Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Scipion biedt de tools om de hele verwerkingsworkflow op een integratieve manier te creëren voor een enkele deeltjesanalyse in cryo-EM om een hoge resolutie reconstructie van het biologische monster te bereiken. Dit raamwerk maakt het mogelijk om de verwerkingsworkflow te creëren met behulp van verschillende beeldverwerkingspakketten, waarbij interoperabiliteit, traceerbaarheid, reproduceerbaarheid en de combinatie van informatie die door verschillende methoden wordt overgebracht, worden bevorderd om een nauwkeurigere uitvoer te genereren. Scipion groeit voortdurend, inclusief nieuwe methoden en pakketten.

Bovendien is het uitgebreid naar cryo-elektronentomografie en atomaire modellering, waardoor ook workflows kunnen worden gemaakt om deze gegevens te verwerken. Als u een project wilt maken in Scipion, klikt u op Project maken om het project te maken. Als u de microscoopfilms wilt importeren, selecteert u Films importeren.

Er verschijnt een nieuw venster. Voer in dit venster het pad naar de gegevens in en stel de microscoopspanning in op 300 kilovolt, de sferische aberratie op twee millimeter, het amplitudecontrast op 0,1, de vergrotingssnelheid op 50.000, de bemonsteringsfrequentiemodus op Van afbeelding en de pixelgrootte op 1,34 angstroms. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, klikt u op Uitvoeren.

Wanneer de methode is voltooid, opent u het tabblad Samenvatting en klikt u op Resultaten analyseren. Er verschijnt een nieuw venster met een lijst met de uitvoer die door de methode wordt gegenereerd. Als u de optische stroommethode voor filmuitlijning wilt uitvoeren, opent u de optische uitlijningsmethode xmipp3 en selecteert u de geïmporteerde films als de invoerfilms en stelt u de frames in op ALIGN-bereik van 2 tot 13.

Stel onder Aanvullende parameters de optie Vorige filmuitlijning gebruiken om frames op TE GEVEN in op Nee.Laat alle andere opties ingesteld op hun standaardwaarden en voer het programma uit. Klik op Resultaten analyseren om de verkregen microfoto's en het traject van de geschatte verschuivingen te controleren. Voor elke micrograaf is het mogelijk om de spectrale vermogensdichtheid, de trajecten die zijn verkregen om de film uit te lijnen in zowel de cartesische als de poolcoördinaten en de bestandsnaam van de verkregen micrograaf te controleren.

Merk op dat de deeltjes van het monster veel beter zichtbaar zijn in de micrograaf in vergelijking met een enkel frame van de film. Voor deeltjespluk opent u de xmipp3 handmatige pickingmethode en selecteert u de eerder verkregen micrografieën als de invoermicrografen. Klik op Uitvoeren.

Er verschijnt een nieuw interactief venster. Wijzig in dit venster de pixelgrootte in 150. De geselecteerde micrograaf verschijnt in een groter venster.

Kies alle zichtbare deeltjes binnen één regio. Wanneer alle deeltjes handmatig zijn geselecteerd, klikt u op Training activeren om het leren te starten. De overige gebieden van de micrograaf worden automatisch gekozen.

Controleer de geplukte deeltjes. Om een extra deeltje op te nemen, klikt u op een deeltje van belang. Als u onjuiste deeltjes wilt verwijderen, houdt u Shift ingedrukt en klikt u zo nodig op de deeltjes.

Wanneer alle deeltjes automatisch zijn geplukt, selecteert u de volgende vier microfoto's één voor één om een representatieve trainingsset te maken. De deeltjes in elke geselecteerde micrograaf worden automatisch geplukt, waarbij elke micrograaf wordt gecontroleerd om deeltjes op te nemen of te verwijderen als dat nodig is. Wanneer een trainingsset is verkregen, klikt u op Coördinaten om de coördinaten van alle geselecteerde deeltjes op te slaan.

Na het verkrijgen van de trainingsset, opent u xmipp3 auto-picking om de vorige handmatige picking in Xmipp particle picking run aan te geven en stelt u Micrographs in om te picken op Hetzelfde als onder toezicht. Klik op Uitvoeren om een set van ongeveer 100.000 coördinaten te genereren. Om de consensusbenadering toe te passen, opent u sphire cryolo picking en stelt u de voorbewerkte micrografieën als de invoermicrografen in het pickingmodel in op de standaardinstelling.

Stel de betrouwbaarheidsdrempel in op 0,3 en de doosgrootte op 150 en klik vervolgens op Uitvoeren. De methode moet ook ongeveer 100.000 coördinaten genereren. Open vervolgens xmipp3 diepe consensuspicking en stel de invoercoördinaten in om de uitvoer van de sphire cryolo en xmipp3 auto-picking, het selecte modeltype naar voorgetraind en de overslaan van training en score direct met voorgetraind model op te nemen naar Ja en klik vervolgens op Uitvoeren.

Klik aan het einde van de uitvoering op Resultaten analyseren. Klik in het nieuwe venster op het oogpictogram. Er wordt een tweede nieuw venster geopend met een lijst van alle deeltjes.

De Z-score waarden in de kolom geven inzicht in de kwaliteit van elk deeltje, omdat een lage waarde duidt op een slechte kwaliteit. Om de deeltjes van de hoogste naar de laagste Z-score te ordenen, klikt u op Xmipp Z-score deep learning en selecteert u de deeltjes met een Z-score hoger dan 0,75. Klik vervolgens op Coördinaten om een nieuwe subset te maken met ongeveer 50.000 coördinaten.

Om de resolutie lokaal te berekenen, opent u xmipp3 local MonoRes en stelt u het invoervolume in op de uitvoer van de laatste verfijningsstap, de optie Wilt u halve volumes gebruiken voor Ja en het resolutiebereik van 1 tot 10 angstroms. Wanneer de parameters zijn ingesteld, klikt u op Uitvoeren. Wanneer de resolutie is berekend, klikt u op Resultaten analyseren en selecteert u Histogram van resolutie weergeven en Gekleurde segmenten weergeven.

De resolutie in de verschillende delen van het volume wordt weergegeven. De meeste voxels van de centrale delen van de structuren zouden resoluties rond drie angstroms moeten vertegenwoordigen, terwijl de slechtste resoluties zullen worden waargenomen in de buitenste regio's van de structuren. Een histogram van de resoluties per voxel met een piek rond of onder drie angstroms zal ook worden getoond.

Als u een verscherping wilt toepassen, opent u xmipp3 localdeblur verscherping en selecteert u de uitvoer van de laatste verfijningsstap als Invoertoewijzing en stelt u de resolutietoewijzing in op de monores-toewijzing verkrijgen. Nadat de opdracht is uitgevoerd, dubbelklikt u op de set volumes die als uitvoer is gegenereerd op het tabblad Samenvatting. De volumes die in elke iteratie worden gegenereerd, kunnen worden gecontroleerd.

Het wordt ook aanbevolen om het volume te openen met andere hulpmiddelen, zoals UCSF Chimera, om de kenmerken van het volume beter in 3D te observeren. In deze figuur kan een Fourier-schelpcorrelatie van drie angstroms worden waargenomen, die zeer dicht bij de Nyquist-limiet ligt. Zoals geïllustreerd, vertonen de gereconstrueerde 3D-volumesegmenten een hoog detailniveau en goed gedefinieerde structuren.

Na lokale analyse bereiken de meeste centrale voxels een resolutie van minder dan drie angstroms. De buitenste gebieden van de lokale resolutiesegmenten vertonen echter een lagere resolutie, wat consistent is met de vervaging die binnen die gebieden wordt waargenomen. Na nabewerking kunnen de hogere frequenties van het 3D-kaartvolume worden waargenomen, waardoor meer details worden onthuld en de weergave wordt verbeterd.

Wanneer de bereikte resolutie hoog genoeg is, kunnen zelfs enkele van de biochemische delen van de structuur worden waargenomen. Als de verkregen structuur een lage resolutie heeft en niet kan worden ontwikkeld tot een betere, kan een wazig volume met een lage Fourier-schaalcorrelatie, resolutiecurve en histogram van de lokale schatting worden waargenomen. Na het plukken kan de 2D-classificatie worden gecontroleerd om de deeltjeskwaliteit te evalueren.

In deze classificatie zijn de deeltjes bijvoorbeeld luidruchtig, ongecentreerd of gekoppeld, wat aangeeft dat het plukken onjuist was. Een ander controlepunt kan worden uitgevoerd tijdens de eerste volumeschatting. In dit voorbeeld is een slechte schatting gemaakt met behulp van een onjuiste instelling voor de methode.

Zodra een 3D-kaart met een voldoende resolutie is geproduceerd, is de volgende stap het voorstellen van een atoommodel voor de kaart. Dit kan binnen Scipion met behulp van de modellering plugins. Deze techniek kan worden gebruikt om met succes biologische macromoleculen te reconstrueren voor evaluatie van hun moleculaire interacties en biologische ensemblefunctie als basis voor medicijnontwerp.