Multiplexed analyse van retinale genexpressie en chromatinetoegankelijkheid met behulp van scRNA-Seq en scATAC-Seq

Dit protocol maakt het gebruik van eencellige RNA-seq mogelijk voor initiële fenotypering. En, in combinatie met eencellige ATAC-seq, de reconstructie van genregulerende netwerken. Het gebruik van MULTI-seq houdt de kosten laag voor initieel onderzoek, en het fixeren van gepaarde monsters voor single-cell RNA-seq en single-cell ATAC-seq maakt tijdsverloopanalyse van genregulerende netwerken mogelijk.

Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken om de genetische netwerken te begrijpen die de ontwikkeling en ziekteprogressie beheersen. Voeg om te beginnen 20 microliter ankercode-oplossing toe aan elk monster en pipetteer het om te mengen. Incubeer het vijf minuten op ijs.

Voeg vervolgens 20 microliter co-ankeroplossing toe aan elk monster en incubeer nog eens vijf minuten op ijs. Voeg een milliliter ijskoude 1% BSA en PBS toe aan elk monster en centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant zonder de celkorrel te verstoren.

Voeg vervolgens 400 microliter ijskoude 1% BSA en PBS toe. Centrifugeer bij 300 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Bepaal de concentratie van cellen voor elk monster met behulp van een hemocytometer en bereken het totale aantal cellen en het volume dat nodig is voor Gel Bead-in-Emulsion of GEM.

Combineer de berekende volumes van elk monster in een nieuwe steriele buis van 1,5 milliliter en bepaal de uiteindelijke celconcentratie van de gecombineerde monsters. Na gem-generatie en barcodering voert u genexpressie cDNA-opschoning uit met behulp van grootteselectie, waarbij u ervoor zorgt dat u het supernatant uit de eerste selectieronde, die de voorbeeldcode bevat, niet weggooit. Breng het supernatant over in een nieuwe steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar deze op ijs.

Vortex het op paramagnetische kraal gebaseerde grootteselectiereagens en voeg 260 microliter van het reagens en 180 microliter 100% isopropanol toe aan het supernatant. Pipetteer het mengsel 10 keer en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis op een magnetisch rek en wacht tot de oplossing is verdwenen.

Zodra de oplossing helder is, verwijdert u het supernatant en gooit u het weg. Voeg 500 microliter 80% ethanol toe aan de kralen gedurende 30 seconden en gooi het supernatant vervolgens weg. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten.

Centrifugeer de kralen kort en breng ze terug naar het magnetische rek. Stel de timer in op twee minuten. Verwijder vervolgens de resterende ethanol met een P10-pipet en droog de kralen op het magnetische rek aan de lucht gedurende de resterende twee minuten.

Verwijder de kralen uit het magnetische rek en resuspenseer ze in 100 microliter elutiebuffer. Pipetteer grondig om te resuspenderen en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, breng de kralen vervolgens terug naar het magnetische rek en wacht tot de oplossing is verdwenen. Breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Herhaal de opschoning zoals gedemonstreerd, met behulp van de helft van het volume van de elutiebuffer. Voor de monsters die bestemd zijn voor scATAC-sequentie, verwijdert u alle vloeistof uit de microcentrifugebuis met behulp van een P200-pipet en bevriest u de monsters in ethanoldroogijs. Om de cellen in de monsters die bestemd zijn voor scRNA-sequencing te dissociëren, voert u de dissociatiestappen uit met papaïne, zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Voeg een milliliter gekoeld PBS toe en meng 10 keer of totdat de cellen volledig zijn gesuspendeerd. Nogmaals, centrifugeer op 300 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en herhaal de was met PBS twee keer.

Begin met het vortexen van de buis op de laagste snelheidsinstelling en voeg druppel voor druppel 900 microliter gekoelde methanol toe, terwijl je de buis voorzichtig blijft vortexen om te voorkomen dat de cellen samenklonteren. Incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten. Bepaal de concentratie van de vaste cellen met behulp van een hemocytometer en beoordeel de werkzaamheid van de fixatiestap met behulp van trypan blue.

Bewaar het ingevroren weefsel en de vaste cellen bij min 80 graden Celsius. MULTI-sequentie barcoding maakt de gecombineerde sequencing van meerdere monsters en hun daaropvolgende computationele deconvolutie mogelijk. Het voorbeeld van oorsprong kan voor elke cel worden bepaald op basis van hun streepjescode-expressie.

Deze gecombineerde monsters kunnen worden geanalyseerd als een enkele dataset met het oog op celclustering en celtype-identificatie. Omdat elke cel een streepjescode heeft vóór de GEM-generatie, hebben cel doubletten een grote kans om expressie te tonen voor meerdere MULTI-sequentie barcodes, en een meerderheid van de doubletten kan daarom worden geïdentificeerd en verwijderd voorafgaand aan clustering en identificatie van het celtype. De single-cell ATAC sequencing kan worden gebruikt om een dataset te genereren met celtypen die overeenkomen met die gevonden door single-cell RNA sequencing.

De koppeling van single-cell RNA sequencing genexpressie en single-cell ATAC sequencing DNA toegankelijkheidsinformatie maakt de reconstructie van genregulerende netwerken mogelijk. Houd er bij het proberen van het protocol rekening mee dat de timing van twee minuten van de ethnolverdamping cruciaal is voor het ophalen van de sequentie in de daaropvolgende elutiestappen. Het reconstrueren van genregulerende netwerken met behulp van gepaarde eencellige RNA-seq en single-cell ATAC-seq produceert doelen voor genoverexpressie en knock-outstudies.

MULTI-seq kan in dit stadium worden gebruikt om celtypespecifieke effecten te identificeren.