Levering van het Cas9/sgRNA Ribonucleoproteïne Complex in onsterfelijke en primaire cellen via virusachtige deeltjes ("Nanoblades")

Nanoblades maakten een snelle, efficiënte en dosisafhankelijke afgifte van het Cas9- en gids-RNA-complex mogelijk, zowel in vereeuwigde als in primaire cellen, en in afwezigheid van anti-transgen. Het grote voordeel van deze methode is dat nanoblades gemakkelijk en relatief goedkoop te bereiden zijn. Ze kunnen het Cas9-en RNA-complex op een dosisafhankelijke en voorbijgaande manier leveren, waardoor off-target effecten worden beperkt, terwijl efficiënte genoombewerking mogelijk is.

Het bereidingsprotocol voor nanobladen is heel eenvoudig. De kwaliteit van de productiecellen, evenals hun oorsprong en hun zaaiing vóór transfectie, zijn echter essentieel om hoge opbrengsten van virusachtige deeltjes te verkrijgen. Laura Guiguettaz, een ingenieur uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Op de eerste dag zaai je 3,5 tot 4 miljoen HEK 293T-cellen in 10 milliliter gemodificeerd DMEM en penicilline streptomycine in een celkweekschaal van 10 centimeter. Na 24 uur, wanneer de cellen 70% confluentie bereiken, vervangt u medium door verse DMEM en gebruikt u een P-1000 pipet om transfectiereagensoplossing op een druppelsgewijze manier toe te voegen. Begin met het oogsten van nanobladen op dag vier door het kweekmedium supernatant te verzamelen met een pipet van 10 milliliter.

Het is normaal dat de kleur van het kweekmedium in dit stadium geel wordt. Centrifugeer het verzamelde supernatant gedurende vijf minuten bij 500 G om cellulair puin te verwijderen en herstel negen milliliter van het supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Pellet de nanobladen in een ultracentrifuge op 209, 490 G gedurende 75 minuten bij vier graden Celsius.

Adem na het centrifugeren langzaam het medium op en resuspend de witte pellet met 100 microliter koude PBS. Bedek de buis met parafilm en incubeer gedurende een uur bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Vervolgens de pellet opnieuw opschorten door op en neer te pipetteren.

Bereid een 10% sucrose-oplossing in PBS en filtreer deze door een spuitfilter van 0,2 micrometer. Doe 2,5 milliliter 10% sucrose in een ultracentrifugebuis. Kantel de buis en voeg langzaam de negen milliliter VLP-bevattende monster toe met een pipet met lage snelheid terwijl u de buis geleidelijk in een verticale positie brengt.

Plaats buizen in de rotoremmers en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius op 209, 490 G. Verwijder na het centrifugeren het bovennatuurdier voorzichtig en plaats de buis ondersteboven op tissuepapier om de resterende vloeistof te verwijderen. Voor didactische doeleinden en een betere visualisatie van de virale pellet kunnen nanoblades geladen met het fluorescerende eiwit mCherry worden bereid.

Voeg na een minuut 100 microliter PBS toe. Plaats de buis met een parafilmafdekking gedurende een uur bij vier graden Celsius in een buishouder op een roertafel en pipetteer de pellet opnieuw door op en neer te pipetteren. Bereid de verdunningsbuffer voor door één volume lysisbuffer met een niet-ionische oppervlakteactieve stof toe te voegen aan vier volumes PBS.

Verdun twee microliter geconcentreerde nanobladen in 50 microliter verdunningsbuffer en vortex kort. Breng 25 microliter van het mengsel over in een nieuwe buis met 25 microliter verdunningsbuffer en herhaal de procedure om zes buisjes nanobladverdunningen te hebben. Maak de standaardregeling door twee microliter recombinant Cas9-nuclease toe te voegen aan 50 microliter verdunningsbuffer, vortex het kort en maak acht seriële verdunningen.

Plaats 2,5 microliter van elke VLP-verdunning en 2,5 microliter van elke standaard voorzichtig op een nitrocellulosemembraan met een meerkanaalspook. Zodra de deeltjes zijn geabsorbeerd, blokkeert u het membraan met TBST aangevuld met 5% magere droge melk gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de TBST weg en incubeer het membraan 's nachts bij vier graden Celsius met het Cas9 mierikswortelperoxidase-antilichaam.

Was het membraan drie keer met TBST en visualiseer het signaal met behulp van een verbeterde chemiluminescente substraatkit. Vervang voor transductie van doelcellen met nanobladen het celkweekmedium door 500 microliter van het medium dat gezuiverde nanobladen bevat. Vervang na vier tot zes uur celincubatie het medium door de normale hoeveelheid vers medium.

In het protocol werden cellen gezaaid voor homogene verdeling met 70 tot 80% confluentie op de dag van transfectie, waardoor syncytie werd gevormd die na 24 uur leidde tot grotere cellen met meerdere kernen. 40 uur na transfectie vormden de meeste cellen syncytie en begonnen ze zich los te maken van de plaat. De hoeveelheid Cas9 geladen in nanobladen werd gekwantificeerd met behulp van een dot blot op een nitrocellulosemembraan, die verbeterde chemiluminescentie vertoonde in vergelijking met de referentierecombinant Cas9.

Er werd een kalibratiecurve uitgezet voor het gekwantificeerde chemiluminescentiesignaal voor recombinante Cas9-verdunningen tegen de bekende hoeveelheid Cas9. Vervolgens werd de Cas9-eiwitconcentratie in elk nanoblade-preparaat in kaart gebracht, waarbij verschillende concentraties Cas9 van batch tot batch werden onthuld. De T7-endonucleasetest toonde aan dat de efficiëntie van nanoblades van batch tot batch kan verschillen.

De ene batch bleek bijvoorbeeld een totale bewerkingsefficiëntie van 20% te hebben, terwijl de andere batch 60% efficiëntie vertoonde. Flag-DDX3-eiwitten werden immuno-neergeslagen met behulp van anti-vlag agarose kralen, gevolgd door Western blot analyse van de teruggewonnen eiwitten met behulp van een anti-vlag antilichaam. Site-gerichte insertie van de vlagtag in de DDX3-locus werd ook getest door PCR met behulp van primers die de insertieplaats flankeren, of voorwaartse en omgekeerde primers die specifiek zijn voor de DDX3-locus stroomafwaarts van de vlaginvoegplaats.

Het is belangrijk om de cellen op een juiste samenvloeiing te plaatsen en een gelijkmatige verdeling van de cellen te verkrijgen. Bij nanoblade-centrifugatie is het ook belangrijk om de pellet opnieuw te suspenderen en een homogeen monster van geconcentreerde virale deeltjes te verkrijgen. Nanoblades hebben wetenschappers in staat gesteld om het mechanisme van dubbelstrengs DNA-breukherstel te bestuderen door het Cas9-RNA-complex op een snelle en gecoördineerde manier naar specifieke genomische loci te leiden.

Ze hebben het ook mogelijk gemaakt om lange niet-coderende RNA's in primaire cellen van het aangeboren immuunsysteem te inactiveren om hun rol te bestuderen.