Name: Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Leer een staartaderinjectiemethode voor het modelleren van hersenmetastase bij inflammatoire borstkanker in muizen. Deze aanpak bootst de natuurlijke kolonisatiestappen beter na dan traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Christine F. Wogan, MS, ELS, van MD Anderson's Division of Radiation Oncology voor de wetenschappelijke bewerking van het manuscript, en Carol M. Johnston van MD Anderson's Division of Surgery Histology Core voor hulp bij hematoxyline en eosine kleuring. We zijn de kern diergeneeskunde en chirurgie van MD Anderson dankbaar voor hun steun voor de dierstudies. Dit werk werd ondersteund door de volgende beurzen: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 naar BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19-126-01 naar BGD) en het State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Ook gedeeltelijk ondersteund door Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, naar het MD Anderson Cancer Center van de Universiteit van Texas.

De hier beschreven methode is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het MD Anderson Cancer Center en voldoet aan de National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals. De schematische workflow, met alle stappen inbegrepen, wordt gepresenteerd als figuur 1.
1. Celvoorbereiding
OPMERKING: De MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+) cellijn, gegenereerd in Dr. Woodward's lab24, werd stabiel getransduceerd met een luciferase-groen fluorescerend eiwit (Luc-GFP) plasmide.
<ol><li>Kweek getransduceerde cellen in Ham's F-12 media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1 μg / ml hydrocortison, 5 μg / ml insuline en 1% antibioticum-antimitotic.</li>
	<li>Plaat MDA-IBC3-Luc-GFP cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een T-75 kolf tot samenvloeiing. Verander media om de 3 dagen voordat cellen samenvloeiend genoeg zijn om te passeren.</li>
	<li>Oogst cellen door media te verwijderen, elke kolf te wassen met 10 ml 1x Dulbecco's (d.w.z. calcium- en magnesiumvrije) fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) en 2 ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe te voegen. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C totdat de cellen loskomen.</li>
	<li>Voeg 5 ml volledige media toe aan de kolf om de cellen te verzamelen en breng de volledige inhoud over naar een centrifugebuis van 15 ml (geoptimaliseerd tot een centrifugebuis van 50 ml, afhankelijk van het totale aantal benodigde cellen). Centrifugeer op 290 x g gedurende 5 minuten tot pelletcellen. OPMERKING: Complete media is Ham's F-12 media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1 μg/ml hydrocortison, 5 μg/ml insuline en 1% antibioticum-antimitoticum.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg. Was vervolgens de cellen met 10 ml 1x DPBS. Centrifugeer op 290 x g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren en gooi het supernatant voorzichtig weg. Resuspendeer de cellen met 1 ml verse 1x DPBS en meng goed door op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Om eencellige suspensies te maken, filtert u cellen door steriele celzeven van 40 μm.</li>
	<li>Bereken de celdichtheid met behulp van een geautomatiseerde celteller. OPMERKING: Om fouten bij het tellen te verminderen, maakt u verschillende celverdunningen en telt u deze afzonderlijk en berekent u de gemiddelde waarde om de concentratie van cellen (aantal cellen / ml) te bepalen.<ol><li>Verzamel 2 μL celsuspensie + 8 μL 1x DPBS om een 1:5 verdunningsmonster te maken.</li>
		<li>Verzamel 1 μL celsuspensie + 9 μL 1x DPBS om een 1:10 verdunningsmonster te maken.</li>
		<li>Voeg 10 μL 0,4% trypan blauwe vlek toe. Meng het monstermengsel goed door het een paar keer op en neer te pipetteren.</li>
		<li>Pipetteer voorzichtig 10 μL van het monster in het halvemaanvormige monsterlaadgebied van de telkamerdia's. Zorg ervoor dat er geen bubbels in zitten; Wacht 30 S om de cellen in de kamer te laten bezinken voordat u telt.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdun de cellen met 1x DPBS tot een dichtheid van 5 x 105 of 1 x 106 cellen per 100 μL. Breng de celsuspensie over in 1,7 ml microcentrifugebuizen voor staartaderinjectie. Plaats cellen op ijs tot injectie om de levensvatbaarheid te behouden.</li>
</ol>2. Staartaderinjectie
<ol><li>Gebruik 4- tot 6 weken oude vrouwelijke athymische SCID/Beige muizen.</li>
	<li>Bereid een spuit van 30 G voor om 100 μL celsuspensie op te zuigen. Verwijder alle luchtbellen.</li>
	<li>Plaats de muis in een knaagdierfixator (diameter ongeveer 1 inch) om de injectie van de staartader te vergemakkelijken en verwondingen door beweging tijdens het injectieproces te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik alcoholwattenschijfjes (gemaakt met 70% ethanol) om de staart van de muis 3-4 keer voorzichtig af te vegen en 5-10 s vast te houden om de staartader duidelijker zichtbaar te maken.</li>
	<li>Steek de spuit in de staart van de muis onder een hoek van 15-30°. Duw de celsuspensie langzaam in de staartader.</li>
	<li>Verwijder de spuit voorzichtig en gebruik het wattenschijfje om de staart enkele seconden vast te houden om het bloeden te stoppen.</li>
	<li>Breng de muizen terug naar hun kooien en controleer ze 2-4 uur na injectie om er zeker van te zijn dat er geen nadelige effecten optreden.</li>
</ol>3. Evaluatie van hersenmetastasebelasting
<ol><li>Bereid verdunde D-luciferine oplossing. OPMERKING: De voorraadconcentratie is 47,6 mM (15,15 mg / ml) en de concentratie voor gebruik is 1,515 mg / ml.<ol><li>Voeg 5 ml 1x DPBS toe aan de D-luciferin fles.</li>
		<li>Breng 2,5 ml van de oplossing in elk van de twee conische buizen van 50 ml.</li>
		<li>Voeg nog eens 5 ml 1x DPBS toe aan de D-luciferin fles om deze opnieuw af te spoelen. Doe 2,5 ml in elke conische buis van 50 ml.</li>
		<li>Doe nog eens 5 ml 1x DPBS in de fles en spoel deze opnieuw af. Herhaal het spoelproces twee keer.</li>
		<li>Voeg 1x DPBS toe aan elke buis van 50 ml tot een totaal van 66 ml (ongeveer 33 ml per buis). Er moet ongeveer 33 ml van de oplossing in elke buis zitten.</li>
		<li>Meng de buizen goed en combineer beide vervolgens tot een steriele filtratie-eenheid (150 ml PES-filter 0,45 μm).</li>
		<li>Filtreer de oplossing en aliquoteer vervolgens de gefilterde oplossing in steriele amberkleurige microbuisjes van 1,7 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Het detecteren van hersenmetastasen door luciferase beeldvorming.<ol><li>Ontdooi D-luciferine door op ijs te blijven en vortex voordat het in de muizen wordt geïnjecteerd.</li>
		<li>Reinig het injectiegebied met wattenschijfjes alcohol en injecteer 100 μL D-luciferine per muis intraperitoneaal met behulp van een insulinespuit van 0,5 ml, één spuit voor elke kooi.</li>
		<li>Verdoof de muizen na 10 minuten met isofluraan (2% O 2-2,5% isofluraan) gedurende 5 minuten met behulp van de veterinaire verdamper die is aangesloten op de inductiekamer voor kleine dieren.</li>
		<li>Schakel het in vivo beeldvormingssysteem in. Terwijl de muizen uit de eerste kooi onder narcose zijn, injecteert u de D-luciferine in de muizen in de volgende kooi.</li>
		<li>Plaats muizen in de in vivo beeldvormingssysteemmachine en verkrijg ventrale en dorsale beelden. Selecteer een belichtingstijd van 2 minuten en kies in de veldweergave optie E (hele lichaam). Druk op Verwerven. Sla vervolgens de afbeelding op (afbeelding 2). OPMERKING: Als de afbeelding verzadiging van luminescentie laat zien, verkort dan de belichtingstijd.</li>
	</ol></li>
	<li>Het detecteren van hersenmetastasen door GFP-beeldvorming.<ol><li>Voorbereiding van hersenweefsel.<ol><li>Ongeveer 8-10 weken na injectie van cellen of wanneer de muizen stervende zijn als gevolg van hersenmetastaselast, euthanaseer de muizen door inademing van een overdosis isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie, in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de IACUC.</li>
			<li>Na euthanasie met isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie, besproei de muizen met een 70% ethanoloplossing en verwijder de vacht van het hoofdgebied en de oren met een schaar. Maak vervolgens een snee in het cervicale gebied van de nek (voorzichtig zijn om de muis niet te onthoofden). Knip de schedel af en trek hem eruit. Verwijder vervolgens voorzichtig de hersenen.</li>
			<li>Plaats de verzamelde hersenen in weefselcassettes.</li>
			<li>Breng de cassettes over in een container met koude 1x DPBS. OPMERKING: Hersenmonsters mogen niet langer dan 1 uur in 1x DPBS worden bewaard. Als er meerdere hersenmonsters tegelijk moeten worden verzameld, euthanaseer dan slechts een paar muizen tegelijk (10 per ronde).</li>
		</ol></li>
		<li>Stereomicroscopische beeldvorming.<ol><li>Breng de hele hersenen over op een 100 cm tissue schoteldeksel.</li>
			<li>Schakel de stereomicroscoop en het UV-licht in, op positie 3 met lens 0,5x, om visualisatie van het hele brein mogelijk te maken zoals weergegeven in figuur 3A (rood vierkant).</li>
			<li>Druk op Live view (Figuur 3A, groen vierkant).</li>
			<li>Focus het beeld terwijl de hersenen zich in de ventrale positie bevinden.</li>
			<li>Selecteer GFP (als cellen GFP-gelabeld zijn) of TXRED (als cellen RFP-gelabeld zijn) (Figuur 3A, geel vierkant) in de software, selecteer het juiste filter op de microscoop en maak een foto. OPMERKING: Houd de instelling van de SOLA-lichtbron op ongeveer 30%; als de GFP te helder is, verminder dan totdat het juiste signaal wordt waargenomen.</li>
			<li>Zonder het monster te verplaatsen, schakelt u het felle licht in en selecteert u BF (figuur 3A, geel vierkant). Maak een foto.</li>
			<li>Herhaal de vorige stappen met de hersenen in de dorsale positie. OPMERKING: Afhankelijk van de grootte kan dezelfde GFP-positieve hersenmetastaselaesie verschijnen in zowel ventrale als dorsale posities. Vermijd in een dergelijk geval dubbele kwantificering van dezelfde laesie. Sla de afbeeldingen op met een TIFF-extensie (die alle informatie in het afbeeldingsbestand bewaart).</li>
			<li>Sla de afbeeldingen op met een TIFF-extensie (die alle informatie in het afbeeldingsbestand bewaart).</li>
			<li>Herhaal de stappen voor alle voorbeelden.</li>
			<li>Converteer de TIFF-afbeeldingen naar JPEG zodat de bestanden kunnen worden geopend met elke computer waarop de bijbehorende software niet is geïnstalleerd (Bestand | Importeren/exporteren | bestanden converteren).</li>
			<li>Als u de fluorescerende afbeelding wilt samenvoegen met de afbeelding met een helder veld, opent u beide afbeeldingen en gaat u naar Bestand | Kanalen samenvoegen. Selecteer de juiste componenten, groen voor GFP en brightfield voor BF, en druk op OK. Sla de samengevoegde afbeelding op.</li>
			<li>Om het gebied van de hersentumor te kwantificeren, gebruikt u de fluorescerende afbeelding. Selecteer Meten | Handmatige meting | Gebied. Selecteer automatische selectie (afbeelding 3B, groen vierkant) en verplaats de pijl naar het GFP-positieve gebied en klik om automatisch een selectie te maken. Klik nogmaals om de selectie te bevestigen en vervolgens worden alle metingen weergegeven (figuur 3B, rood vierkant). Als er meer dan één GFP-positief gebied aanwezig is, herhaalt u de procedure.</li>
		</ol></li>
		<li>Nadat hersenbeelden zijn verkregen, gaat u verder met routinematige weefselfixatieprotocollen met behulp van 10% neutrale gebufferde formaline.<ol><li>Zodra de hersenen zijn gefixeerd, gaat u verder met standaard histologische sectie, gevolgd door hematoxyline- en eosinekleuring om de aanwezigheid van hersenmetastase en immunohistochemische kleuring te bevestigen om geselecteerde markers te detecteren. OPMERKING: Immunocytochemie werd uitgevoerd in het Pathology Core Laboratory van het UT MD Anderson Cancer Center dat een gestandaardiseerd protocol heeft voor immunohistochemische kleuring van bekende markers.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Achrol, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Brain metastases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5(2019).</li>
<li>Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Report%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of brain metastases.</a> Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).</li>
<li>Lowery, F. J., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastasis%3A+Unique+challenges+and+open+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities.</a> Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).</li>
<li>Brufsky, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+metastases+in+patients+with+HER2-positive+metastatic+breast+cancer%3A+incidence%2C+treatment%2C+and+survival+in+patients+from+registHER%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER.</a> Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).</li>
<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+landscape+of+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">The evolving landscape of brain metastasis.</a> Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Woditschka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair+genes+and+oxidative+damage+in+brain+metastasis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vorinostat+inhibits+brain+metastatic+colonization+in+a+model+of+triple-negative+breast+cancer+and+induces+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks.</a> Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).</li>
<li>Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+upregulate+survival+genes+in+tumor+cells+and+induce+protection+from+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy.</a> Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+family+kinases+as+novel+therapeutic+targets+to+treat+breast+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases.</a> Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).</li>
<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serpins+promote+cancer+cell+survival+and+vascular+co-option+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis.</a> Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+lapatinib+on+the+outgrowth+of+metastatic+breast+cancer+cells+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain.</a> Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pazopanib+reveals+a+role+for+tumor+cell+B-Raf+in+the+prevention+of+HER2%2B+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis.</a> Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+prevention+of+experimental+brain+metastases+of+breast+cancer+by+temozolomide+in+an+MGMT-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner.</a> Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).</li>
<li>Priego, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+labels+a+subpopulation+of+reactive+astrocytes+required+for+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).</li>
<li>Debeb, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-141-mediated+regulation+of+brain+metastasis+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).</li>
<li>Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+breast+carcinoma+incidence+and+survival%3A+the+surveillance%2C+epidemiology%2C+and+end+results+program+of+the+National+Cancer+Institute%2C+1975-1992%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992.</a> Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).</li>
<li>Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+inflammatory+breast+carcinoma+incidence+and+survival%3A+the+surveillance%2C+epidemiology%2C+and+end+results+program+at+the+National+Cancer+Institute%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute.</a> Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).</li>
<li>Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+breast+cancer%3A+Current+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory breast cancer: Current understanding.</a> Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+distant+metastases+in+inflammatory+breast+cancer+-+A+large-cohort+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer - A large-cohort retrospective study.</a> Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).</li>
<li>Uemura, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+CNS+metastases+and+survival+in+patients+with+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer.</a> Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).</li>
<li>Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+of+micrometastatic+breast+cancer+radiation+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+Physics%22%5BJournal%5D)">Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).</li>
<li>Fukumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omic+molecular+profiling+reveals+potentially+targetable+abnormalities+shared+across+multiple+histologies+of+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis.</a> Acta Neuropathol. , (2021).</li>
<li>Klopp, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+promote+mammosphere+formation+and+decrease+E-cadherin+in+normal+and+malignant+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells.</a> PLoS One. 5 (8), 12180(2010).</li>
<li>Villodre, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstract+P3-01-10%3A+Ndrg1-egfr+axis+in+inflammatory+breast+cancer+tumorigenesis+and+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis.</a> Cancer Research. 80 (4), 10(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Het protocol bevat verschillende kritieke stappen. Cellen mogen niet langer dan 1 uur op ijs worden gehouden om de levensvatbaarheid te behouden. Alcoholwattenschijfjes moeten worden gebruikt om de staarten van de muizen af te vegen vóór injectie, met zorg ervoor dat ze niet te hard of te vaak afvegen om te voorkomen dat de staarthuid wordt beschadigd. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de celsuspensie, om te voorkomen dat muizen sterven aan bloedvatembolieën. Houd de injectiehoek op 45° of minder om te...

Hersenmetastase is een veel voorkomende en dodelijke complicatie van systemische maligniteiten. De meeste hersenmetastasen zijn afkomstig van primaire tumoren van de long, borst of huid, die samen goed zijn voor 67-80% van de gevallen 1,2. Schattingen van de incidentie van hersenmetastasen variëren van 100.000 tot 240.000 gevallen, en deze aantallen kunnen worden onderschat omdat autopsie zeldzaam is voor patiënten die stierven aan uitgezaaide kanker3. Patiënten met hersenmetastasen hebben een slechtere prognose en een lagere totale overleving ten opzichte van patiënten zonder hersenmetastasen4. De huidige behandelingsopties voor hersenmetastasen zijn grotendeels palliatief en verbeteren de overlevingsresultaten voor de meeste patiëntenniet 5. Hersenmetastase blijft dus een uitdaging en de noodzaak blijft dringend om de mechanismen van hersenmetastaseprogressie beter te begrijpen om effectievere therapieën te ontwikkelen.
Het gebruik van experimentele modellen heeft belangrijke inzichten opgeleverd in specifieke mechanismen van borstkanker gemetastaseerde progressie naar de hersenen en heeft de evaluatie van de werkzaamheid van verschillende therapeutische benaderingen mogelijk gemaakt 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Er zijn echter maar weinig modellen die de fijne kneepjes van de ontwikkeling van hersenmetastase nauwkeurig en volledig kunnen samenvatten. Verschillende experimentele in vivo modellen zijn gegenereerd via inenting van kankercellen in muizen via verschillende toedieningswegen, waaronder orthotopische, staartader-, intracardiale, intracarotis-arteriële en intracerebrale injecties. Elke techniek heeft voor- en nadelen, zoals elders besproken3. Geen van deze muismodellen kan echter de klinische progressie van hersenmetastase volledig repliceren.
Hersenmetastasen komen vooral vaak voor bij patiënten met inflammatoire borstkanker (IBC), een zeldzame maar agressieve variant van primaire borstkanker. IBC is goed voor 1% tot 4% van de gevallen van borstkanker, maar het is verantwoordelijk voor een onevenredige 10% van de borstkankergerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten17,18. Van IBC is bekend dat het snel metastaseert; inderdaad, een derde van de IBC-patiënten heeft metastasen op afstand op het moment van diagnose19,20. Specifiek voor hersenmetastase hebben patiënten met IBC een hogere incidentie van hersenmetastase dan patiënten met niet-IBC21. Onlangs hebben we aangetoond dat de MDA-IBC3-cellijn, afgeleid van de kwaadaardige pleurale effusievloeistof van een patiënt met ER-/PR-/HER2+ IBC die IBC-kenmerken in xenografts van muizen samenvat, een verhoogde neiging heeft om hersenmetastasen te ontwikkelen in plaats van longmetastasen bij muizen wanneer ze worden geïnjecteerd door staartader, waardoor deze cellijn een goed model is voor het bestuderen van de ontwikkeling van hersenmetastase16.
Hierin beschrijven we de procedures om hersenmetastase te genereren via staart-aderinjectie van MDA-IBC3-cellen en om de metastatische belasting te evalueren via stereofluorescente microscopie en luciferasebeeldvorming. Deze methode is gebruikt om belangrijke mediatoren van borstkankermetastase naar de hersenen te ontdekken en om de werkzaamheid van therapeutische interventies te testen 16,22,23. Het nadeel van deze techniek is dat het niet alle stappen in het metastatische proces van de hersenen samenvat. Niettemin zijn de belangrijkste voordelen robuustheid en reproduceerbaarheid, betrokkenheid van de relevante metastasebiologie van intravasatie, het doorkruisen van de longen en extravasatie in de hersenen, en de relatieve eenvoud in termen van techniek.

<table><tbody><tr><td>Celcultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L pipette tip gefilterd</td><td>Genesee Scientific</td><td>23430</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serologische pipetten</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>1%</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes 15 mL bulk</td><td>Genesee Scientific</td><td>28103&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>MT10080CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatisch Celteller (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>16000044</td><td>10%</td></tr><tr><td>Fisherbrand &nbsp;Steriele Cel Zeevers (40 &mu;m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td>5 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp;Countess Celtelling Chamber Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MDA-IBC3 cellijnen</td><td>MD Anderson Cancer Center</td><td></td><td>Gemaakt door Dr. Woodward's lab24</td></tr><tr><td>Luciferase&ndash;groen fluorescente proteïne (Luc&ndash;GFP) plasmide</td><td>System Biosciences</td><td>BLIV713PA-1</td><td></td></tr><tr><td>microtubes heldere steriele 1.7 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>24282S</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 10 &micro;L Reach Barrier Tip, Low Binding, Gerangeerd, Steriele</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TC Behandelde Flessen (T75), 250mL, Vent</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%) voor gebruik met de Countess Automatisch Celteller</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), fenol rood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Staartvene-injectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige</td><td>Envigo</td><td>SCID/beige muizen</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe met de BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm)</td><td>BD</td><td>328466</td><td></td></tr><tr><td>Plas Labs &nbsp;Broome-Style Rodent Restrainers</td><td>Plas Labs 551BSRR</td><td>01-288-32A</td><td>Bestel bijThermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50420872</td><td>70 % gebruikt</td></tr><tr><td>Beeldvorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp;Lo-Dose&nbsp; U-100 Insulin Spuiten</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef PES Filter Units 0.45 &micro;m</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566501</td><td>filtersysteem om de D-luciferine te steriliseren</td></tr><tr><td>D-Luciferine</td><td>Biosynth</td><td>L8220-1g</td><td>stockconcentratie = 47.6 mM (15.15 mg/mL); gebruiksconcentratie = 1.515 mg/mL</td></tr><tr><td>1.7 mL microtube amber</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282AM</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-14043-704-06</td><td>Vloeibaar anesthesiemiddel voor gebruik in anesthesie verdamper</td></tr><tr><td>IVIS 200&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>machine voor luciferase beeldvorming, tot 5 muizen tegelijk beeldvorming, met anesthesie apparaat</td></tr><tr><td>Plastic Containers met Deksels&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>02-544-127</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Alcohol Prep&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop Beeldvorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop AZ100&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>model AZ-STGE</td><td>software NIS-ELEMENT</td></tr><tr><td>Formaline 10%</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>TC behandelde schalen 100x20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25202</td><td></td></tr></tbody></table>

modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Gemetastaseerde verspreiding naar de hersenen is een veel voorkomende en verwoestende manifestatie van vele soorten kanker. Alleen al in de Verenigde Staten worden elk jaar ongeveer 200.000 patiënten gediagnosticeerd met hersenmetastasen. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het verbeteren van de overlevingsresultaten voor patiënten met primaire borstkanker en systemische maligniteiten; De sombere prognose voor patiënten met klinische hersenmetastasen benadrukt echter de dringende noodzaak om nieuwe therapeutische middelen en strategieën tegen deze dodelijke ziekte te ontwikkelen. Het gebrek aan geschikte experimentele modellen is een van de belangrijkste obstakels geweest die de vooruitgang van ons begrip van hersenmetastasebiologie en -behandeling belemmeren. Hierin beschrijven we een xenograft muismodel van hersenmetastase gegenereerd via staart-aderinjectie van een endogene HER2-versterkte cellijn afgeleid van inflammatoire borstkanker (IBC), een zeldzame en agressieve vorm van borstkanker. Cellen werden gelabeld met vuurvlieg luciferase en groen fluorescentie-eiwit om hersenmetastase te controleren en gekwantificeerde metastatische belasting door bioluminescentie beeldvorming, fluorescerende stereomicroscopie en histologische evaluatie. Muizen ontwikkelen robuust en consistent hersenmetastasen, waardoor onderzoek van belangrijke mediatoren in het metastatische proces en de ontwikkeling van preklinisch testen van nieuwe behandelingsstrategieën mogelijk is.

Met de redenering dat gelabelde cellen monitoring en visualisatie van hersenmetastasen in preklinische muismodellen vergemakkelijken, hebben we MDA-IBC3-cellen gelabeld met Luc en met GFP om hersenmetastasen te monitoren en de metastatische belasting te kwantificeren met behulp van bioluminescentiebeeldvorming en fluorescerende stereomicroscopie. Injectie van de gelabelde MDA-IBC3-cellen in de staartaders van immuungecompromitteerde SCID / Beige-muizen resulteerde in hoge percentages muizen die hersenmetastase ontwikkeld...

We beschrijven een xenograft muismodel van borstkanker hersenmetastase gegenereerd via staart-ader injectie van een endogene HER2-versterkte inflammatoire borstkankercellijn.

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

We gebruikten de staartadermethode om hersenmetastase te genereren in muismodellen met behulp van cellijnen afgeleid van patiënten met inflammatoire borstkanker, of IBC, een zeer agressieve vorm van primaire borstkanker. Het genereren van hersenmetastase in muismodellen omvat meestal intracardiale of intracarotis arteriële injecties. De staartadermethode biedt echter voordeel ten opzichte van deze technieken, omdat het de stappen van hersenmetastasekolonisatie beter nabootst en relatief eenvoudig uit te voeren is.Dokters Xiaoding Hu en Emilly Villodre, beiden instructeurs in mijn laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Om hersenmetastasen te detecteren door GFP-beeldvorming acht tot 10 weken na tumorcelinjectie, desinfecteert u de muis met 70% ethanol en verwijdert u de vacht van het hoofd en de oren. Snijd het cervicale gebied van de nek af.Snijd en verwijder de schedel om de hersenen te kunnen oogsten. Plaats de hersenen in een weefselcassette en plaats de cassette in een container met koude DPBS voor niet meer dan een uur. Voor beeldvorming door stereomicroscopie brengt u de hersenen over in een weefselschoteldeksel van 100 centimeter onder een stereomicroscoop die is uitgerust met een UV-licht en selecteert u het 0,5x-objectief om visualisatie van de hele hersenen mogelijk te maken.Druk op live view en focus de weergave terwijl de hersenen zich in de ventrale positie bevinden. Selecteer het juiste filter in de software en microscoop voor de fluorescerende marker in de cellen en maak een foto. Zonder het monster te verplaatsen, schakelt u over naar brightfield-beeldvorming en selecteert u het brightfield-filter.Maak een foto. Stel je vervolgens de hersenen in de dorsale positie voor zoals eerder aangetoond. Om de hele hersenbeelden te analyseren, converteert u eerst de afbeeldingsbestanden van TIFF naar JPEG, zodat ze kunnen worden geopend met elke computer die niet over de bijbehorende software beschikt.Open vervolgens een paar brightfield- en fluorescerende afbeeldingen en selecteer bestands- en samenvoegkanalen. Selecteer de juiste componenten, klik op OK en sla de samengevoegde afbeelding op. Om het hersentumorgebied in het fluorescerende beeld te kwantificeren, selecteert u automatische selectie.Verplaats de pijl naar het GFP-positiegebied en klik om automatisch een selectie te maken. Klik vervolgens nogmaals om de selectie te bevestigen. Alle metingen worden getoond.Als meer dan één GFP-positief gebied kan worden waargenomen, herhaalt u de meting met het volgende gebied. Hersenmetastatische laesies kunnen al acht weken na injectie worden gedetecteerd door luciferasebeeldvorming en stereofluorescerende microscopie. Na beeldvorming kunnen delen van de hersenmetastasen worden gefixeerd en verwerkt voor hematoxyline- en eosinekleuring om de aanwezigheid van hersenmetastaselaesies te valideren, en voor immunohistochemische kleuring om specifieke eiwitmarkers van belang te detecteren.Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om de levensvatbaarheid van de cel te behouden door de cellen niet langer dan een uur op ijs te houden en om luchtbellen in de celsuspensie te vermijden om embolievorming en muizensterfte te voorkomen. Na injectie van de staartader monitoren we hersenmetastasegroei en progressie met luciferasebeeldvorming. Na euthanasie bevestigden stereofluorescerende microscopie en histologie metastaseringslaesies.

modeling-brain-metastasis-via-tail-vein-injection-inflammatory-breast

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Deze video beschrijft een techniek van het injecteren van gelabelde kankercellen met behulp van staartaderinjectie in een muismodel. We monitoren verder de vorming van borstkankermetastasen en groei met behulp van real-time in vivo live dierbeeldvorming.

Staartaderinjectie: een methode om kankercellen toe te dienen voor gemetastaseerde studies in een muismodel

Source: Lim, M., et al. Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (2022)In this video, an anesthetized mouse undergoes a surgical procedure in which cancer cells are injected into the common carotid artery (CCA) to facilitate targeted delivery to the brain. The procedure involves precise suturing and manipulation of the carotid arteries to direct the injected cells toward the internal carotid artery (ICA), promoting tumor formation in the brain...

Modeling Brain Tumor Metastasis via Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Een borstkanker hersenmetastasen muismodel wordt vastgesteld met echografie-imaging geleide intracardiale injectie van MDA-MB231/Br-GFP cellen. Ontwikkeling van multifocale intracraniële metastasen is longitudinaal gevolgd met behulp van hoge-resolutie 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging-begeleide Intracardiale Injection een muismodel van borstkanker hersenmetastasen Gevolgd door Longitudinale MRI Ontwikkelen

Dit manuscript beschrijft de gedetailleerde procedure van intra-iliacale arteriële (IIA) injectie, een techniek om kankercellen specifiek af te leveren aan weefsels van de achterpoten, inclusief botten, om experimentele botmetastasen te creëren. Hoewel het oorspronkelijk werd vastgesteld met borsttumormodellen, kan dit protocol gemakkelijk worden uitgebreid naar andere soorten kanker.

Intra-iliaca Injectie voor Efficiënte en Selectieve Modellering van Microscopisch botmetastase

Metastase vormt een belangrijk onderdeel van de virulentie van kanker en is naar schatting verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen.  We rapporteren een protocol voor een metastatisch melanoommodel bij muizen dat nuttig is voor het bepalen van de werkzaamheid van therapeutische middelen tegen dit klinische fenomeen.

Injectie van Syngene muizen Melanoma Cells om hun gemetastaseerde potentieel in de longen bepalen

Er werd een chirurgische procedure ontwikkeld om mamma-tumorcellen via injectie in de poortader in de muizenlever af te leveren. Dit model maakt onderzoek naar late stadia van levermetastase mogelijk bij een volledig immuuncompetente gastheer, inclusief extravasatie van tumorcellen, zaaien, overleven en metastatische uitgroei in de lever.

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Intracraniale hersenen metastase modellering wordt gecompliceerd door een onvermogen om tumorgrootte en reactie op de behandeling met nauwkeurige en tijdige methoden te controleren. De gepresenteerde methodologie paren intracraniale tumor injectie met magnetische resonantie imaging analyse, die wanneer gecombineerd, cultiveert nauwkeurige en consistente injecties, verbeterde dier monitoring, en nauwkeurige tumor volume metingen.

Modellering van hersenmetastasen door middel van intracraniale injectie en magnetische resonantie beeldvorming

Hersenmetastase is een oorzaak van ernstige morbiditeit en mortaliteit bij kankerpatiënten. De meeste muismodellen voor hersenmetastasen worden gecompliceerd door systemische metastasen die de analyse van mortaliteit en therapeutische interventie-uitkomsten verstoren. Hier gepresenteerd is een protocol voor interne carotisinjectie van kankercellen dat consistente intracraniale tumoren produceert met minimale systemische tumoren.

Modellering van hersenmetastase door interne halsslagaderinjectie van kankercellen

Leer een staartaderinjectiemethode voor het modelleren van hersenmetastase bij inflammatoire borstkanker in muizen. Deze aanpak bootst de natuurlijke kolonisatiestappen beter na dan traditionele technieken.

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

Meer video's verkennen