Name: Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer FRET-kwantificering in levende cellen met confocale laserscanmicroscopie en GFP-mCherry fusieprobes. Deze methode detecteert eiwitinteracties in real-time en verschillende celcompartimenten voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de Neuroscience Imaging Service van Stanford University School of Medicine bedanken voor het leveren van apparatuur en ruimte voor dit project. Dit onderzoek werd ondersteund door intramurale financiering van het Stanford Cancer Institute en de Gynecologic Oncology Division Stanford, evenals GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 van het National Research, Development and Innovation Office, Hongarije.

1. Plasmide constructie
<ol><li>Gebruik voor het genereren van de eGFP-mCherry1-fusiesonde een N1-zoogdiercelexpressievector (zie materiaaltabel) met mCherry110 ingevoegd met behulp van de restrictiesites AgeI en BsrGI.</li>
	<li>Gebruik de volgende oligonucleotiden om eGFP11 te versterken zonder stopcodon als SalI-BamHI-fragment : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' en C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.</li>
	<li>Plaats dit SalI-BamHI-fragment in de meervoudige kloonplaats van de N1-vector om RNPPV-linker (vijf aminozuur) tussen het groene en rode fluorescerende eiwit te introduceren. OPMERKING: Deze linker levert een gemiddelde FRET-efficiëntie op voor het GFP-Cherry donor-acceptorpaar van ongeveer 0,25 -0,3 (figuur 1A). De keuze van stijve12 en spiraalvormige13 linkers van verschillende lengtes om gemeten FRET-efficiënties op schaal te schalen, is elders besproken, maar is niet vereist voor ons doel van het fusie-eiwit. In de toekomst zullen we voor de eenvoud de fluorescerende eiwitten 'GFP' en 'Cherry' noemen.</li>
</ol>2. Celkweek en transfectie
<ol><li>Gebruik elke cellijn, bijvoorbeeld NRK-cellen, voor FRET-experimenten in media, bijvoorbeeld Dulbecco's gemodificeerde Eagle's media (DMEM), zonder fenolrood, om achtergrondfluorescentie te verminderen. Om dezelfde reden wordt het gebruik van fenolrode vrije trypsine geadviseerd.</li>
	<li>Zodra cellen voor 80% confluent zijn, maakt u cellen los met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA, telt u het aantal cellen in suspensie met behulp van een Neubauer-kamer en zaait u ongeveer 10.000 cellen per put van een 8-well chambered cover glass; als alternatief, uit een confluente celcultuur gekweekt in T25-kolf, gebruik 1 druppel celsuspensie uit een pipet van 2 ml of 3 druppels uit een celsuspensie van 5 ml uit een confluente cultuur gekweekt in een T 12,5-celkweekkolf.</li>
	<li>Kweek cellen in 8-well kamers (0,8 cm 2/ put) met #1.0 afdekglas voor fluorescentie live-cell microscopie bij standaard celkweekomstandigheden (37°C en 5% CO2).</li>
	<li>24 h na het bekleden transfecteren de cellen met behulp van een geschikt in de handel verkrijgbaar transfectiemedium (zie materiaaltabel), met GFP, Cherry, GFP/ Cherry mix (1:1 mix, d.w.z. 0,8 μg en 0,8 μg GFP en Cherry plasmide DNA), en de GFP-Cherry chimera.<ol><li>Gebruik voor transfectie 5 μL van het transfectiereagens in 45 μL DMEM en 1,6 μg plasmide-DNA. Roer door de microcentrifugebuis voorzichtig te vegen.</li>
		<li>Voeg na 15 minuten incubatie van het mengsel bij kamertemperatuur 1-2 μL van het transfectiereagensmengsel toe aan elk putje van de 8-well kamerschuif. Breng het kamerdekselglas terug naar de incubator.</li>
	</ol></li>
	<li>Laat 20 uur na transfectie verstrijken voordat live-cell beeldvorming plaatsvindt, om een goede fluorescerende eiwitexpressie, vouwing en rijping mogelijk te maken, vooral van de rode fluorofoor.</li>
</ol>3. FRET beeldvorming
<ol><li>Beeld getransfecteerde cellen in een bevochtigde en verwarmde omgevingskamer bij 37 °C. Om de celmedia te bufferen bij fysiologische pH, gebruikt u CO 2-gas ingesteld op 5% stroom of voegt u 20 mM HEPES toe om de celmedia CO2-onafhankelijk te maken.</li>
	<li>Gebruik een confocale laserscanmicroscoop. Stel de excitatie en emissie als volgt in om het signaal te optimaliseren en cross-talk te minimaliseren.<ol><li>Gebruik de 488-nm-lijn van de argon-ionlaser om GFP te prikkelen en de 561-nm diode gepompte solid-state laser (of 543-nm Helium Neon-laser, afhankelijk van beschikbare laserlijnen) om Cherry te prikkelen.</li>
		<li>Stel het volgende in de software van een commerciële confocale microscoop in. Stel de Dichroic spiegel in op 488/ 561 door met de knop te klikken via het vervolgkeuzemenu. Verzamel fluorescentie met behulp van 488-nm laserlicht voor excitatie in kanaal 1 door een emissieband van 505 - 530 nm (of 505 - 550 nm) en in kanaal 2 met een langdoorlaatfilter >585 nm en gebruik het 561-nm laserlicht voor excitatie in kanaal 3 met een langdoorlaatfilter > 585 nm (type in golflengten). Banddoorlaatfilters, bijvoorbeeld 590 - 650 nm of iets dergelijks, kunnen ook worden gebruikt die het voordeel hebben dat Raman-verstrooiing wordt uitgesloten.</li>
	</ol></li>
	<li>Exciciteer achtereenvolgens met de twee lasers en stel de beeldmodus in op Schakelen na elke lijn, zodat de excitatie van het beeld van 512 x 512 pixels na elke regel wordt afgewisseld (en niet na elk frame, waardoor de mogelijkheid om FRET te detecteren als gevolg van diffusie van de gelabelde eiwitten tijdens het opnemen van de beelden met verschillende excitaties zou verdwijnen; klik op de knop).</li>
	<li>Stel een mini-tijdreeks van drie afbeeldingen in door op de knop te klikken om te detecteren of er significante fotobleaching optreedt en mogelijk het laservermogen te verminderen. Fotobleking van minder dan 1% is optimaal. Een hoge laserintensiteit kan ook leiden tot absorptieverzadiging die de schijnbare FRET-efficiëntie vermindert14. Laservermogen, tot 10-20 μW gemeten op de objectieflens zijn veilig in gebruik.</li>
	<li>Ten eerste, beeldcellen die het GFP-Cherry fusieconstruct uitdrukken. Stel de parameters in die de tijdgeïntegreerde laserintensiteit per pixel in een confocaal beeld definiëren, d.w.z. de verblijftijd van de pixel in microseconden, de acousto-optische afstembare filter (AOTF) transmissie in procenten en de zoom.<ol><li>Afbeeldingscellen met een olieobjectief van 63x en Zoom ingesteld op 3x. Dit zorgt voor voldoende vergroting en resolutie om cellen in zijn geheel af te beelden. Streef naar een pixelgrootte van 70-80 nm.</li>
		<li>Stel de pixelverblijftijd in op 2-4 μs en AOTF-transmissie voor de 488-nm- en 561-nm-laser, zodat beelden een goede signaal-ruisverhouding hebben zonder bleken en geen pixels die fluorescentie-intensiteitsverzadiging vertonen. Het is voordelig om het laservermogen van 488 en 561 zodanig aan te passen dat de signaalniveaus in kanaal 1 en kanaal 3 vergelijkbaar zijn.</li>
		<li>Stel de versterking van de fotomultiplicator (middelingsmodus) in op 600-800.</li>
	</ol></li>
	<li>Afbeelding met deze instellingen 15-20 cellen die het GFP-Cherry fusie-eiwit tot expressie brengen. 15-20 cellen bieden goede statistieken terwijl de totale tijd van een FRET-meetsessie beperkt blijft tot een paar uur om de stabiliteit van de microscopische opstelling te helpen garanderen.</li>
	<li>Afbeelding met dezelfde instellingencellen die GFP, Cherry, GFP en Cherry en niet-getransfecteerde cellen uitdrukken. Zoek naar uitdrukkende cellen in respectievelijk het groene kanaal of het rode kanaal.</li>
	<li>Vervolgens beeld 15-20 cellen co-expressie eiwitten van belang gekoppeld aan GFP en Cherry, respectievelijk. Zoek naar tot expressie brengende cellen, vermijd lange blootstelling van de cellen om de fluorescerende eiwitten niet te bleken. Cherry heeft een lagere fotostabiliteit dan GFP, en het bleken van Cherry, de acceptor compromitteert FRET-analyse. OPMERKING: Absorptie- en emissiespectra van GFP en Cherry zijn weergegeven in aanvullende figuur 1. Na een meting gedurende 5-6 uur is het raadzaam om de beeldvorming van enkele cellen die de GFP-Cherry-chimaera tot expressie brengen aan het einde van de beeldvormingssessie te herhalen om te documenteren dat de opstelling stabiel bleef en gedetecteerde FRET-efficiëntie van het GFP-Cherry-fusie-eiwit niet significant veranderde in de loop van een beeldvormingssessie.</li>
</ol>4. Beeldanalyse voor het detecteren van absolute FRET-efficiëntie met behulp van donorblussing en gesensibiliseerde emissie
OPMERKING: Hier wordt een praktische stapsgewijze handleiding gegeven voor het bepalen van de FRET-efficiëntie met behulp van de bijgevoegde spreadsheet (aanvullend bestand 2). Theorie en afleiding van de gepresenteerde vergelijkingen zijn in detail te vinden in eerdere publicaties 4,15,16,17. Met de beschreven instellingen worden de volgende fluorescentie-intensiteiten verzameld.
<ol><li>Meet het donorsignaal I 1 in kanaal 1, het donorkanaal, met 488 nm excitatie en een emissieband van 505-530 nm. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq02.jpg"> waarbij ID het niet-uitgebluste donorsignaal in kanaal 1 is dat zou worden gemeten zonder een acceptor, de gemiddelde FRET-efficiëntie is en B 1 het gemiddelde achtergrondsignaal in kanaal 1.</li>
	<li>Meet het acceptorsignaal I 3 in kanaal 3, het acceptorkanaal, met 561 nm excitatie en emissie bij >585 nm. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq03.jpg"> waarbij IA het acceptorsignaal is en B 3 de achtergrond in kanaal 3.</li>
	<li>Meet het FRET-signaal in kanaal 2, het overdrachtskanaal, met 488-nm excitatie en emissie bij >585 nm. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq04.jpg"> Waarbij het signaal in kanaal 2 een som is van vier verschillende componenten: (i) I D(1 - E)S 1 is de spectrale spill-over van het gebluste donorsignaal naar het detectiekanaal >585 (met de cross-talk factor S 1), (ii) IA S 2 is het acceptorsignaal van de directe excitatie door 488-nm licht (met de cross-talk factor S2), (iii) IDEα is de gesensibiliseerde emissie van de acceptor door FRET van het geëxciteerde donormolecuul (α zal verder worden beschreven in 4.8. - 4.10.), en (iv) B2 is het achtergrondsignaal.</li>
	<li>Meet de gemiddelde achtergrondintensiteiten in kanalen 1, 2, 3 in niet-getransfecteerde of nep-getransfecteerde cellen; Beide zijn prima met verwaarloosbaar verschil. Gebruik voor alle celmetingen het gereedschap uit de vrije hand om gebieden van belangen af te bakenen en perinucleaire blaasjes met verhoogde autofluorescentie te vermijden. Het is belangrijk om significante autofluorescentie van deze perinucleaire blaasjes te vermijden.<ol><li>Voer de metingen in de kolommen X, Y en Z van de verstrekte spreadsheet in. Gemiddelde achtergrondintensiteiten in de 3 kanalen worden ingevoerd in A2, B2 en C2 van de Excel-spreadsheet (aanvullend bestand 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Meet de gemiddelde intensiteiten in de kanalen 1, 2, 3 van cellen die alleen GFP of Cherry uitdrukken en voer de metingen in de kolommen C, D, E en N, O, P. Respectieve achtergrondintensiteiten worden afgetrokken (in F, G, H en Q, R, S).</li>
	<li>Om E, de FRET-efficiëntie, te berekenen, bepaalt u de cross-talk factoren S 1 en S2. De spectrale cross-talk factor S1 wordt berekend uit cellen die alleen GFP tot expressie brengen <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq6v5.png"> in kolom I. Voer de gemiddelde waarde voor S1 in cel D2 in de Excel-spreadsheet in.</li>
	<li>Bereken de spectrale cross-talk factor S2 uit cellen die alleen Cherry uitdrukken <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq07.jpg"> in kolom T. Voer het gemiddelde voor S2 in cel E2 in de Excel-spreadsheet in.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de factor α het signaal van een bepaald aantal geëxciteerde GFP-moleculen in kanaal 1 relateert aan het signaal van een gelijk aantal geëxciteerde Cherry-moleculen in kanaal 2, en wordt gedefinieerd door <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq08.jpg">   <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"> waarbij Q A en QD de fluorescentie-kwantumopbrengsten van Cherry en GFP zijn; ηA en ηD de detectie-efficiëntie van acceptor- en donorfluorescentie in respectievelijk kanalen 2 en 1. OPMERKING: De factor α kan worden bepaald aan de hand van twee monsters die bekende absolute hoeveelheden GFP en Cherry uitdrukken. Het is echter onmogelijk om de exacte hoeveelheid GFP en Cherry uitgedrukt in een cel te kennen. Daarom hebben we de factor berekend door cellen te gebruiken die het GFP-Cherry-fusie-eiwit tot expressie brengen. Hier, terwijl de absolute hoeveelheid nog onbekend is, is bekend dat de verhouding van donor- en acceptormoleculen één is.</li>
	<li>Meet de gemiddelde intensiteiten in de kanalen 1, 2, 3 van cellen die het GFP-Cherry fusie-eiwit tot expressie brengen en voer de metingen in de kolommen AE, AF, AG in. Achtergrondintensiteiten worden afgetrokken (in AH, AI, AJ).</li>
	<li>Bereken de α factor (AJ-kolom) uit de fluorescentie-intensiteiten in kanaal 1, 2 en 3 van het GFP-Cherry-fusie-eiwit als volgt: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq10v6.png"></li>
	<li>Achtergrondgecorrigeerde intensiteiten gemeten in kanaal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) en 3 (I 3 - B3) worden gemeten met behulp van de GFP-Cherry chimaera. De spectrale overspraakfactor S1 werd bepaald met behulp van cellen die alleen GFP tot expressie brengen (zie 4.7.). εD en ε A zijn de extinctiecoëfficiënten van GFP, de donor, en Cherry, de acceptor, bij 488 nm, en kunnen worden bepaald uit de literatuur (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 en de absorptiecurve van Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). De verhouding <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq11.jpg"> is ingevoerd in cel G2 van de excel spreadsheet. Voer de gemiddelde waarde voor de factor α in J2 in.</li>
	<li>Gebruik de bepaalde α factor voor de berekening van het FRET-rendement, E, als volgt (kolom AK): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq12v6.png"></li>
	<li>U kunt ook FRET-efficiëntie, E, bepalen voor de negatieve controles, d.w.z. de co-expressie van GFP en Cherry en de expressie van GFP alleen door de metingen van kanalen 1, 2 en 3 in het Excel-blad in kolom AD, AE en AF op te tellen onder de GFP-Cherry-fusie-eiwitmetingen. Bepaal de FRET-efficiëntie tussen de GFP- en Cherry-gelabelde eiwitten van belang op dezelfde manier.</li>
	<li>Bepaal de onuitbluste donorintensiteit, I D als (I 1 - B 1)/(1 - E), en de acceptorintensiteit als I A = I 3 - B3; Deze waarden zijn evenredig met de expressieniveaus van de gelabelde eiwitten.</li>
	<li>Bepaal de gecorrigeerde verhouding tussen acceptor en donorintensiteit (Q) van het GFP-Cherry-fusie-eiwit als volgt (kolom AL): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"></li>
	<li>Bereken voor andere co-getransfecteerde cellen de moleculaire verhouding N A/ND van acceptor tot donor als volgt: <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq14.jpg"> OPMERKING: De redenering om de N A/N D-verhouding te bepalen en de gemiddelde cellulaire FRET-efficiëntie E versus N A/N D uit te zetten, is dat één donormolecuul energie kan overdragen aan meerdere acceptoren, terwijl een acceptormolecuul slechts energie van één donor op een bepaald moment kan ontvangen. Zelfs als slechts één acceptor met een donor kan communiceren vanwege de stoichiometrie van de interactie, wordt verwacht dat een toename van de acceptorconcentratie de fractie van donoren in complex met de acceptor zal verhogen vanwege de wet van massa-actie. Voor een vaste (of smalle bandbreedte van) donorexpressie zou de FRET-efficiëntie dus moeten stijgen met toenemende N A/ND. Bij het uitzetten van de FRET-efficiëntie E versus N A/N D voor de co-expressie van GFP en Cherry, d.w.z. de negatieve sonde, mag een toename van N A/N D echter niet leiden tot een toename van de FRET-efficiëntie (ten minste bij voldoende lage acceptorconcentraties waarbij willekeurige FRET vanwege de nabijheid van acceptorkleurstoffen tot donorkleurstoffen niet voorkomt).</li>
</ol>

<ol><li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+der+Physik%22%5BJournal%5D)">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li>
<li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence+digital+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li>
<li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li>
<li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+the+c-Fos%2Fc-Jun+complex+in+vivo%3A+A+combined+FRET%2C+FCCS%2C+and+MD-modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li>
<li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li>
<li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li>
<li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413(2013).</li>
<li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quality%2C+reproducibility%2C+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li>
<li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+measured+by+the+sensitized+emission+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194(2020).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li>
<li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li>
<li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li>
<li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li>
<li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li>
<li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li>
<li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+EGFP%2C+EYFP%2C+and+ECFP+with+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li>
<li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness%2C+protein+folding%2C+and+FRET+Forster+radius%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li>
<li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270(2015).</li>
<li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li>
<li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van de genetisch gekoppelde één-op-één fluorescerende eiwitkalibratiesonde voor het kwantificeren van FRET met behulp van de detectie van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul door confocale microscopie. Deze methode kan worden toegepast om eiwitinteracties te beoordelen in de fysiologische context van de levende cel in verschillende subcellulaire compartimenten. De ruimtelijke resolutie kan verder worden verbeterd door het gepres...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Microscopie-gebaseerde analyse van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) maakt het mogelijk om interacties tussen eiwitten in levende cellen te beoordelen. Het biedt ruimtelijke en temporele informatie, inclusief informatie over waar in de cel en in welk subcellulair compartiment de interactie plaatsvindt en of deze interactie in de loop van de tijd verandert.
Theodor Förster legde de theoretische basis van FRET in 19481. FRET is een stralingsloze overdracht van energie van een aangeslagen donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand van de moleculen en de relatieve oriëntatie van hun overgangsdipolen, evenals de overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. De snelheid van energieoverdracht is omgekeerd evenredig met de zesde macht van de donor-acceptor afstand. FRET kan dus worden gebruikt om moleculaire nabijheid te meten in het bereik van 1-10 nm.
FRET concurreert met andere de-excitatieprocessen van het donormolecuul en resulteert in de zogenaamde donor-quenching en sensibilized emissie van de acceptor. Donor-quenching is een vermindering van het aantal uitgezonden donorfotonen, terwijl gesensibiliseerde emissie een toename is van uitgezonden acceptorfotonen. Veel microscopische FRET-analyses maken gebruik van fluorescentie-intensiteitsmetingen, waaronder acceptorfotobleaching 2, donorfotobleaching2 of FRET-gesensibiliseerde fotobleaching van de acceptor3.
Hier worden een stap-voor-stap experimenteel protocol en wiskundig algoritme gepresenteerd om FRET te kwantificeren met behulp van donorblussing en acceptorsensibiliseerde emissie4,5, een methode die vaak ratiometrische FRET wordt genoemd. Er zijn veel protocollen gepubliceerd over het benaderen van gesensibiliseerde emissie, weinigen hebben de absolute FRET-efficiëntie 6,7,8,9 gekwantificeerd. De kwantificering van FRET-efficiënties in de levende cel vereist het bepalen van (i) de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten en ook (ii) de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Terwijl overspraak kan worden beoordeeld door cellen af te beelden die slechts één van de fluoroforen tot expressie brengen, is de beoordeling van de relatieve detectie-efficiëntie van de fluorescentie van donor en acceptor ingewikkelder. Het vereist de kennis van ten minste de verhouding van het aantal donor- en acceptormoleculen die aanleiding geven tot de gemeten signalen. Het aantal fluoroforen dat in levende cellen tot expressie komt, varieert echter van cel tot cel en is onbekend. De zogenaamde α-factor karakteriseert de relatieve signaalsterkten van een enkele aangeslagen donor- en acceptormolecuul. Kennis van de factor is een voorwaarde voor kwantitatieve ratiometrische FRET-metingen in monsters met variabele acceptor-donormolecuulverhoudingen zoals aangetroffen tijdens live-cell imaging met fluorescerende eiwitten. Het gebruik van een 1-op-1 donor-acceptor fusie-eiwit als kalibratiesonde maakt de bepaling van de α factor mogelijk en dient ook als een positieve controle. Deze genetisch gekoppelde sonde wordt door cellen uitgedrukt in onbekende totale hoeveelheden, maar in een vaste en bekende relatieve hoeveelheid van één-op-één. Het volgende protocol legt uit hoe de 1-op-1-sonde moet worden geconstrueerd en hoe deze moet worden gebruikt voor de kwantificering van FRET-efficiëntie. Een spreadsheet die alle formules bevat, is te vinden in het supplement en kan door de lezers worden gebruikt om hun eigen metingen in de respectieve kolommen in te voeren, zoals hieronder beschreven.
Hoewel het protocol het GFP-Cherry-donor/ acceptorpaar gebruikt, kan de gepresenteerde aanpak worden uitgevoerd met elk ander FRET-paar. Het Aanvullend Dossier 1 geeft details over cyaan-gele paren.

<table><tbody><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA zonder fenol rood (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Clontech mCherry N1 vector</td><td>Addgene</td><td>3553</td><td></td></tr><tr><td>DMEM zonder fenol rood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LabTek 8-well kamers #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met fret-gesensibiliseerde emissie

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is de stralingsloze overdracht van energie van een geëxciteerde donor naar een acceptormolecuul en hangt af van de afstand en oriëntatie van de moleculen en de mate van overlap tussen de donoremissie en acceptorabsorptiespectra. FRET maakt het mogelijk om de interactie van eiwitten in de levende cel in de loop van de tijd en in verschillende subcellulaire compartimenten te bestuderen. Verschillende op intensiteit gebaseerde algoritmen om FRET te meten met behulp van microscopie zijn beschreven in de literatuur. Hier worden een protocol en een algoritme verstrekt om de FRET-efficiëntie te kwantificeren op basis van het meten van zowel de gesensibiliseerde emissie van de acceptor als het blussen van het donormolecuul. De kwantificering van ratiometrische FRET in de levende cel vereist niet alleen de bepaling van de overspraak (spectrale spill-over of doorbloeding) van de fluorescerende eiwitten, maar ook de detectie-efficiëntie van de microscopische opstelling. Het protocol dat hier wordt verstrekt, beschrijft hoe deze kritieke parameters moeten worden beoordeeld.

Figuur 1 toont de beelden verkregen in respectievelijk het donorkanaal, kanaal 1 (488, 505-530 nm), het overdrachtskanaal, kanaal 2 (488, >585 nm) en het acceptorkanaal, kanaal 3 (561, >585 nm). Representatieve afbeeldingen van cellen die alleen GFP tot expressie brengen, alleen Cherry, co-expressie van GFP en Cherry, en tot expressie brengen van het GFP-Cherry fusie-eiwit. De gemiddelde cellulaire FRET-efficiënties berekend in NRK-cellen die GFP-Cherry-fusie...

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Dit protocol beschrijft een stap-voor-stap experimenteel proces en wiskundig algoritme om FRET te kwantificeren met behulp van donorblussing en acceptor gesensibiliseerde emissie. De kwantificering van FRET-efficiënties in de levende cel vereist het bepalen van de overspraak van de fluorescerende eiwitten en de relatieve emissie- en detectie-efficiëntie van de fluoroforen in de microscopische opstelling. Kruisverwijzing kan worden beoordeeld door cellen af te beelden die slechts één fluorofoor tot expressie brengen.Beoordeling van de detectie-efficiëntie van een donor- of acceptormolecuul vereist kennis van de verhouding van het aantal donor- en acceptermoleculen dat aanleiding geeft tot het meetsignaal. Het aantal fluoroforen dat tot expressie komt in levende cellen varieert van cel tot cel en is onbekend. De kalibratiesonde die bij deze methode wordt gebruikt, een één-op-één donor-acceptor fusie-eiwit, maakt het mogelijk om de relatieve detectie-efficiëntie van donor- en acceptormoleculen te bepalen.Gebruik om te beginnen een N1-zoogdiercelexpressievector met mCherry 1 voor het genereren van de EGFP mCherry 1-fusiesonde. Ontwerp oligonucleotiden om EGFP te versterken zonder een stopcodon als een cel één BAM h1-fragment. De vijf aminozuurverbinding tussen het groene en rode fluorescerende eiwit zou een gemiddelde FRET-deficiëntie voor het GFP-kersendonor-acceptorpaar van 0,25 tot 0,3 moeten opleveren.Gebruik elke cellijn en media zonder fenolrood om achtergrondfluorescentie te verminderen. Zodra cellen 80% confluent zijn, maakt u ze los met één milliliter 0,05% trypsine EDTA en zaait u ongeveer 10.000 cellen in elke put van een achtputplaat door drie druppels uit een celsuspensie van vijf milliliter toe te voegen. 24 uur na het plateren, transfecteer de cellen met behulp van een geschikt transfectiemedium.Incubeer de cellen gedurende 20 uur voor live cell imaging om een goede fluorescerende eiwitexpressie, vouwing en rijping mogelijk te maken. Stel de cellen in een bevochtigde en verwarmde omgevingskamer bij 37 graden Celsius voor met een confocale scanmicroscoop. Om de celmedia bij fysiologische pH te bufferen, voegt u 20 millimolaire HEPES toe om de celmedia koolstofdioxide-onafhankelijk te maken.Monteer vervolgens de dia op de microscoop. Gebruik de 488 nanometer lijn van de argon ion laser om de GFP te prikkelen en de 561 nanometer diode laser om kers te prikkelen. Stel de 488 nanometer laser in voor excitatie in kanaal één door een emissieband van 505 tot 530 nanometer en in kanaal twee met een langdoorlaatfilter van meer dan 585 nanometer.Gebruik de 561 nanometer laser voor excitatie in kanaal drie met een langdoorlaatfilter van meer dan 585 nanometer. Prikkel de twee lasers achtereenvolgens en stel de beeldmodus in om na elke lijn te schakelen, zodat de excitatie van het beeld van 512 bij 512 pixels na elke lijn wordt afgewisseld. Stel een mini-tijdreeks van drie afbeeldingen in om te detecteren of er significante fotobleaching optreedt en verminder het laservermogen indien nodig.Ten eerste, beeldcellen die de GFP-kersenfusieconstructie uitdrukken. Stel de parameters in die de tijdgeïntegreerde laserintensiteit per pixel in een confocale afbeelding definiëren. Gebruik een olieobjectief van 63x en zoom in op 3x om een cel in zijn geheel weer te geven met voldoende vergroting en resolutie.Streef naar een pixelgrootte van 70 tot 80 nanometer. Stel de verblijftijd van de pixel in op twee tot vier microseconden en AOTF-transmissie voor de 488 nanometer en 561 nanometer laser, zodat beelden een goede signaal-ruisverhouding laten zien zonder bleken en geen pixels die wijzen op fluorescentie-intensiteitsverzadiging. Pas het laservermogen van 488 en 561 zodanig aan dat de signaalniveaus in kanaal één en kanaal drie vergelijkbaar zijn.Stel de versterking van de fotovermenigvuldigingsfactor in op 600 tot 800. Afbeelding 15 tot 20 cellen die het GFP-kersenfusie-eiwit tot expressie brengen, cellen die GFP, kers, GFP en kers tot expressie brengen, en niet-getransecteerde cellen. Vervolgens beeldcellen die samen de eiwitten van belang tot expressie brengen gekoppeld aan respectievelijk GFP en kers.Om FRET te berekenen, meet je het donorsignaal in kanaal één, het donorkanaal met 488 nanometer excitatie en een emissieband van 505 tot 530 nanometer. Meet vervolgens het acceptorsignaal in kanaal drie, het acceptorkanaal met 561 nanometer excitatie en emissie boven 585 nanometer. Meet ten slotte het FRET-signaal in kanaal twee, het overdrachtskanaal met 488 nanometer excitatie en emissie boven 585 nanometer.Het signaal in kanaal twee is een som van vier verschillende componenten: de spectrale spillover van het uitgebluste donorsignaal naar het meer dan 585 detectiekanaal met een overspraakfactor S1, het acceptorsignaal van directe excitatie door 488 nanometer licht met een overspraakfactor S2, de gesensibiliseerde emissie van de acceptor door FRET van het geëxciteerde donormolecuul, en het achtergrondsignaal. Beelden werden verkregen in het donorkanaal, het overdrachtskanaal en het acceptorkanaal, cellen die alleen GFP tot expressie brengen, alleen kersen, co-expressie van GFP en kers, en het GFP-kersenfusie-eiwit worden getoond. De gemiddelde cellulaire FRET-efficiënties berekend in NRK-cellen die GFP-kersfusie-eiwit tot expressie brengen en die co-expressie GFP-kers worden uitgezet versus de intensiteitsratio tussen acceptor en donor of moleculaire verhouding in elke cel.Genormaliseerde pixel voor pixel FRET-afbeeldingen van cellen die het GFP-kersenfusie-eiwit tot expressie brengen, GFP en kers co-expressie als een negatieve controle en het tot expressie brengen van receptorsubeenheden van de Ashwell-Morell-receptor worden hier weergegeven. RHL1 en 2 van de hepatische lectine bij ratten werden gelabeld met GFP en kers op de cytoplasmatische kant van het plasmamembraan. De gemiddelde cellulaire FRET-efficiëntie van cellen die GFP RHL1 en cherry RHL2 tot expressie brengen en GFP RHL1 delta stock en cherry RHL2 worden uitgezet versus de acceptor-to-donor moleculaire ratio.De gepresenteerde kwantitatieve FRET-benadering maakt het volgende mogelijk. Detectie van eiwitinteracties in de fysiologische context van de levende cel. Veranderingen in eiwitinteracties in de loop van de tijd.Verschillen in interacties in subcellulaire compartimenten tot op pixelniveau van een confocale afbeelding. En de afhankelijkheid van het gedetecteerde FRET-signaal van de moleculaire acceptor-donorverhouding uitgedrukt in een levende cel.

assessing-protein-interactions-live-cells-with-fret-sensitized

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

The video describes the FLIM-FRET imaging technique to determine the protein-protein interaction in live bacteria expressing cytoplasmic proteins labeled with fluorescent proteins, a donor eGFP, and acceptor mCherry. The combined technique also allows the quantification of the interacting proteins.

FLIM-FRET Imaging for Characterization of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria

Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Hier presenteren we een protocol om de spatiotemporele dynamiek van Akt-activering en fosforylering in levende HepG2-cellen te kwantificeren. Förster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel dat waardevolle inzichten biedt in insulinesignaleringsroutes en metabole regulatie in kankercellen.

Levende cel Förster resonantie energieoverdracht beeldvorming van metabolisch gereguleerde akt-activeringsdynamiek in HepG2-cellen

Leer FRET-kwantificering in levende cellen met confocale laserscanmicroscopie en GFP-mCherry fusieprobes. Deze methode detecteert eiwitinteracties in real-time en verschillende celcompartimenten voor celbiologisch onderzoek.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

Meer video's verkennen