Name: 3D-printen van in vitro hydrogel microdragers door afwisselend viskeuze-traagheidskracht jetting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Leer een mild bioprintingproces voor hydrogel microdragers met uitstekende controleerbaarheid en biocompatibiliteit. Deze methode behoudt de oorspronkelijke eigenschappen van bio-inkt en ondersteunt celkapseling voor weefselopbouw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), de National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) en het 111 Project (B17026).

1. Celkweek
<ol><li>Supplement hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Minimum Essential Medium (H-DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% niet-essentiële aminozuuroplossing (NEAA), 1% penicilline G en streptomycine, en 1% glutaminesupplement als kweekmedium voor A549-cellen.</li>
	<li>Kweek A549-cellen in een CO2-incubator bij 37 °C en met 5% CO2
</li>
	<li>Dissocieer cellen voor subcultuur met behulp van trypsine bij ongeveer 80% confluentie.<ol>
<li>Gebruik 3 ml trypsine om de cellen in de T75-kweekkolf gedurende 3 minuten bij 37 °C te behandelen en voeg vervolgens 6 ml kweekmedium toe om de trypsinisatie te stoppen.</li>
		<li>Pipetteer het kweekmedium om losjes gehechte cellen te oogsten.</li>
		<li>Centrifugeer bij 72,5 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant en resuspend met 3 ml vers medium.</li>
		<li>Breng 1 ml celsuspensie over in een nieuwe T75-kweekkolf met 10 ml vers medium. Verander het cultuurmedium om de 2 dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Voorbereiding van nozzles
<ol><li>Plaats glazen micropipettes op de trekker volgens de instructies van de fabrikant. De buitendiameter, binnendiameter en lengte van de microstraalpijp zijn respectievelijk 1,5 mm, 1,1 mm en 100 mm.</li>
	<li>Stel de trekparameters voor de trekker in. Concreet zijn de waarden van HEAT, PULL, VELOCITY, TIME en PRESSURE standaard ingesteld op respectievelijk 560, 255, 255, 150 en 500. Trek het mondstuk onder deze parameters af. LET OP: Het mondstuk dat wordt verkregen na het aftrekken is zeer scherp en een onzorgvuldige bediening kan verwondingen veroorzaken.</li>
	<li>Snijd het resulterende mondstuk (stap 2.2) met de aangegeven diameter af met een microsmederijapparaat volgens de instructies van de fabrikant om een specifieke tipdiameter te verkrijgen. Zoek specifiek de opgegeven diameter van het mondstuk op de verwarmde platinadraad. Verwarm de draad tot 60 °C gedurende ongeveer 5 s en trek het mondstuk uit elkaar.</li>
	<li>Dompel de printkop van het mondstuk gedurende 30 minuten onder in een hydrofoob middel, gevolgd door drie spoelcycli met gesteriliseerd water.</li>
	<li>Steriliseer het mondstuk voor het afdrukken gedurende 5 minuten in alcohol en spoel het drie keer met gesteriliseerd water om de resterende alcohol te verwijderen.</li>
</ol>3. Bereiding van hydrogel bioink
<ol><li>Los NaCl (0,45 g) op in 50 ml steriel water om een NaCl-oplossing van 0,9% (met v) te verkrijgen. Tril de oplossing om ontbinding te bevorderen. Nadat de oplossing volledig is opgelost, filtert u de oplossing door een polyethyleentereftalaatfiltermembraan van 0,45 μm.</li>
	<li>Weeg natriumalginaatpoeder met lage viscositeit (1 g) af en los het 's nachts op in 25 ml NaCl-oplossing (stap 3.1) bij een hoge temperatuur van 60-80 °C om een 4% (w/v) natriumalginaatvoorraadoplossing te verkrijgen. De stamoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Steriliseer de natriumalginaat-stamoplossing (stap 3.2) door deze driemaal gedurende 30 minuten in een oven (70 °C) te verwarmen.</li>
	<li>Verdun het juiste volume natriumalginaat-stamoplossing (stap 3.3) in 0,9% NaCl-oplossing (stap 3.1) in concentraties van 2%, 1,5% en 0,5% (w/v). OPMERKING: Naast verwarming in de oven moeten andere bereidingsprocessen van natriumalginaatoplossing in de kap worden uitgevoerd.</li>
	<li>Los 1 g gelatinepoeder op in 25 ml NaCl-oplossing (stap 3.1) bij een hoge temperatuur van 60-80 °C gedurende de nacht om een gelatinebouillonoplossing van 4% (g/v) te verkrijgen. De stamoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Steriliseer de gelatine-stamoplossing (stap 3.5) door deze gedurende 30 minuten driemaal in een oven (70 °C) te verwarmen.</li>
	<li>Verdun het juiste volume gelatine-bouillonoplossing (stap 3.6) in 0,9% NaCl-oplossing (stap 3.1) in een concentratie van 1,5% (w/v). OPMERKING: Naast verwarming in de oven moeten andere bereidingsprocessen van gelatine-oplossing in de kap worden uitgevoerd.</li>
	<li>Om de celbinding op de microdragers te bevorderen, bereidt u de alginaat-collageenoplossing door de 2% (w / v) natriumalginaatoplossing en de type I collageenoplossing van rattenstaart (4 mg / ml) te mengen in een verhouding van 3: 1. Stel de oplossing in op pH 7,2 met 0,1 M NaOH-oplossing en gebruik deze onmiddellijk na bereiding.</li>
	<li>Los de met tyrosine gemodificeerde HA-flocculent vaste stof 's nachts op in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) bij 60-80 °C om een 0,8% m/w tyrosine-gemodificeerde hyaluronzuur PBS-oplossing te verkrijgen. De stamoplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Steriliseer de tyrosine-gemodificeerde HA PBS-oplossing door deze driemaal gedurende 30 minuten in een oven (70 °C) te verwarmen.</li>
	<li>Los mierikswortelperoxidasepoeder (500 enzymactiviteitseenheid/mg) op in PBS-oplossing om 8 enzymactiviteitseenheid/mg mierikswortelperoxidase PBS-oplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Verdun waterstofperoxideoplossing (30%, g/m) met DI-water tot 4 mM.</li>
	<li>Bereid de gemodificeerde HA-mierikswortelperoxidaseoplossing door tyrosine-gemodificeerde hyaluronzuur PBS-oplossing en mierikswortelperoxidase PBS-oplossing te mengen in een verhouding van 1:1. OPMERKING: Naast verwarming in de oven moeten andere bereidingsprocessen van HA-mierikswortelperoxidase-oplossing in de kap worden uitgevoerd.</li>
</ol>4. Vorming van microdruppels op basis van AVIFJ
<ol><li>Gebruik een thuis gevestigd celafdruksysteem zoals eerder gerapporteerd (figuur 1A)26. Het elektrische signaal dat door de golfvormgenerator wordt uitgevoerd, wordt eerst versterkt en drijft vervolgens piëzo-elektrisch keramiek aan om controleerbare vervorming te genereren. Het mondstuk dat op het piëzo-elektrische keramiek is bevestigd, produceert dus controleerbare trillingen.</li>
	<li>Steriliseer het printsysteem door 's nachts af te vegen met 75% (v/v) alcohol en ultraviolette (UV) blootstelling.</li>
	<li>Laad 5 ml bioink (stap 3.1) in een steriele wegwerpspuit. Installeer de spuit op de spuitpomp.</li>
	<li>Sluit de spuit (stap 4.3) en het mondstuk (stap 2.5) aan op een siliconenslang met een binnendiameter van 1 mm.</li>
	<li>Bevestig het voor het afdrukken te gebruiken mondstuk (stap 4.4) door de dichtheid van de klemschroef aan te passen. Houd de punt van het mondstuk tijdens de installatie uit de buurt van het substraat om schade en verontreiniging te voorkomen. LET OP: Als het mondstuk tijdens de installatie kapot is, draag dan dikkere handschoenen en ruim glasfragmenten en resten zorgvuldig op.</li>
	<li>Duw snel op de spuitpomp en laad de bioink (stap 4.3) in het mondstuk (stap 4.5). Stel het debiet in op 30 μL/min. Veeg het overtollige materiaal aan de punt af.</li>
	<li>Stel signaalgeneratorparameters in. Importeer zelfontworpen golfvorm met 500.000 bemonsteringspunten. Stel de bemonsteringsfrequentie en piek-tot-piekspanning (Vpp) in op respectievelijk 5 miljoen monsters/s en 10 V.</li>
	<li>Reinig dia's of petrischalen met gedeïoniseerd water. Plaats ze onder het mondstuk als afdruksubstraat.</li>
	<li>Stel het bewegingspad en de triggermodus van trillingen in als drop-on-demand.</li>
	<li>Print de druppels volgens de vooraf ontworpen patronen.</li>
</ol>5. Vorming van microdragers op basis van AVIFJ
<ol><li>Herhaal stap 4.1-4.4, behalve verander de bioink in 2% (w/v) alginaatoplossing (stap 3.4), alginaat-collageenoplossing (stap 3.8) of gemodificeerde HA-mierikswortelperoxidaseoplossing (stap 3.13).</li>
	<li>Los 3 g calciumchloride op in 100 ml steriel water om 3% (met v) calciumchlorideoplossing te verkrijgen. Nadat de oplossing volledig is opgelost, filtert u de oplossing door een polyethyleentereftalaatfiltermembraan van 0,45 μm.</li>
	<li>Voeg 5 ml crosslinking-oplossing (calciumchlorideoplossing of waterstofperoxideoplossing) toe aan een petrischaaltje. Plaats de petrischaal onder het mondstuk om als substraat te werken.</li>
	<li>Na het printen cross-link de microcarriers gedurende 3 min.</li>
	<li>Verzamel microcarrier suspensie in een centrifugebuis en verrijk microdragers door centrifugeren met 29 x g gedurende 3 minuten. Resuspend de microdragers in kweekmedia bij ongeveer 600 microdragers/ml.</li>
</ol>6. Inenting van cellen op het oppervlak van microdragers
<ol><li>Kleur A549-cellen met Cell Tracker Green CMFDA om de observatie van cellen te vergemakkelijken. Verwijder specifiek kweekmedia, voeg 5 ml serumvrij medium toe met 10 μM Cell Tracker-kleurstof en incubeer cellen gedurende 30 minuten in een incubator. Vervang vervolgens de verfoplossing door vers medium.</li>
	<li>Resuspend de A549-celsuspensie met een dichtheid van 1,6 x 106 cellen / ml.</li>
	<li>Voeg 1 ml alginaat-collageen microcarrier suspensie (stap 5.3) en 1 ml A549-celsuspensie (stap 6.1) toe aan een laagklevende 6-well kweekplaat.</li>
	<li>Plaats de plaat op een shaker bij 30 rpm in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Haal de plaat van de shaker en wacht 30 minuten om de microdragers te laten bezinken. De helft verandert het kweekmedium om de 2 dagen.</li>
</ol>7. Analyse van de vorming van microdruppels/microdragers
<ol><li>Observeer en meet het mondstuk (stap 2.2), de petrischalen (stap 4.10 en stap 5.4) en cellen met microdragers (stap 6.5) onder een heldere veldmicroscoop of confocale microscoop. Concreet is de objectieve vergroting 4x, 10x of 20x en de oculairvergroting is 10x.</li>
	<li>Meet de diameter van de microdragers met de ImageJ-software. Volgens de schaalbalk die bij de microscoop wordt geleverd bij het fotograferen, stelt u de werkelijke grootte van de schaal in ImageJ in en tekent u 10 lijnen van de straal of semi-grote as van de microdragers. ImageJ kan de gemiddelde grootte en standaarddeviatie van deze lijnsegmenten krijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+mesenchymal+and+pluripotent+stem+cell+microcarrier+cultures+in+cellular+therapy%3A+Achievements+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Advances%22%5BJournal%5D)">Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction.</a> Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present%2C+and+future+of+microcarrier-based+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).</li>
<li>Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier-based+platforms+for+in+vitro+expansion+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+bioreactor+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems.</a> Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).</li>
<li>de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+microcarrier-based+manufacturing+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells.</a> Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).</li>
<li>Naqvi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+cell+factories+-+electrosprayed+microcapsules+and+microcarriers+for+minimally+invasive+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Living cell factories - electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery.</a> Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+A+promising+therapeutic+agent+and+effective+drug+delivery+system+in+managing+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus.</a> Carbohydrate Polymers. 247, (2020).</li>
<li>Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+microsphere+for+cartilage+tissue+engineering%3A+current+and+future+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies.</a> Polymers. 12, (2020).</li>
<li>Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymer-based+microcarriers+for+three-dimensional+cell+culture+and+engineered+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).</li>
<li>Isiklan, N., Tokmak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+thermo%2FpH-responsive+chitosan+coated+pectin-graft-poly%28N%2C+N-diethyl+acrylamide%29+microcarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers.</a> Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).</li>
<li>Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+delivery+with+genipin+crosslinked+gelatin+microspheres+in+hydrogel%2Fmicrocarrier+composite%5BTitle%5D)+AND+%22Composites+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite.</a> Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).</li>
<li>Lau, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-microcarrier+composite+systems+for+cell+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).</li>
<li>Kwon, Y. J., Peng, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-alginate+gel+bead+cross-linked+with+gelatin+as+microcarrier+for+anchorage-dependent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture.</a> Biotechniques. 33, 218(2002).</li>
<li>Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocrosslinked+hyaluronic+acid+hydrogels%3A+natural%2C+biodegradable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).</li>
<li>Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+biodegradable+hydrogels+composed+of+hyaluronic+acid-tyramine+conjugates+for+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering.</a> Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).</li>
<li>Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+in+vivo+angiogenesis+directed+by+electro-assisted+bioprinting+of+alginate%2Fcollagen+microspheres+with+human+umbilical+vein+endothelial+cell+coating+layer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer.</a> International Journal of Bioprinting. 5, 194(2019).</li>
<li>Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+alginate-collagen+polymer+network+microspheres+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering.</a> Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).</li>
<li>Aftab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+encapsulation+of+plant+extract+in+chitosan+microcarriers+embedding+silver+nanoparticles+for+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Nanoscience%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells.</a> Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).</li>
<li>Park, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li>
<li>Chui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrosprayed+genipin+cross-linked+alginate-chitosan+microcarriers+for+ex+vivo+expansion+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).</li>
<li>Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+production+of+uniform+microcarriers+with+multicompartments+through+phase+separation+in+emulsion+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops.</a> Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).</li>
<li>Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-printed+microcarrier+for+in+vitro+expansion+of+adherent+stem+cells+in+3D+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform.</a> Macromolecular Bioscience. 19, (2019).</li>
<li>Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Production+of+Single-Cell+Microparticles+Using+an+Inkjet+Printing+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Manufacturing+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology.</a> Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).</li>
<li>Rao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+enrichment+of+prostate+cancer+stem-like+cells+with+miniaturized+3D+culture+in+liquid+core-hydrogel+shell+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules.</a> Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).</li>
<li>Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+formation+of+controllable+complex+emulsions%3A+From+functional+particles+to+simultaneous+encapsulation+of+hydrophilic+and+hydrophobic+agents+into+desired+position%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position.</a> Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).</li>
<li>Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+engineering+microparticles+and+their+nascent+utilization+in+biomedical+delivery+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+On+A+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications.</a> Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).</li>
<li>Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+cell+printing+system+for+the+construction+of+heterogeneous+tissue+models%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models.</a> Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).</li>
<li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials%3A+a+review+of+current+research+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22NANOSCALE%22%5BJournal%5D)">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li>
<li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol geeft instructies voor de bereiding van multi-types hydrogel microcarriers en daaropvolgende celzaaien. In vergelijking met microfluïdische chip- en inkjetprintmethoden biedt de AVIFJ-benadering voor het bouwen van microdragers meer flexibiliteit en biocompatibiliteit. Een onafhankelijk mondstuk maakt het mogelijk om een breed scala aan lichtgewicht nozzles, waaronder glazen micropipettes, te gebruiken in deze printsystemen. De zeer controleerbare verwerking maakt het mogelijk om parameters z...

Microdragers zijn kralen met een diameter van 60-250 μm en een groot specifiek oppervlak en worden vaak gebruikt voor grootschalige kweek van cellen1,2. Hun buitenoppervlak biedt overvloedige groeiplaatsen voor cellen en het binnenste biedt een ondersteunende structuur voor ruimtelijke proliferatie. De bolvormige structuur biedt ook gemak bij het bewaken en regelen van parameters, waaronder pH, O2 en concentratie van voedingsstoffen en metabolieten. Bij gebruik in combinatie met bioreactoren met geroerde tanks kunnen microdragers hogere celdichtheden bereiken in een relatief klein volume in vergelijking met conventionele culturen, waardoor een kosteneffectieve manier wordt geboden om grootschalige culturen te bereiken3. Microcarrier-cultuurtechnologie is een van de belangrijkste technieken in cytologisch onderzoek geworden en er is veel vooruitgang geboekt op het gebied van grootschalige uitbreiding van stamcellen, hepatocyten, chondrocyten, fibroblasten en andere structuren4. Ze zijn ook ideale voertuigen voor medicijnafgifte en bottom-upeenheden gebleken, waardoor ze een steeds belangrijkere rol spelen bij klinische geneesmiddelenscreening en in vitro weefselmanipulatie5.
Om te voldoen aan de mechanische eigenschapseisen in verschillende scenario's, zijn meerdere soorten hydrogelmaterialen ontwikkeld voor gebruik bij de constructie van microdragers6,7,8,9,10,11. Hydrogels voor alginaat en hyaluronzuur (HA) zijn twee van de meest gebruikte microcarriermaterialen vanwege hun goede biocompatibiliteit en crosslinkbaarheid12,13. Alginaat kan gemakkelijk worden verknoopt door calciumchloride en de mechanische eigenschappen kunnen worden gemoduleerd door de cross-linking tijd te veranderen. Tyramine-geconjugeerde HA is verknoopt door de oxidatieve koppeling van tyraminemoieties gekatalyseerd door waterstofperoxide en mierikswortelperoxidase14. Collageen, vanwege zijn unieke spiraalstructuur en verknoopt vezelnetwerk, wordt vaak gebruikt als een adjuvans om zich in de microdragers te mengen om celaanhechting verder te bevorderen15,16.
Huidige methoden voor het voorbereiden van microdragers omvatten microfluïdische chips, inkjetprinten en elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Het is bewezen dat microfluïdische chips snel en efficiënt zijn in het produceren van microdragers van uniforme grootte24. Deze technologie is echter afhankelijk van een complex ontwerp- en fabricageproces van stroomkanalen25. Hoge temperatuur of overmatige extrusiekrachten tijdens inkjetprinten, evenals intense elektrische velden in de elektrospraybenadering, kunnen de eigenschappen van het materiaal, met name de biologische activiteit ervan, nadelig beïnvloeden19. Bovendien, wanneer toegepast op verschillende biomaterialen en diameters, resulteren de aangepaste nozzles die in deze methoden worden gebruikt in beperkte verwerkingscomplexiteit, hoge kosten en lage flexibiliteit.
Om een handige methode voor de voorbereiding van microcarriers te bieden, is een 3D-printtechniek genaamd alternating viscous-inertial forces jetting (AVIFJ) toegepast om hydrogel-microcarriers te bouwen. De techniek maakt gebruik van neerwaartse aandrijfkrachten en statische druk die wordt gegenereerd tijdens verticale trillingen om de oppervlaktespanning van de mondstukpunt te overwinnen en zo druppels te vormen. In plaats van zware krachten en thermische omstandigheden, werken kleine snelle verplaatsingen direct op het mondstuk tijdens het printen, waardoor een klein effect op de fysisch-chemische eigenschappen van de bioink wordt veroorzaakt en een grote aantrekkingskracht wordt uitgeoefend op bioactieve materialen. Met behulp van de AVIFJ-methode werden met succes microdragers van meerdere biomaterialen met diameters van 100-300 μm gevormd. Bovendien is verder bewezen dat de microdragers cellen goed binden en een geschikte groeiomgeving bieden voor gehechte cellen.

<table><tbody><tr><td>A549 cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>Humane niet-kleincellige longkankercellijn</td></tr><tr><td>Lichtveldmicroscoop</td><td>Olympus</td><td>DP70</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td>TI-FL</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum, FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glazen micropipetten</td><td>sutter instrument</td><td>b150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>H-DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11960-044</td><td>Dulbecco's gemodificeerd arendsmedium</td></tr><tr><td>Meel van mierikswortelperoxidase</td><td>SIGMA</td><td>P6782</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobe agent</td><td>3M</td><td>PN7026</td><td>Volg de instructies van de fabrikant en gebruik na verdunning</td></tr><tr><td>Micro-smeedapparaat</td><td>narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren, NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-050</td><td>niet-essentiële aminozuren</td></tr><tr><td>Penicilline G en streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>SIGMA</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Puller</td><td>sutter instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumalginaat</td><td>SIGMA</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>GIBCO</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Type I collageenoplossing uit rattenstaart</td><td>SIGMA</td><td>C3867</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-printen van in vitro hydrogel microdragers door afwisselend viskeuze-traagheidskracht jetting

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microdragers zijn kralen met een diameter van 60-250 μm en een groot specifiek oppervlak, die vaak worden gebruikt als dragers voor grootschalige celculturen. Microcarrier-cultuurtechnologie is uitgegroeid tot een van de belangrijkste technieken in cytologisch onderzoek en wordt vaak gebruikt op het gebied van grootschalige celexpansie. Van microdragers is ook aangetoond dat ze een steeds belangrijkere rol spelen bij de bouw van in vitro weefselmanipulatie en klinische screening van geneesmiddelen. Huidige methoden voor het voorbereiden van microcarriers omvatten microfluïdische chips en inkjetprinten, die vaak afhankelijk zijn van een complex stroomkanaalontwerp, een incompatibele tweefasige interface en een vaste nozzle-vorm. Deze methoden worden geconfronteerd met de uitdagingen van complexe nozzleverwerking, ongemakkelijke nozzle-veranderingen en overmatige extrusiekrachten wanneer toegepast op meerdere bioink. In deze studie werd een 3D-printtechniek, alternating viscous-inertial force jetting genoemd, toegepast om de constructie van hydrogel microcarriers met een diameter van 100-300 μm mogelijk te maken. Cellen werden vervolgens gezaaid op microdragers om tissue engineering modules te vormen. In vergelijking met bestaande methoden biedt deze methode een vrije diameter van de spuitmondpunt, flexibele nozzle-omschakeling, vrije controle van afdrukparameters en milde afdrukomstandigheden voor een breed scala aan bioactieve materialen.

Printkoppen met verschillende convergentiesnelheden en diameters werden vervaardigd om het afdrukken van meerdere soorten materialen te bereiken. De nozzles verkregen met toenemende trekkracht zijn weergegeven in figuur 1B. De nozzles waren verdeeld in drie gebieden: reservoir (III), contractie (II) en printkop (I). Het reservoir was het onbewerkte deel van het mondstuk, waarin de vloeistof statische druk en bioink-input leverde voor het afdrukken. Het krimpgebied was het belangrijkste onder...

Hier wordt een milde 3D-printtechniek gepresenteerd die wordt aangedreven door afwisselend viskeuze-traagheidskrachten om de constructie van hydrogel-microdragers mogelijk te maken. Zelfgemaakte nozzles bieden flexibiliteit, waardoor eenvoudige vervanging voor verschillende materialen en diameters mogelijk is. Celbindende microdragers met een diameter van 50-500 μm kunnen worden verkregen en verzameld voor verdere kweek.

3D-printen van in vitro hydrogel microdragers door afwisselend viskeuze-traagheidskracht jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Wij bieden een mild biogeprint proces voor het bereiden van microdragers met een goede beheersbaarheid en biocompatibiliteit. Na inkapseling door cellen kunnen de dragers ook worden gebruikt in in vitro celexpansie en functionele microtissueconstructie. Beperkte verplaatsing, in plaats van zware krachten onder vergelijkbare omstandigheden, werken tijdens het printproces op het mondstuk, waarbij de oorspronkelijke fysische / chemische eigenschappen van de bio-inkt maximaal behouden blijven.Naast conventionele microdragers kunnen eenheden met interne celverdeling of tritosine-ingekapselde capsulestructuren worden geconstrueerd en toegepast op de assemblage van verschillende weefselstructuren. Voor de voorbereiding van het mondstuk laadt u glazen micropipettes op de trekker volgens de instructies van de fabrikant en stelt u de trekparameters voor de trekker in. Gebruik een microforge om het mondstuk met de aangegeven diameter af te snijden om de specifieke tipdiameter voor het experiment te verkrijgen en steriliseer het mondstuk gedurende vijf minuten in alcohol.Spoel vervolgens het mondstuk drie keer af met steriel water om eventuele resterende alcohol te verwijderen. Om de hydrogel bio-inkt te bereiden, verdun gesteriliseerde 4% natriumalginaat stock oplossing in 0,9% natriumchloride bij 0,5, 1, 1,5 en 2% gewicht-per-volume concentraties. Voor microdruppelvorming laadt u vijf milliliter bio-inkt in een steriele wegwerpspuit en installeert u de spuit op een spuitpomp.Sluit met behulp van een slang met een binnendiameter van één millimeter de spuit en het printmondstuk aan. Draai de klemschroef vast om het mondstuk op zijn plaats te houden en druk de spuitpomp snel in om de bio-inkt in het mondstuk te laden. Stel de parameters van de signaalgenerator in en stel het bewegingspad en de triggermodus van de trilling in om op aanvraag te laten vallen.Print vervolgens de druppels volgens de vooraf ontworpen patronen. Voeg voor de vorming van microcarriers vijf milliliter crosslinking-oplossing toe aan een petrischaal en plaats de schaal onder het drukmondstuk als substraat. Na het printen verknoopt u de microdragers gedurende drie minuten voordat u de microcarrier-suspensie overbrengt naar een centrifugebuis.Verrijk vervolgens de microdragers door centrifugatie en resuspendatie in een geschikt kweekmedium met ongeveer 600 microdragers per milliliter. Vervang vóór hun inenting het supernatant van een A549-celcultuur door vijf milliliter serumvrij medium aangevuld met 10-micromolaire celtracker groene CMFDA-kleurstof voor een incubatie van 30 minuten in de celkweekincubator. Vervang aan het einde van de incubatie de kleurstofoplossing door vers medium en resuspend de cellen met een dichtheid van 1,6 maal 10 tot de zes cellen per milliliter medium.Voeg een milliliter microcarrier-suspensie toe aan de cellen en een milliliter A549-cellen aan elke put van een laagaanhangende zes-well kweekplaat. Plaats de plaat op een shaker in de celkweekincubator met 30 omwentelingen per minuut. Verwijder aan het einde van de incubatie de plaat uit de shaker en laat de microdragers gedurende 30 minuten bezinken voordat ze het drukmondstuk, petrischalen en microcarrier-geënte cellen observeren en meten door middel van bright-field en confocale fluorescentiemicroscopie.Met behulp van een mondstuk met een tip van 30 micrometer kunnen meerdere soorten bio-inkt, waaronder PBS, 1,5% alginaat en 1,5% gelatine, stabiel op petrischalen worden afgedrukt. Naarmate de viscositeit van de inkten toeneemt, wordt het drukproces steeds moeilijker en zijn er grotere drijvende krachten nodig om grotere druppels te verkrijgen. De afdrukparameters kunnen worden ingesteld om de druppels in specifieke 2D-opstellingen te printen, zoals waargenomen in dit afdrukexperiment.De diameter van de spuitmondpunt heeft een directe invloed op de grootte van de microdrager die kan worden afgedrukt. Zoals waargenomen in deze heldere veld- en confocale afbeeldingen, hechten A549-cellen zich na twee dagen cultuur aan de microdragers van alginaat-collageen. Na zes dagen bedekken de A549-cellen de microcarrieroppervlakken bijna volledig.Na deze procedure hebben we het microcarrieroppervlak gecoat met chitosan en gluconaat gebruikt om de alginaatgel op te lossen om een cystische structuur te vormen die kan worden toegepast om holle structuren zoals longblaasjes te construeren. Het afdrukproces voor het voorbereiden van microdragers is vrij zacht, dus deze methode kan op grote schaal worden gebruikt voor het afdrukken van celbevattende microdragers.

3d-printing-vitro-hydrogel-microcarriers-alternating-viscous-inertial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Driedimensionale (3D) microstructured samengestelde liggers zijn gefabriceerd door middel van de gerichte en lokale infiltratie van nanocomposieten in 3D poreuze microfluïdische netwerken. De flexibiliteit van deze produktiemethode maakt het gebruik van verschillende thermohardende materialen en vulstof teneinde verschillende functionele 3D versterkte nanocomposiet macroscopische producten te verbeteren.

Productie van drie-dimensionaal Microgestructureerde Nanocomposieten door Microfluidic Infiltratie

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Een additief productie-strategie voor de verwerking van UV-crosslinkable hydrogels heeft ontwikkeld. Deze strategie voorziet in de vergadering van de laag-voor-laag van de microfabricated hydrogel structuren, alsook de vergadering van onafhankelijke onderdelen, levert geïntegreerde apparaten met bewegende onderdelen die inspelen op de magnetische aandrijving.

Additief fabricage techniek voor de Facile en snelle fabricage van Hydrogel gebaseerde Micromachines met magnetisch responsieve onderdelen

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

Hier gepresenteerd is een methode voor de 3D bioprinten van gelatine methacryloyl.

Protocollen van 3D Bioprinting van gelatine Methacryloyl hydrogel gebaseerde Bioinks

Hier ontwikkelden we een nieuwe meerlaagse gemodificeerde strategie voor vloeibare bioinks (gelatine methacryloyl met lage viscositeit) om de sedimentatie van ingekapselde cellen te voorkomen.

Met behulp van meerlaagse Hydrogel Bioink in driedimensionale bioprinting voor homogene celdistributie

Ontworpen flappen vereisen een geïntegreerd functioneel vasculair netwerk. In dit protocol presenteren we een methode voor het fabriceren van een 3D-geprinte weefselflap met een hiërarchisch vasculair netwerk en de directe microchirurgische anastomosen naar de dijbeenslagader van ratten.

Fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3D-printtechnologieën

Afschuifverwerking tijdens hydrogelvorming resulteert in de productie van microgel-suspensies die dun scheren maar snel herstructureren na het verwijderen van schuifkrachten. Dergelijke materialen zijn gebruikt als een ondersteunende matrix voor het bioprinten van complexe, met cellen beladen structuren. Hier worden methoden beschreven die worden gebruikt om het ondersteunende bed en compatibele bioinks te vervaardigen.

Agarose vloeibare gels gevormd door afschuifverwerking tijdens gelation voor gesuspendeerde 3D-bioprinting

Dit werk beschrijft een protocol voor de vrije vorm ingebed 3D-printen van neurale stamcellen in zelfherstellende gloeibare deeltjes-extracellulaire matrixcomposieten. Het protocol maakt het mogelijk om met hoge getrouwheid patronen te maken van onderling verbonden menselijke neurale weefselconstructies.

Microgel-extracellulaire matrixcomposietondersteuning voor het ingebed 3D-printen van menselijke neurale constructies

Deze studie introduceert een nieuw κ-carrageen sub-microgel suspensiebad, dat opmerkelijke omkeerbare jamming-unjamming overgangseigenschappen vertoont. Deze eigenschappen dragen bij aan de opbouw van biomimetische weefsels en organen in ingebedde 3D-bioprinting. Het succesvol printen van hart-/slokdarmachtige weefsels met hoge resolutie en celgroei demonstreert hoogwaardige bioprinting- en tissue engineering-toepassingen.

Ingebedde bioprinting van weefselachtige structuren met behulp van κ-carrageen sub-microgelmedium

Leer een mild bioprintingproces voor hydrogel microdragers met uitstekende controleerbaarheid en biocompatibiliteit. Deze methode behoudt de oorspronkelijke eigenschappen van bio-inkt en ondersteunt celkapseling voor weefselopbouw.

3D-printen van in vitro hydrogel microdragers door afwisselend viskeuze-traagheidskracht jetting

Meer video's verkennen