastheer met CO2 en plaats deze in een dissectieplaat gevuld met 100 μL Schneider's Medium. Ontleed de gegroeide allografted tumor uit de gastheer met behulp van twee paar tangen.<ol>
<li>Gebruik een tang om de buik vast te houden en het andere paar om de buikschubben open te snijden, waardoor de allografted tumorwordt blootgesteld 1.</li>
		<li>Isoleer de tumor zorgvuldig zoveel mogelijk uit de aangehechte gastheerweefsels met behulp van fluorescentiemarkers als leidraad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal stap 6.2 om u voor te bereiden op twee tot drie extra gealgrepeerde tumoren.</li>
	<li>Breng de dissectieplaat met de geoogste tumoren over op het stadium van een lichtmicroscoop.</li>
	<li>Gebruik steriele naalden en ontleed de tumoren in kleinere stukjes die geschikt zijn voor de capillaire grootte.</li>
	<li>Herhaal stap 4.1-4.5 om de nieuwe generatie volwassen gastheren voor te bereiden en herhaal stap 5.1-5.7 om de allotransplantatie van de tumoren te voltooien. OPMERKING: Succespercentages zijn over het algemeen hoger voor niet-primaire tumoren in vergelijking met die van primaire tumoren.</li>
	<li>Herhaal stap 6.1-6.6 voor elke volgende generatie vliegen die in het onderzoek is gebruikt. OPMERKING: Kies Drosophila-hostlijnen die geschikt zijn voor de experimentele behoeften.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+tumor+growth+in+Drosophila+using+the+tissue+allograft+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).</li>
<li>Magadi, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Hes-centred+transcriptional+networks+in+neural+stem+cell+maintenance+and+tumorigenesis+in+Drosophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia.</a> Development. 147 (22), (2020).</li>
<li>Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaller%2C+S+%22Pseudomonas+Methods+and+Protocols%22">Pseudomonas Methods and Protocols</a>. , Springer. 723-740 (2014).</li>
<li>Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+protocol+for+the+African+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%2C+by+means+of+nano-injection%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection.</a> African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).</li>
<li>Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+nanoinjection+and+electrophysiology+assay+to+screen+for+bioactivity+of+compounds+using+the+Drosophila+melanogaster+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).</li>
<li>Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+notch+triggers+neoplastic+tumorigenesis+in+a+transition-zone-like+tissue+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment.</a> Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BDSC+Cornmeal+Food%22">BDSC Cornmeal Food</a>. , (2020).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
<li>Kennison, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+larval+salivary+glands+and+polytene+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Ji, H., Han, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LarvaSPA%2C+a+method+for+mounting+drosophila+larva+for+long-term+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).</li>
<li>Mirzoyan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+organism+to+study+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer.</a> Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).</li>
<li>Bangi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+at+the+intersection+of+infection%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).</li>
<li>Saavedra, P., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+tumor-induced+organ+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+drosophila+tumors+interrupt+insulin+signaling+to+induce+cachexia-like+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting.</a> Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Koyama, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bellymount+enables+longitudinal%2C+intravital+imaging+of+abdominal+organs+and+the+gut+microbiota+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila.</a> PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten te melden tussen de auteurs.

Tumor allotransplantatie kan onderzoekers helpen bij het aanpakken van bepaalde problemen die zich voordoen tijdens de groei en progressie van Drosophila-tumoren. Een van die uitdagingen is het omzeilen van voortijdige sterfgevallen van tumordragende larven of volwassenen tijdens primaire tumorkweek12. In deze context zorgt voortdurende tumorallotransplantatie ervoor dat tumoren voor onbepaalde tijd kunnen groeien, wat longitudinale studies van tumorgroei, metastase en evolutie vergemakke...

Dit protocol biedt een stapsgewijze begeleiding voor allotransplantatie van Drosophila larvale speekselklier (SG) imaginaire ringtumoren in buiken van volwassen gastheren met behulp van een auto-nanoliter injectieapparaat (bijv. Nanoject). Dit protocol geeft ook aanwijzingen voor de daaropvolgende re-allografatie van tumoren in nieuwe generaties volwassen gastheren, wat mogelijkheden biedt voor voortdurende longitudinale studie van tumorkenmerken, zoals tumorevolutie en tumor-gastheerinteracties. Het protocol kan ook worden toegepast op experimenten met het screenen van geneesmiddelen.
Deze methode is ontwikkeld om de werkzaamheid van het uitvoeren van tumor allotransplantatie in Drosophila te verbeteren met behulp van handmatige injectoren1, die vaak inconsistent zijn in hun zuig- en injectiekrachten, wat leidt tot suboptimale resultaten voor tumor allotransplantatie. Een autoinjectorapparaat zorgt voor een betere controle en kan resulteren in lagere vliegsterfte na allograft. Een getrainde operator kon een gastheeroverleving van meer dan 90% bereiken met de autoinjector, vergeleken met ongeveer 80% wanneer de handmatige injector werd gebruikt1. Het totale tumoracquisitiepercentage is 60% -80% op dag 8-12 post-allograft. De gemiddelde injectietijd is ook verbeterd van 30-40 s per vlieg met behulp van een handmatige injector tot 20-25 s per vlieg met behulp van de autoinjector.
Dit protocol is een van de eerste protocollen om het autoinjectorapparaat te gebruiken bij Drosophila tumor allotransplantatie. Een recente studie gebruikte ook de autoinjector voor allotransplantatie van tumorachtige neurale stamcellen2. Eerder werd het autoinjectorapparaat gebruikt in Drosophila om bacteriële virulentie3, parasitaire infecties en gastheerverdediging4 te bestuderen, evenals screening op bioactiviteit van verschillende verbindingen5. Ons protocol past het autoinjectorapparaat aan voor het gebruik van tumorinjecties en probeert Drosophila-onderzoekers een hogere kwaliteit en consistentere resultaten te bieden, terwijl ze veel tijd besparen. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor de allotransplantatie van tumoren, maar kan ook worden afgestemd op de allotransplantatie van wildtype en mutante weefsels van vergelijkbaar kaliber6.
De Drosophila NICD-tumor die in dit protocol wordt gebruikt, werd voor het eerst geïntroduceerd door Yang et al.7 in de SG imaginaire ringovergangszone, een "tumorhotspot" die hoge niveaus van endogene Janus Kinase / Signaaltransducer en Activators van Transcriptie (JAK-STAT) vertoont, en c-Jun N-terminal Kinase (JNK) activiteit. Bovendien heeft de overgangszone hoge niveaus van matrix metalloproteinase-1 (MMP1)7, waardoor dit gebied bijzonder bevorderlijk is voor tumorigenese. Notch pathway activatie door NICD overexpressie alleen is voldoende om consequent tumorvorming te initiëren. Deze tumoren kunnen vervolgens worden allotransplanteerd om onderzoek van een breed scala aan onderwerpen mogelijk te maken, waaronder tumorceldeling, invasie en tumor-gastheerinteracties.

<table><tbody><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 980</td><td>Ook bekend als "Zeiss LSM 980"</td></tr><tr><td>Cornmeal Fly Food</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>N/A</td><td>Ook bekend als "BDSC Standard Cornmeal Food"</td></tr><tr><td>Dissection Needle (30Gx1/2)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td></td></tr><tr><td>Fly Tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015A</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresence Adapter voor Stero Microscoop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-UV</td><td>Ook bekend als "NightSea Fluorescence Adapter"</td></tr><tr><td>Fluoresence Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td>Ook bekend als "Zeiss Stereo Discovery.V8"</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Ook bekend als "Dumont #5 Forceps"</td></tr><tr><td>Glass Capillary (3.5'')</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Lijm</td><td>Elmer</td><td>E305</td><td>Ook bekend als "Elmer Washabale Clear Glue"</td></tr><tr><td>Licht Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>435063-9010-100</td><td>Ook bekend als "Zeiss Stemi 305"</td></tr><tr><td>Micropipet Puller</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Ook bekend als "Four Step Micropipette Puller"</td></tr><tr><td>Nanoject Apparaat</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Ook bekend als "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"</td></tr><tr><td>Schneider's Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>21720001</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (27G x1/2)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Flesje</td><td>Fisherbrand</td><td>AS507</td><td></td></tr></tbody></table>

tumor allotransplantatie in drosophila melanogaster met een programmeerbare auto-nanoliter injector

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

Dit protocol beschrijft de allotransplantatie van tumoren in Drosophila melanogaster met behulp van een auto-nanoliter injectieapparaat. Met het gebruik van een autoinjectorapparaat kunnen getrainde operators efficiëntere en consistentere transplantatieresultaten bereiken in vergelijking met die verkregen met behulp van een handmatige injector. Hier behandelen we onderwerpen op een chronologische manier: van het kruisen van Drosophila-lijnen tot de inductie en dissectie van de primaire tumor, transplantatie van de primaire tumor in een nieuwe volwassen gastheer en voortgezette generatietransplantatie van de tumor voor uitgebreide studies. Als demonstratie gebruiken we hier Notch intracellulair domein (NICD) overexpressie geïnduceerde speekselklier imaginaire ringtumoren voor generatietransplantatie. Deze tumoren kunnen eerst betrouwbaar worden geïnduceerd in een micro-omgeving van de overgangszone binnen larvale speekselklier imaginaire ringen, vervolgens allografeerd en gekweekt in vivo om verdere tumorgroei, evolutie en metastase te bestuderen. Deze allotransplantatiemethode kan nuttig zijn in potentiële screeningsprogramma's voor geneesmiddelen, evenals voor het bestuderen van tumor-gastheerinteracties.

Hier voerden we generatie-allotransplantatie van SG-imaginaire ringtumoren uit met behulp van het nanoliter-injectieautoinjectorapparaat en voerden we daaropvolgende tumor live-imaging uit met een confocale laserscanmicroscoop, wat een diepere duik mogelijk maakte in onderwerpen van tumorgroei, tumorcelmigratie en tumor-gastheerinteracties. Bij het monteren van vliegen lijm je ze op een microscoopglaasje en houd je ze vast via een polydimethylsiloxaan (PDMS) blok11.
<st...

Dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor de initiële en voortgezette generatie allotransplantatie van Drosophila-tumoren in de buik van volwassen gastheren voor het bestuderen van verschillende aspecten van neoplasie. Met behulp van een auto-injectorapparaat kunnen onderzoekers verbeterde efficiëntie en tumoropbrengsten bereiken in vergelijking met die bereikt door traditionele, handmatige methoden.

Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Dit protocol is een van de eerste om het gebruik van een auto-injectorapparaat bij Drosophila tumor allotransplantatie te beschrijven. Een onderwerp dat de laatste jaren in populariteit is gegroeid. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het de efficiëntie van kankeronderzoek in Drosophila verhoogt door de snelheid, consistentie en opbrengst van tumor allotransplantatie te verbeteren.Tumor allotransplantatie in Drosophila is een delicate techniek die moeilijk onder de knie te krijgen kan zijn. Wees geduldig en vertrouw erop dat oefening kunst baart. Nadat u de vliegen hebt gekruist en de eieren zes dagen bij 18 graden Celsius hebt uitgebroed, brengt u de injectieflacons met de uitgekomen larven over naar een broedmachine op 29 graden Celsius.Sorteer het verdoofde wilde type of gemuteerde volwassen vliegen op basis van hun geslacht. Bevestig een vijf centimeter lang stuk vliegenlint aan een microscoopglaasje met de kleverige kant naar boven. Immobiliseer de vliegen door hun vleugels met een tang aan de tape te bevestigen.Plaats de controllerbox en de autoinjector aan weerszijden van de lichtmicroscoop. Verwerk het ene uiteinde van het glazen capillair met behulp van een viertraps micropipettrekker en verwarm het tot een smal gesloten uiteinde. Gebruik een tang om het capillair in een hoek van ongeveer 60 graden te klikken om een 3,5 inch glazen capillair te bereiden.Schroef de dop van de injector lichtjes los. Houd de lege knop ingedrukt om de injectornaald vooruit te helpen totdat 70 tot 80% van de totale lengte wordt weergegeven. Gebruik een spuit om het glazen capillair te vullen met minerale olie.Selecteer een van de larven en breng over naar een dissectieplaat gevuld met 100 microliter Schneider's Medium om zich voor te bereiden op SG imaginaire ringtumordissectie. Gebruik een tang om de middensectie van het larvale lichaam vast te houden, knijp de larvale kop met behulp van een ander paar tangen en oefen een rekkracht in de lengte aan. Lokaliseer en isoleer de Y-vormige SG van de larven en ontleed vervolgens de SG-denkbeeldige ringtumor door het aangrenzende weefsel te verwijderen.Vul het glazen capillair met Schneider's Medium helemaal tot aan het bovenste segment van 0,5 centimeter door de vulknop ingedrukt te houden. Lokaliseer een primaire tumor en druk op de vulknop totdat de tumor in het capillair wordt gezogen. Zorg ervoor dat de tumor zich aan de punt van het capillair bevindt of enkele millimeters verwijderd van de punt van het capillair.Zoek een volwassen vlieg die op de tape is geïmmobiliseerd. Gebruik vervolgens een tang om de onderbuik voorzichtig vast te houden en de onderste laterale cuticula van de buik te doorboren met het capillair. Druk op de lege knop totdat de tumor de buik van de nieuwe gastheer binnendringt.Knijp met behulp van een tang voorzichtig de vleugels van de gastheer omhoog om deze van de tape te verwijderen. Plaats het vervolgens in een nieuwe injectieflacon met vers voedsel. Screen op tumoren die ongeveer 10 tot 14 dagen na de allografie in de buik van de gastheer zijn gegroeid met behulp van een fluorescentiemicroscoop en ontleed de gegroeide allografted tumor uit de gastheer met behulp van twee paar tangen.Gebruik een tang om de buik vast te houden en het andere paar om de buikschubben open te snijden, waardoor de allografted tumor wordt blootgesteld. Isoleer de tumor zorgvuldig uit de bijgevoegde gastheerweefsels. Gebruik steriele naalden en ontleed de tumoren in kleinere stukjes die geschikt zijn voor de capillaire grootte.Herhaal dit proces voor een nieuwe generatie volwassen gastheren om de allotransplantatie van de tumor te voltooien. Het proces van tumorontwikkeling werd gevolgd door live beeldvorming van een eerste generatie SG imaginaire ringtumor die groeit in een volwassen gastheerbuik op dag 10, post-allotransplantatie. Een zesde generatie SG imaginaire ringtumor die een groot deel van de buik van de gastheer bezet op dag 10, post-allotransplantatie wordt hier getoond.Beeldvorming in dit stadium kan helpen bij het onthullen van tumorgroeipatronen, evenals het migratie- en invasiegedrag. Tumortransplantatie is een geweldige techniek voor longitudinale studies voor tumorprogressie, evolutie en een metastase. Resultaten van groot belang, voor het bestuderen van tumor gastheer interacties.Deze proto heeft een groot potentieel in kankermedicijnen die de medicijnen Temodal gebruiken. Met behulp van deze techniek kunnen onderzoekers aanzienlijke tijd en moeite besparen in het onderzoek.

tumor-allotransplantation-drosophila-melanogaster-with-programmable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Samenwerking tussen een geactiveerd oncogen zoals RAS V12 en mutaties in cel polariteit genen zoals gekrabbeld, leiden tot tumorgroei in Drosophila waar tumorcellen ook weergeven invasief gedrag. Hier een eenvoudig protocol voor de inductie en observatie van de goedaardige en invasieve tumoren wordt gepresenteerd.

Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

De transplantatie van kankercellen is een belangrijk instrument voor de identificatie van kankermechanismen en therapeutische reacties. Huidige technieken zijn afhankelijk van immuun-incompetente dieren. Hier beschrijven we een methode om zebravis tumorcellen te transplanteren in immuun-competente embryo's voor de langetermijnanalyse van tumorcelgedrag en in vivo drugresponsen.

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Het doel van deze methode is het genereren van een in vivo model van tumor angiogenese door xenotransplanterende tumorcellen van zoogdieren tot een embryo van zebravis dat fluorescently gelabelde bloedvaten heeft. Door beeldvorming van de xenotransplantaatmodellen is en geassocieerde vaten kan een kwantitatieve meting van de angiogene respons worden verkregen.

In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts

Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo's dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.

Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor geautomatiseerde implantatie van tumorxenotransplantaat in zebravislarven met behulp van een state-of-the-art robotinjectiesysteem. Bovendien presenteren we injectievideo's en validatiegegevens die de succesvolle prestaties van het systeem aantonen.

Automatisering van tumorimplantatie in zebravislarven voor kankeronderzoek en geneeskunde

Dit protocol beschrijft de in vivo herprogrammering van muizenkankercellen tot type 1 dendritische-achtige cellen binnen de tumormicro-omgeving door middel van geforceerde expressie van de transcriptiefactoren PU.1, IRF8 en BATF3.

Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

Met de toenemende interesse in intratumorale immunotherapie is het kiezen van tumormodellen die toegankelijk en praktisch zijn, van essentieel belang. Subcutane tumoren zijn gemakkelijk vast te stellen, maar moeilijk te visualiseren en te manipuleren. In dit protocol beschrijven we methoden om intradermale tumoren te genereren die zorgen voor betere zichtbaarheid en toegankelijkheid.

Intradermale tumorimplantatie als robuust model voor intratumorale immunotherapiestudies bij muiskanker

Leer tumorallotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare autoinjector. Deze methode verhoogt de efficiëntie, snelheid en opbrengst van tumoronderzoek voor kankerstudies.

Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector

Meer video's verkennen